朱立祺，陳菲然，陶夢娜，劉瓔琳，趙曉麗，王震宇*

1. 江南大學環(huán)境與土木工程學院環(huán)境過程與污染控制研究所，江蘇 無錫 214122

2. 中國海洋大學環(huán)境科學與工程學院，山東 青島 266000

3. 中國環(huán)境科學研究院，環(huán)境基準與風險評估國家重點實驗室，北京 100012

近年來，由于氣候變暖、化肥農(nóng)藥濫用以及不合理灌溉等因素導致土地鹽漬化加劇，全球超過1.0×107km2的土地受到鹽分的影響，且大半的灌溉土地受到不同程度土壤鹽漬化的影響，進一步導致農(nóng)作物產(chǎn)量降低[1-3]. 根據(jù)聯(lián)合國人口活動基金的報告，到2050年全球人口將增至93億，這意味著人類對糧食的需求將極大增加[4-5]. 鹽脅迫主要通過滲透作用和離子作用影響植物生長發(fā)育. 滲透作用主要導致植物水分吸收減少，細胞生長減緩等；離子作用則主要體現(xiàn)在細胞內(nèi)Na+、Cl-等有毒離子的過度累積對植物造成的毒性作用[6]. 其中，過量Na+累積而造成的離子毒性被認為是主導因素，因為Na+可取代K+在許多細胞酶促反應中的作用，如卡爾文循環(huán)、糖酵解和苯丙烷途徑等，并大幅降低這些酶的活性[7]. 因此，尋找提高植物耐鹽性的方法迫在眉睫.

傳統(tǒng)的農(nóng)藥和化肥在提高糧食產(chǎn)量的同時，對人類與生態(tài)環(huán)境的安全存在一定威脅，而新型農(nóng)業(yè)技術(shù)如轉(zhuǎn)基因作物還未受到公眾廣泛的認可[8]. 近年來，納米材料(NMs)因其高效、緩釋等特點在農(nóng)業(yè)增產(chǎn)和環(huán)境修復中的應用已嶄露頭角[9-10]. 已有研究[11]表明，NMs可以顯著提高植物耐鹽性并促進植物生長及提高作物產(chǎn)量. 然而，目前關(guān)于NMs增強植物耐鹽性的分子機制研究仍較少，深入研究NMs刺激下的植物耐鹽機理將有助于進一步拓展納米農(nóng)業(yè)的應用，最終可持續(xù)地增加糧食產(chǎn)量[4].

NMs是指在三維尺度中任意一個尺度小于100 nm的材料，其具備獨特的物理化學性質(zhì)，能以不同的方式與生物體相互作用[12]. 有研究[13-15]表明，一些NMs可進入植物組織內(nèi)部，增強植物的新陳代謝活動，并增強植物抗逆性，如今越來越多的NMs逐漸被應用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中提高作物產(chǎn)量并增強抗性. 納米二氧化鈦(nTiO2)和納米硒(nSe)具有增強植物耐鹽能力的作用，如Hojjat等[16]發(fā)現(xiàn)，20 mg/L的nTiO2可以減輕鹽脅迫對豌豆種子萌發(fā)和幼苗早期生長發(fā)育過程中的不利影響. 此外，nTiO2還可促進鹽脅迫下大麥植株的生長和光合性能[17]. Zahedi等[18]研究發(fā)現(xiàn)，葉面噴施nSe可以提高草莓在鹽脅迫環(huán)境下的產(chǎn)量，并且在改善果實品質(zhì)方面具有積極作用. Soleymanzadeh等[19]發(fā)現(xiàn)，10 μmol/L的nSe可以通過調(diào)節(jié)離子穩(wěn)態(tài)、提高光合效率和增強抗氧化能力來緩解草莓受到的鹽脅迫. 施用nSe不僅有利于增強番茄耐鹽性，還有助于增加番茄果實中有益物質(zhì)的含量[20]. 總之，NMs對植物耐鹽的提升作用主要歸結(jié)于維持離子穩(wěn)態(tài)、促進光合作用和增強抗氧化能力這三方面機制. 已有研究[3,18,21-22]從基因、蛋白水平對以上機制進行了深入挖掘，然而在代謝水平的分析還較為欠缺. 小分子量的代謝物作為基因表達的最終產(chǎn)物，其變化可有效體現(xiàn)生物活性的變化[23]. 代謝組可全面監(jiān)測代謝途徑的全過程，包括前體、中間體和產(chǎn)物，從生物學活動的末端小分子化合物角度闡明植物生理生化過程. 因此，代謝組在研究脅迫環(huán)境下植物的行為變化方面具有不可忽視的作用[24].

煙草(Nicotiana tabacumL.)BY-2懸浮細胞作為一種模式植物細胞，具有繁殖迅速、同質(zhì)性好等優(yōu)點[25]. 許多研究利用懸浮細胞作為模型研究逆境中植物的響應機制，已有研究將煙草BY-2懸浮細胞作為探索植物耐鹽機理的工具. 研究[26-27]表明，適應鹽脅迫的煙草BY-2懸浮細胞中阿拉伯半乳糖蛋白的含量增加，該蛋白是一種鈉載體. Wang等[28]研究發(fā)現(xiàn)，在煙草BY-2懸浮細胞中過表達PeTPK1基因提高了煙草的鹽耐受性. 另有研究[29]指出，植物體內(nèi)的代謝產(chǎn)物如氨基酸、糖類、有機酸和脂肪酸等物質(zhì)的積累與植物的耐鹽性密切相關(guān). 因此，該研究以煙草 BY-2懸浮細胞為供試材料，采用非損傷微測系統(tǒng)(NMT)原位實時檢測Na+的凈流速，研究鹽脅迫下施加NMs對細胞Na+外排能力的影響，精確反映NMs對細胞外排Na+的調(diào)控作用[30]；同時，利用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS/MS)技術(shù)分析鹽脅迫下煙草BY-2懸浮細胞暴露于NMs后的代謝變化，探討代謝水平變化與NMs介導的耐鹽性關(guān)系，從代謝組的角度揭示NMs提升植物耐鹽性的機理，以期為廣泛應用納米農(nóng)業(yè)技術(shù)提高植物耐鹽性提供理論基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為煙草BY-2懸浮細胞，由山東農(nóng)業(yè)大學生命科學學院提供. nSe (約70 nm)通過室溫固相反應合成，將SeO2和抗壞血酸按物質(zhì)的量1∶2放入研缽，并加入1/10總質(zhì)量的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，研磨至紅色糊狀，干燥，獲得nSe[31]. nTiO2(<25 nm)購自美國Sigma-Aldrich公司.

1.2 試驗設(shè)計

將煙草BY-2懸浮細胞接種于MS培養(yǎng)基中，在避光、25 ℃、130 r/min條件下培養(yǎng). 初始接種量為40 g/L，培養(yǎng)7~10 d進入對數(shù)生長期后進行試驗. 在進行NMs暴露試驗前，先將對數(shù)生長期細胞分別轉(zhuǎn)移至1/2 MS培養(yǎng)基和含有100 mmol/L NaCl的1/2 MS培養(yǎng)基中適應24 h. 將1/2 MS培養(yǎng)基中適應24 h的細胞作為對照組(CK)，將含有100 mmol/L NaCl的1/2 MS培養(yǎng)基中適應24 h的細胞作為鹽脅迫處理組(S)，將在含有100 mmol/L NaCl的1/2 MS培養(yǎng)基中適應24 h后分別暴露0.05、0.1、0.5 mg/L的nTiO2或nSe的細胞作為鹽脅迫下NMs處理組(S-nTiO2或S-nSe). NMs對植物的生長具有低促高抑的效應，研究[32-34]表明，小于10 mg/L的NMs會對植物細胞產(chǎn)生毒害作用. 預試驗發(fā)現(xiàn)，5和10 mg/L的nTiO2和nSe均會對細胞活性產(chǎn)生抑制作用，因此該研究設(shè)置0.05、0.1、0.5 mg/L作為暴露濃度. 細胞暴露于NMs的同時，向CK和S處理組分別加入等體積的無菌水，經(jīng)2、4、6、12、24、48、72 h后取樣測定細胞活性. 細胞活性試驗各處理組設(shè)置3個生物學重復，細胞表面Na+流速測定試驗和代謝組試驗中各處理組設(shè)置8個生物學重復.

1.3 試驗方法

1.3.1 細胞活性測定

每種NMs設(shè)置3個暴露濃度(0.05、0.1、0.5 mg/L)，在每個取樣時間點(2、4、6、12、24、48、72 h)取1 mL細胞懸液于1.5 mL離心管中，自然沉降10 min.用針頭注射器小心吸取去除上清液，用0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液(PBS, pH=7.2)洗滌細胞3次. 去除上清液后加入1 mL 0.3%氯化三苯四氮唑(TTC)溶液(溶劑為0.05 mmol/L PBS, pH=7.2)，25 ℃避光孵育8 h后，6 000 r/min離心，去除上清液，加入1 mL 95%乙醇，60 ℃水浴加熱15 min，細胞基本呈發(fā)白狀，6 000 r/min離心5 min. 吸取200 μL上清液至酶標板，用酶標儀(Varioskan LuX型, 美國Thermo公司)在485 nm下測定吸光度，以每個時間點的CK為基準進行歸一化處理計算細胞活性[35].

1.3.2 NMT原位測定Na+凈流速

利用NMT〔NMT-100S-SIM-XY型, 旭月(北京)科技有限公司〕測定Na+流速. 采用尖端直徑為4~5 μm的傳感器，于頂端填充250 mmol/L NaCl (長度約1 cm)，并通過傳感器制備裝置于尖端吸取約50 μm的Na+專用LIX試劑，以0.5和5 mmol/L Na+進行校正，保持能斯特斜率在58±5范圍內(nèi)方可開始測試. 在相應時間點取1 mL細胞懸液加到特制蓋玻片上(在小型35 mm塑料培養(yǎng)皿中)，固定10 min后移除培養(yǎng)基及未固定細胞，加入5 mL測試液(測試液成分為1 mmol/L NaCl、0.1%蔗糖，pH=5.3)穩(wěn)定10 min，更換新的測試液(5 mL)后準備測試樣品. 將傳感器靠近細胞壁距離細胞核最近的位置，距細胞壁表面約1~2 μm，步進設(shè)置為20 μm.

1.3.3 代謝產(chǎn)物提取與鑒定

取各處理組煙草BY-2懸浮細胞樣品各20 mg，經(jīng)液氮速凍并研磨成粉狀，加入1 mL提取液(80%甲醇水溶液，含0.1%甲酸和內(nèi)標)渦旋混勻，冰浴超聲(35 kHz) 30 min；隨后于4 ℃、12 000 r/min離心15 min，取700 μL上清液旋干，用100 μL甲醇、乙腈、水(體積比為4∶4∶2)復溶，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清進樣分析，并確保樣品中無雜質(zhì)及氣泡.各樣品取等體積作為質(zhì)量控制(QC)，每8個樣品設(shè)置一個QC.

采用Acquity HSS T3色譜柱(內(nèi)徑2.1 mm, 長度100 mm, 填料內(nèi)徑1.8 μm)和Agilent Hilic Poroshell 120色譜柱(內(nèi)徑2.1 mm, 長度100 mm, 填料內(nèi)徑2.7 μm)進行分離，利用LC-MS/MS對樣品中的代謝物進行檢測(Q-Exactive質(zhì)譜儀，美國Thermo公司). T3色譜柱液相洗脫液為流動相A1 (0.1%甲酸水溶液)和流動相B1 (0.1%甲酸乙腈溶液)，洗脫時間共18 min，其中0~1.5 min用5% B1洗脫，1.5~15.5 min B1由5%線性增至100%，15.5~16 min B1由100%線性降至5%，16~18 min再用5% B1進行平衡. Hilic色譜柱液相洗脫液為流動相A2 (0.1%甲酸水溶液和5 mmol/L乙酸銨)和流動相B2 (0.05%甲酸溶于95%乙腈溶液和5 mmol/L乙酸銨)，洗脫時間共15 min，其中0~7 min B2由98%線性降至75%，7~10 min B2由75%線性降至10%，10~13 min用10% B2平衡，13~13.5 min B2由10%線性增至98%，13.5~15 min再用98% B2平衡. 流速均為0.35 mL/min，進樣量為5 μL. ESI源參數(shù)設(shè)定：鞘氣流速35 L/min；保護氣流速15 L/min；毛細管溫度320 ℃；保護氣加熱器溫度350 ℃；噴霧電壓分別為3.5 kV(+)和?3.0 kV(?).

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用單因素方差分析(ANOVA)和最小顯著性差異(LSD)檢驗確定處理之間的差異顯著性，NMT離子流速數(shù)據(jù)來自imFluxes V2.2軟件并通過旭月科技有限公司流速云平臺進行處理，數(shù)據(jù)表示為Mean±SEM，代謝組數(shù)據(jù)首先根據(jù)Compound Discoverer 3.1.0.305軟件篩選出可用代謝物，歸一化后根據(jù)相對標準偏差(RSD)≤50%再次篩選，根據(jù)代謝物名稱在HMDB數(shù)據(jù)庫找到其編號，舍去非內(nèi)源化合物，綜合各模式結(jié)果去除重復代謝物，獲得處理后文件. 使用Metaboanalyst 5.0軟件進行數(shù)據(jù)分析時，選擇Statistical Analysis，使用中位數(shù)標準化結(jié)合Pareto Scaling，獲得聚類分析和主成分分析結(jié)果并篩得差異代謝物，分別選擇Enrichment Analysis和Pathway Analysis進行富集分析和通路分析.

2 結(jié)果與討論

2.1 NMs對鹽脅迫下細胞活性的影響

不同濃度和時間NMs處理下煙草BY-2懸浮細胞的細胞活性如圖1所示. 由圖1可見，與CK相比，S處理組細胞活性明顯下降了34.3%±9.0%，而S-nTiO2(0.1 mg/L)處理組在6 h時細胞活性比S處理組顯著增加了8.1%，S-nSe (0.5 mg/L)處理組在12 h時細胞活性比S處理組顯著增加了13.6%. 因此，選取處理6 h的S-nTiO2(0.1 mg/L)處理組和12 h的S-nSe (0.5 mg/L)處理組開展后續(xù)試驗.

圖1 不同濃度nTiO2和nSe處理下BY-2懸浮細胞的活性Fig.1 Viability of BY-2 cell suspensions exposed to different concentrations of nTiO2 and nSe

2.2 NMs對鹽脅迫下煙草BY-2懸浮細胞Na+流速的影響

鹽脅迫下煙草BY-2懸浮細胞表面的凈Na+通量(外排)大幅增加，這可能是煙草BY-2懸浮細胞自身應對鹽脅迫的響應機制. 測定S-nTiO2(0.1 mg/L)處理組在6 h或S-nSe (0.5 mg/L)處理組在12 h時細胞表面的Na+流速(見圖2)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Na+外排進一步增加，鹽脅迫下細胞暴露于0.1 mg/L nTiO2(6 h)使Na+外排較S處理組顯著增強了171.5%，鹽脅迫下細胞暴露于0.5 mg/L nSe (12 h)使Na+外排較S處理組顯著增強了99.0%，增強的Na+外排可以減少Na+在煙草BY-2懸浮細胞體內(nèi)的累積和毒害作用. 研究[2]表明，細胞膜上的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白是主要的Na+外排離子通道，也是鹽過敏感(SOS)信號通路(將Na+從胞內(nèi)排除至胞外的主要機制)的重要組成.Chen等[36]通過NMT研究發(fā)現(xiàn)，Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白的高表達增強了植物向外分泌Na+的能力. 由此推測，nTiO2和nSe可能通過直接或間接增強Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白的活性和表達從而增強鹽脅迫下細胞外排Na+的能力.

圖2 NMs處理下BY-2懸浮細胞表面Na+流速變化Fig.2 Net Na+ flux on BY-2 cell suspensions surface after NMs exposure

2.3 NMs增強BY-2細胞耐鹽性的代謝水平機制

2.3.1 NMs處理下細胞代謝物的變化

CK、S和S-nTiO2(0.1 mg/L)等3個處理組一共檢測到128種代謝物，CK、S和S-nSe (0.5 mg/L)等3個處理組一共檢測到137種代謝物. 對這128種代謝物和137種代謝物進行稀疏偏最小二乘判別分析(見圖3)發(fā)現(xiàn)：經(jīng)兩種NMs處理后的代謝物組成與S處理組相比發(fā)生顯著變化，暴露于0.1 mg/L nTiO26 h后，第一主成分將CK處理組與其他處理組明顯分離，并代表樣品總變化量的21.3%；第二主成分將S處理組與S-nTiO2(0.1 mg/L)處理組明顯分離，并代表樣品總變化量的15.8%. 暴露于0.5 mg/L nSe 12 h后，代謝物組成也發(fā)生顯著變化，第一主成分將3個處理組明顯分離，并代表樣品總變化量的35.6%. 兩種NMs均對鹽脅迫下煙草BY-2懸浮細胞的代謝調(diào)控產(chǎn)生顯著影響，其中nSe導致的變化更明顯.

圖3 NMs處理后BY-2懸浮細胞所有代謝物的稀疏偏最小二乘判別分析Fig.3 Sparse partial least squares-discriminant analysis of all metabolites in BY-2 cell suspensions exposed to NMs

2.3.2 差異代謝物篩選及聚類分析

根據(jù)多元統(tǒng)計分析的正交偏最小二乘法分析(OPLS-DA)來研究0.1 mg/L nTiO2或0.5 mg/L nSe處理后與S處理組代謝物的差異，變量權(quán)重值(VIP)大于1的變量為差異變量，綜合考慮將單變量統(tǒng)計分析T檢驗下P值小于0.05的代謝物認定為差異代謝物[37].

CK、S和S-nTiO2(0.1 mg/L)等3個處理組共有53種差異代謝物，其中34種代謝物表達上調(diào)，19種代謝物表達下調(diào)，通過系統(tǒng)聚類分析發(fā)現(xiàn)這些差異代謝物可以分為兩大類，第一類主要有激素和部分氨基酸，第二類主要有脂肪酸、嘌呤和氨基酸，各處理組重復性較好，其中S-nTiO2(0.1 mg/L)處理組與CK聚為一類，S處理組單獨為一類(見圖4)，說明0.1 mg/L nTiO2處理6 h后煙草BY-2懸浮細胞的代謝狀態(tài)更趨近于CK處理組，表明nTiO2對鹽脅迫有緩解作用.

圖4 nTiO2處理導致BY-2懸浮細胞差異代謝物分層聚類熱圖Fig.4 Hierarchical clustering heatmaps of differential metabolites in BY-2 cell suspensions exposed to nTiO2

CK、S和S-nSe (0.5 mg/L)等3個處理組共有73種差異代謝物，其中33種種代謝物表達上調(diào)，40種代謝物表達下調(diào). 通過系統(tǒng)聚類分析發(fā)現(xiàn)，這些差異代謝物可以分為兩大類，第一類主要有嘌呤、脂肪酸和部分氨基酸，第二類主要有氨基酸和部分有機酸，CK和S處理組聚為一類，而S-nSe (0.5 mg/L)處理組則單獨為一類(見圖5)，說明nSe與nTiO2導致的耐鹽性機制不同，它們可能通過不同的代謝途徑增強細胞的耐鹽性.

圖5 nSe處理導致BY-2懸浮細胞差異代謝物分層聚類熱圖Fig.5 Hierarchical clustering heatmaps of differential metabolites in BY-2 cell suspensions exposed to nSe

2.3.3 NMs處理下的差異代謝物分析

對CK、S和S-nTiO2(0.1 mg/L)等3個處理組的53種差異代謝物進行富集分析發(fā)現(xiàn)，差異代謝物主要有氨基酸和肽(13種)、脂肪酸和共軛物(3種)、三羧酸循環(huán)(TCA cycle)有機酸(2種)、肉桂酸(2種)、胺類(2種)、有機二羧酸(2種)、吲哚(2種)、嘧啶(2種)、嘌呤(2種)、單糖(2種)、苯(2種)〔見圖6(a)〕.相比S處理組，S-nTiO2(0.1 mg/L)處理組中有5種氨基酸和肽的相對含量增加，包括甜菜堿(增加了2.92倍)、O-乙酰絲氨酸(增加了1.95倍)、N6-乙酰-左旋賴氨酸(增加了2.14倍)、甘氨酸(增加了1.40倍)和γ-氨基丁酸(增加了1.60倍). 氨基酸作為一種重要的代謝物質(zhì)，參與植物體內(nèi)的物質(zhì)和能量代謝，在植物面臨各種脅迫時產(chǎn)生不同程度的累積[38]. 其中，γ-氨基丁酸是一種非蛋白質(zhì)氨基酸，鹽脅迫下植物可通過增加γ-氨基丁酸的合成來清除自由基從而減少氧化脅迫，通過增加細胞內(nèi)的氮含量從而有效緩解鹽脅迫[39-40]. 脂肪酸和共軛物類物質(zhì)的相對含量均增加，包括甲戊酸(增加了1.58倍)、3-羥甲基戊二酸(增加了3.63倍)、脫硫生物素(增加了3.92倍)，這些物質(zhì)的增加可提高膜磷脂含量從而增強細胞膜完整性[41]. TCA cycle中重要的中間產(chǎn)物?順烏頭酸和富馬酸的相對含量也分別顯著增加了4.99和15.36倍，表明TCA cycle的加強. TCA cycle連接糖酵解和氨基酸生物合成，通過產(chǎn)生ATP和NADH對呼吸和能量生成過程起重要調(diào)節(jié)作用[42]. 胺類物質(zhì)中卟啉原和組氨醇的相對含量分別增加了2.57和0.20倍，在鹽脅迫條件下胺類物質(zhì)中多胺會大量累積，調(diào)節(jié)各種生理生化功能，包括生長發(fā)育、增殖衰老死亡和基因表達等，在抵御鹽脅迫方面起重要作用[38]. 鹽脅迫下植物會增加核苷酸類物質(zhì)的合成[43-44]，而0.1 mg/L nTiO2使得嘧啶(尿苷、5-甲基胞嘧啶的相對含量分別增加了1.62、0.87倍)和嘌呤(腺苷、黃嘌呤的相對含量分別增加了0.38、27.62倍)的相對含量均顯著增加. 單糖物質(zhì)〔如木糖(相對含量增加了1.73倍)和甘露糖(相對含量增加了3.17倍)〕的增加有助于維持細胞膜的穩(wěn)定性，同時起到保護蛋白質(zhì)的作用，緩解細胞受到的脅迫[38]. 通過差異代謝物通路分析(P≤0.05，通路影響值≥0.1)篩選得到2條差異代謝通路，分別為精氨酸生物合成以及精氨酸和脯氨酸代謝〔見圖6(c)〕.

圖6 差異代謝物富集分析和通路分析Fig.6 Cluster analysis and enrichment analysis of differential metabolites

對CK、S和S-nSe (0.5 mg/L)等3個處理組的73種差異代謝物進行富集分析發(fā)現(xiàn)，差異代謝物主要有氨基酸和肽(15種)、TCA cycle有機酸(2種)、生物堿類(2種)、苯(3種)、有機二羧酸(2種)、吲哚(2種)、苯甲酸(2種)、單糖(2種)、脂肪酸和共軛物(5種)、黃酮類(5種)〔見圖6(b)〕. 相比S處理組，S-nSe (0.5 mg/L)處理組中有10種氨基酸和肽的相對含量增加，包括酪氨酸(增加了3.88倍)、苯丙氨酸(增加了7.50倍)、脯氨酸(增加了44.33倍)、天冬酰胺(增加了1.62倍)、鳥氨酸(增加了3.80倍)、精氨酸(增加了3.65倍)、纈氨酸(增加了5.03倍)、色氨酸(增加了3.72倍)、n-乙酰鳥氨酸(增加了2.08倍)、乙酰精氨酸(增加了1.50倍)等. 脯氨酸是一種滲透保護劑和重要的信號分子，在植物細胞質(zhì)中具有穩(wěn)定和保護細胞膜、蛋白酶及不同蛋白質(zhì)的功能，它可以通過增加膜蛋白、清除活性氧和維持細胞溶質(zhì)穩(wěn)態(tài)來調(diào)節(jié)植物在逆境中的新陳代謝[38,45]. 吲哚乙酸和吲哚丙烯酸的相對含量分別增加了25.15和3.72倍，而研究[46]表明，生長素(吲哚乙酸)信號可以通過與擬南芥的氧化還原代謝相互作用參與對鹽脅迫的適應性反應. 通過差異代謝物通路分析(P≤0.05，通路影響值≥0.1)篩選得到6條差異代謝通路，分別為精氨酸生物合成，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，苯丙氨酸代謝，精氨酸和脯氨酸代謝，異喹啉生物堿生物合成以及酪氨酸代謝〔見圖6(d)〕.

研究[21,47]發(fā)現(xiàn)，對植物施用nTiO2可以增強抗氧化酶活性以及增加可溶性糖和氨基酸等含量，從而提高植物耐鹽性. 通過代謝組學分析發(fā)現(xiàn)，nTiO2顯著增加了部分氨基酸和肽、脂肪酸和共軛物、TCA cycle有機酸、胺類、核苷酸類物質(zhì)(嘧啶和嘌呤等)以及單糖等物質(zhì)的相對含量，因此nTiO2可能是通過增加部分氨基酸和糖類物質(zhì)的生物合成從而增強煙草BY-2懸浮細胞的耐鹽性. nSe對植物耐鹽性影響的研究[18]發(fā)現(xiàn)，nSe主要通過增強光合作用、提高抗氧化酶活性，增加滲透物質(zhì)(可溶性碳水化合物和脯氨酸)的積累從而增強植物的耐鹽性. 此外，nSe處理還會增加吲哚乙酸和水楊酸等植物激素的含量[18-19].代謝組學結(jié)果顯示，nSe顯著增加了氨基酸和肽類物質(zhì)以及吲哚類物質(zhì)的相對含量，水楊酸、脯氨酸和吲哚乙酸均大幅增加，表明nSe可能通過增強這幾類物質(zhì)的合成從而增強煙草BY-2懸浮細胞在鹽脅迫下的耐受性. 綜上，兩種NMs分別通過調(diào)控不同的代謝物合成途徑從而增強煙草BY-2懸浮細胞的耐鹽性，nTiO2主要增強多種不同類別代謝物的合成，而nSe則主要增強氨基酸和肽類物質(zhì)、吲哚類物質(zhì)以及水楊酸的合成.

2.3.4 NMs調(diào)控下的差異代謝物與Na+外排相關(guān)性分析

將暴露于nTiO2和nSe后得到的差異代謝物與對應處理組的Na+流速進行相關(guān)性分析(見表1).nTiO2導致的差異代謝物中與Na+外排相關(guān)性較大物質(zhì)分別為尿苷、吡哆醛、甘露糖、大麥芽堿和葫蘆巴堿，nSe導致的差異代謝物中與Na+外排相關(guān)性較大的物質(zhì)分別為吲哚丙烯酸、色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸，這幾類物質(zhì)都參與莽草酸途徑或相關(guān)下游途徑.研究[48]表明，鹽脅迫下苯丙氨酸和色氨酸會發(fā)生累積，因此nSe極有可能通過調(diào)控莽草酸代謝途徑促進Na+外排從而增強植物耐鹽性.

表1 NMs處理下細胞不同差異代謝物與Na+外排相關(guān)性Table 1 Correlation between Na+ efflux and differential metabolites in BY-2 cell suspensions altered by NMs exposure

相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，兩種NMs暴露后富馬酸和黃嘌呤均與Na+外排呈顯著正相關(guān)，而其他物質(zhì)在兩種NMs暴露下呈不同的調(diào)控模式. 其中，富馬酸作為TCA cycle的中間體，在生物能量生產(chǎn)中發(fā)揮著重要作用；而黃嘌呤的累積可激活黃嘌呤脫氫酶將其轉(zhuǎn)化為尿酸，去除過量的ROS. 研究[49]表明，外源施加黃嘌呤和尿酸可增強蘋果對鹽脅迫的耐受性. 因此，富馬酸和黃嘌呤可能對NMs提高鹽脅迫下植物Na+外排從而增強植物耐鹽性起重要推動作用.

3 結(jié)論

a) 鹽脅迫導致煙草BY-2懸浮細胞的細胞活性顯著降低34.3%±9.0%，而鹽脅迫下細胞暴露于0.1 mg/L nTiO2(6 h)和0.5 mg/L nSe (12 h)使細胞活性比S處理組分別顯著增強8.1%和13.6%.

b) 暴露于0.1 mg/L nTiO2(6 h)和0.5 mg/L nSe(12 h)后，煙草BY-2懸浮細胞表面Na+外排比S處理組均顯著增強(171.5%和99.0%)，說明兩種NMs可能通過增加Na+外排從而提高耐鹽性，最終增加細胞活性.

c) 對兩種NMs暴露后各處理組進行代謝組學分析發(fā)現(xiàn)，兩種NMs暴露均顯著改變了鹽脅迫下細胞的代謝物組成. nTiO2通過增加多種代謝物(部分氨基酸和肽、脂肪酸和共軛物、TCA cycle有機酸、糖類和嘧啶等物質(zhì))的含量從而增強煙草BY-2懸浮細胞在鹽脅迫下的耐受性，而nSe則主要通過增加氨基酸和肽、吲哚和水楊酸等物質(zhì)的合成來增強細胞的耐鹽性. 此外，富馬酸和黃嘌呤在兩種NMs處理下都與Na+外排呈顯著正相關(guān)，其中，nSe可能通過調(diào)控莽草酸代謝途徑及相關(guān)代謝物促進Na+外排.

d) 該研究從代謝水平揭示了兩種NMs (nTiO2和nSe)增強植物耐鹽性的不同分子機制.