孫 楠，任有良，孫強(qiáng)強(qiáng)，王毅夢(mèng)

(商洛學(xué)院 化學(xué)工程與現(xiàn)代材料學(xué)院/陜西省尾礦資源綜合利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 商洛 726000)

陜西省商洛市洛南縣是國(guó)家確定的首批整縣推進(jìn)的現(xiàn)代煙草農(nóng)業(yè)示范縣，年平均種植烤煙0.67萬(wàn)hm2，“十三五”期間，洛南縣烤煙面積要穩(wěn)定在0.67萬(wàn)hm2。由于煙葉生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)提高，產(chǎn)生了大量的殘次煙葉以及煙，焚燒產(chǎn)生大量的煙塵霧霾，破壞大氣環(huán)境，還污染土壤，對(duì)烤煙生產(chǎn)持續(xù)發(fā)展產(chǎn)生不利影響，因此，利用廢次煙葉生產(chǎn)茄尼醇、煙堿、活性炭及有機(jī)肥[1～4]，有利于保護(hù)環(huán)境、烤煙生產(chǎn)可持續(xù)發(fā)展，增加煙農(nóng)收入，精準(zhǔn)扶貧。目前，茄尼醇主要應(yīng)用于合成維生素K2和輔酶Q10，其中輔酶Q10的合成最具有應(yīng)用和商業(yè)價(jià)值[5～8]。輔酶Q10具有改善心肌代謝障礙的作用，是細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生能量所必不可少的輔酶助因子，作為人體細(xì)胞呼吸和代謝的激活劑以及機(jī)體的免疫增強(qiáng)劑，用于治療急慢性肝炎、亞急性肝壞死、心腦血管等疾病[8～10]。雖現(xiàn)有不少企業(yè)在生產(chǎn)茄尼醇，但因生產(chǎn)技術(shù)落后，工藝陳舊，產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定，生產(chǎn)成本高，經(jīng)濟(jì)效益低而無(wú)市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力[11～14]。這些低含量的的茄尼醇不能直接作為藥用原料，導(dǎo)致我國(guó)粗品茄尼醇出口到日美等國(guó)家后，被精制加工成含量以上精品茄尼醇萬(wàn)元噸或合成輔酶Q10后再返銷國(guó)內(nèi)[15～17]。筆者研究廢次煙葉中茄尼醇的提取純化新工藝，改進(jìn)傳統(tǒng)的提取技術(shù)，獲取高收率和高質(zhì)量的茄尼醇產(chǎn)品，使之符合現(xiàn)代醫(yī)藥生產(chǎn)和產(chǎn)品的要求，力求在提高茄尼醇產(chǎn)品質(zhì)量、降低生產(chǎn)成本、充分利用資源等方面有所改進(jìn)或突破。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

廢次煙葉，2019年3月采摘于陜西省商洛市洛南縣；茄尼醇標(biāo)準(zhǔn)品，四川省維克奇生物科技有限公司；乙酸乙酯(分析純)，天津市津東天正精細(xì)化學(xué)試劑廠；石油醚(分析純)，天津市富宇精細(xì)化工有限公司；羧甲基纖維素鈉(分析純)，天津市河?xùn)|區(qū)紅巖試劑廠；薄層層析硅膠G(分析純)，青島海洋化工有限公司；冰乙酸(分析純)，天津市百世化工有限公司。

數(shù)顯式電熱恒溫水浴鍋(HHS-11-1型)； 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(220V 50/60Hz型)； 小型樣品粉碎機(jī)(SA-10型)。

1.2 實(shí)驗(yàn)步驟

1.2.1 煙草原料預(yù)處理 將清洗過(guò)的煙葉置于烘箱中在60℃下烘3 h，粉碎，置于密封袋中備用。

1.2.2 茄尼醇粗提方法 精確稱取預(yù)先處理過(guò)的樣品10g置于250mL平底燒瓶中，以固液比1∶10的比例加入100 mL的石油醚溶劑，將燒瓶置于數(shù)顯式電熱恒溫水浴鍋發(fā)生裝置中，在50℃下提取6h后取后進(jìn)行抽濾。濾液通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮除去有機(jī)溶劑后，剩余物即為煙草茄尼醇粗提物。

1.2.3 茄尼醇粗提物的皂化 稱取一定量茄尼醇粗提物于250 mL平底燒瓶中，加入50 mL 0.2 mol/L NaOH乙醇溶液，在50℃下皂化反應(yīng)2 h，停止反應(yīng)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇得褐色粘稠物，再向燒瓶中加入50 mL蒸餾水，加熱攪拌并滴加鹽酸調(diào)節(jié)pH=7，再用石油醚萃取3次(50 mL×3)，合并石油醚層，用蒸餾水反洗一次，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)石油醚萃取液得茄尼醇純品。

1.2.4 茄尼醇定性測(cè)定 用薄層色譜法來(lái)定性測(cè)定廢次煙葉皂化后的樣品中茄尼醇的存在。用石油醚溶解茄尼醇標(biāo)準(zhǔn)樣和測(cè)試樣，配置成一定濃度的試液，在一塊硅膠層析板上同時(shí)用毛細(xì)管點(diǎn)上標(biāo)準(zhǔn)樣和測(cè)試樣，然后將層析板置于展開(kāi)溶劑中展開(kāi)，展開(kāi)溶劑不要沒(méi)過(guò)硅膠層析板下端10 mm處，待展開(kāi)溶劑前沿達(dá)到五分之四處時(shí)取出層析板，待溶劑揮發(fā)后用碘蒸氣顯色。

固定相： 預(yù)制硅膠板

流動(dòng)性(展開(kāi)劑)： 石油醚∶乙酸乙酯∶乙酸=4∶1∶0.5

顯色劑： 碘蒸氣

展開(kāi)方式： 平行展開(kāi)

1.2.5 茄尼醇定量測(cè)定 稱取茄尼醇標(biāo)準(zhǔn)品0.020 g，置于50 mL容量瓶中，加入95%乙醇定容得0.4 g/L茄尼醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液。分別精密吸取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 mL的茄尼醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液于10 mL容量瓶中，加95%乙醇到刻度，混勻，制備成一系列質(zhì)量濃度的茄尼醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液，于210 nm波長(zhǎng)下采用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)法測(cè)其吸光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 定性分析

茄尼醇薄層色譜結(jié)果如圖1所示：

Rf=溶質(zhì)移動(dòng)的距離/溶液移動(dòng)的距離

左邊是茄尼醇標(biāo)準(zhǔn)品，右邊是樣品茄尼醇提取液，經(jīng)計(jì)算，茄尼醇標(biāo)準(zhǔn)品Rf=0.68，樣品提取液Rf=0.676 0，樣品與標(biāo)準(zhǔn)樣的Rf值的數(shù)據(jù)相符，確定提取出的產(chǎn)品為茄尼醇。如圖1所示：

圖1 薄層色譜

2.2 定量分析

根據(jù)茄尼醇定量測(cè)定的方法，將吸光度(A)與質(zhì)量濃度(c)回歸得標(biāo)準(zhǔn)品茄尼醇在95%乙醇中的線性方程為:

A=7.164 3c+0.625 8 R2=0.996 4 如圖2所示。

在提取的茄尼醇樣品中加入95%乙醇定容至50 mL容量瓶中，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其吸光度，根據(jù)茄尼醇標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程算出茄尼醇粗品的質(zhì)量，進(jìn)而得出茄尼醇的提取率。

茄尼醇提取率=茄尼醇質(zhì)量/煙草原料質(zhì)量×100%

2.3 提取茄尼醇的影響因素

2.3.1 浸提溶劑對(duì)提取率的影響 溶劑篩選試驗(yàn)提取條件為溫度50 ℃，時(shí)間6 h， 料液比1∶10(g/mL)，篩選溶劑分別為石油醚，丙酮，乙醇，乙酸乙酯，篩選指標(biāo)為茄尼醇提取率和溶劑價(jià)格。

圖2 茄尼醇標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線

不同溶劑對(duì)茄尼醇的提取率如表1所示。

表1 不同溶劑對(duì)茄尼醇的提取率

從表1可以看出，石油醚的提取效果最好，乙酸乙酯和無(wú)水乙醇的提取效率沒(méi)有石油醚的好，其原因是因?yàn)榍涯岽嫉臉O性較小，根據(jù)相似相容原理，茄尼醇在低極性的溶劑石油醚中溶解度比在高極性的無(wú)水乙醇和乙酸乙酯中溶解度大，因此應(yīng)選極性小的石油醚作為提取溶劑，從溶劑成本上考慮，石油醚作為提取溶劑更合適。所以最佳浸提溶劑為石油醚。

2.3.2 浸提溫度對(duì)提取率的影響 實(shí)驗(yàn)條件為浸提溶劑石油醚，浸提時(shí)間6 h，料液比1∶10，提取溫度分別為30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃，浸提溫度對(duì)提取率的影響如3所示：

圖3 浸提溫度對(duì)提取率的影響

由圖3可知，隨著溫度的升高，茄尼醇的提取率在50℃達(dá)到最大。因?yàn)樵谳^高的提取溫度下有利于植物細(xì)胞膜、細(xì)胞壁和纖維結(jié)構(gòu)的破壞，且樣品的顆粒越小這種破壞程度會(huì)增強(qiáng)，所以，提取溫度的升高，不僅有助于細(xì)胞膜、細(xì)胞壁和纖維結(jié)構(gòu)的繼續(xù)破壞，而且還增大了茄尼醇在石油醚中的溶解度和分子的運(yùn)動(dòng)速度，在濃差化學(xué)勢(shì)的作用下使茄尼醇繼續(xù)釋放出來(lái)，使得茄尼醇提取率隨之相應(yīng)增加。但當(dāng)溫度高于50℃后，會(huì)引起茄尼醇分子的衰變，從而降低茄尼醇的提取率。因此茄尼醇的最佳浸提溫度為50℃。

2.3.3 浸提時(shí)間對(duì)提取率的影響 實(shí)驗(yàn)條件為浸提溶劑石油醚，浸提溫度50℃，料液比1∶10，篩選浸提時(shí)間分別為2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h，如圖4所示：

圖4可知，提取時(shí)間低于6 h 時(shí)，提取率的增長(zhǎng)很快，因?yàn)闊熑~的細(xì)胞膜、細(xì)胞壁和纖維結(jié)構(gòu)的破壞需要適當(dāng)?shù)臏囟?，還需要時(shí)間去降低提取液的擴(kuò)散阻力，在濃差化學(xué)勢(shì)的作用下，逐漸提取出煙葉細(xì)胞壁中的茄尼醇。隨著提取時(shí)間的增長(zhǎng)，細(xì)胞膜、細(xì)胞壁和纖維結(jié)構(gòu)被大部分破壞，茄尼醇的提取率隨著提取液的擴(kuò)散速度增大也快速增大。當(dāng)提取時(shí)間超過(guò)6h后，細(xì)胞膜、細(xì)胞壁和纖維結(jié)構(gòu)被破壞掉，進(jìn)到提取液中茄尼醇的量也越來(lái)越多，但提取液和煙葉細(xì)胞中茄尼醇的濃差化學(xué)勢(shì)作用逐漸減小，茄尼醇提取率增長(zhǎng)速度逐漸減小，因而茄尼醇提取率隨時(shí)間的延長(zhǎng)變化緩慢。所以茄尼醇的最佳提取時(shí)間是6 h。

圖4 浸提時(shí)間對(duì)提取率的影響

2.3.4 料液比對(duì)提取率的影響 實(shí)驗(yàn)條件為浸提溶劑石油醚，浸提溫度50℃，浸提時(shí)間6 h，篩選料液比分別為1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14、1∶16，如圖5所示：

圖5 料液比對(duì)提取率的影響

由圖5看出，隨著料液比的增大，茄尼醇的提取率也增大，在料液比為1∶10時(shí)達(dá)到最大，之后，隨著料液比的增大，雖然提取率在增大，但增長(zhǎng)速度很慢。當(dāng)提取液較少時(shí)，隨著溶出的茄尼醇，很快在提取液中達(dá)到分配平衡，這樣煙葉中可提取的茄尼醇不能充分進(jìn)入到提取液中被提取，從而降低提取率。要溶出更多的茄尼醇才能使茄尼醇在煙葉和提取液間達(dá)到分配平衡，這時(shí)兩相中的滲透壓也相應(yīng)增大，使越來(lái)越多的茄尼醇進(jìn)入到提取液中，則提取率逐漸增大。當(dāng)料液比達(dá)到1∶10時(shí)，一方面，煙葉中茄尼醇含量很低，另一方面，提取液含量過(guò)大，這時(shí)，從煙葉溶出少量的茄尼醇很快達(dá)到分配平衡，而提取液中茄尼醇濃度無(wú)明顯變化，所以提取率幾乎沒(méi)有明顯增加。所以提取茄尼醇最佳料液比為1∶10。

3 結(jié)論

(1)利用洛南廢次煙葉煙桿提取茄尼醇的工藝研究路線：先將廢次煙葉洗凈、粉碎、烘干，通過(guò)加入有機(jī)溶劑浸提一定時(shí)間，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑，得到粗提物，進(jìn)行皂化，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去皂化液，加蒸餾水，調(diào)節(jié)pH，萃取，洗滌，再次旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得到皂化物，最后對(duì)產(chǎn)品鑒定。

(2)經(jīng)薄層色譜法測(cè)定，測(cè)試樣的Rf值是0.676，與標(biāo)準(zhǔn)樣的Rf值0.68的數(shù)據(jù)相符，確定提取出的產(chǎn)品為茄尼醇。

(3)通過(guò)試驗(yàn)最終得出：采用溶劑法浸提煙葉中茄尼醇的最佳提取工藝條件：浸提液為石油醚，料液比為 1∶10，提取溫度為50℃，提取時(shí)間為6 h。在此條件下，經(jīng)過(guò)紫外分光光度計(jì)法定量測(cè)定，煙葉中茄尼醇的提取率為0.10%。