楊志城 孫彩虹 房慶偉 吳若銘 李坤 葉冠

（上海醫(yī)藥集團股份有限公司中央研究院 上海 201203）

神經(jīng)病理性疼痛（neuropathic pain, NP）是指由機體感覺神經(jīng)系統(tǒng)的損傷或疾病引起的疼痛[1]，其全球人口患病率約為3.3% ～ 8.2%[2]，歐洲人群的患病率可能高達8%[3]，推測我國約有9 000萬NP患者，占慢性疼痛患者總數(shù)的20% ～ 25%[4]。對于NP，目前臨床上缺乏根治方法和特效藥物。因此，積極探尋療效確切且不良反應(yīng)小的NP治療藥物具有重要的現(xiàn)實意義。

瘀血痹膠囊由當歸、丹參、炙乳香等11味中藥組成，有活血化瘀、通絡(luò)定痛之功效，現(xiàn)臨床上主要用于緩解某些患者的關(guān)節(jié)疼痛癥狀。目前，關(guān)于瘀血痹膠囊的鎮(zhèn)痛作用雖已見動物模型[5]、臨床藥效學(xué)[6]和基于單味藥的鎮(zhèn)痛機制[7-9]研究報告，但缺乏整體性研究。本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)探究瘀血痹膠囊可能具有的抗NP活性成分及其作用機制，為拓展瘀血痹膠囊治療NP新用途提供理論依據(jù)。

1 工具與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫和軟件

數(shù)據(jù)庫：TCMSP數(shù)據(jù)庫（http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）；Genecards數(shù) 據(jù) 庫（http://www.genecards.org）；UniProt數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org）；STRING數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org）；DAVID數(shù) 據(jù) 庫（https://david.ncifcrf.gov/）。

軟件：R3.6.3；Cytoscape 3.7.2；Discovery Studio 2019。

1.2 化學(xué)成分的收集和篩選

在TCMSP數(shù)據(jù)庫中，以瘀血痹膠囊所含單味藥的中文名進行檢索，收集整理后取口服生物利用度≥30%、類藥性≥0.18的活性成分納入后續(xù)研究。

1.3 作用靶點收集和網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫收集活性成分的作用靶點，然后將作用靶點名輸入UniProt數(shù)據(jù)庫進行標準化。此外，在Genecards數(shù)據(jù)庫中以“neuropathic pain”為關(guān)鍵詞進行檢索，獲得潛在的“疾病靶點”。整合活性成分作用靶點和疾病靶點信息，得到交集靶點和瘀血痹膠囊活性成分-NP靶標調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

1.4 蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interaction,PPI）分析

在網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究中，STRING數(shù)據(jù)庫通常被用來構(gòu)建靶標蛋白之間的PPI網(wǎng)絡(luò)。將經(jīng)韋恩圖處理后的交集靶點去重后導(dǎo)入到STRING數(shù)據(jù)庫中，設(shè)置organism為“homo sapines”進行搜索，然后將處理好的數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件中，利用該軟件自帶的Network Analysis插件進行網(wǎng)絡(luò)拓撲分析，取靶點degree值的中位數(shù)構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，并根據(jù)2倍degree值中位數(shù)篩選核心靶點。

1.5 GO（Gene Ontology）和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）富集分析

對篩選所得交集靶點進行GO和KEGG富集分析，并對分子功能、生物過程和細胞成分3部分進行可視化，分析瘀血痹膠囊潛在的抗NP作用，同時獲知瘀血痹膠囊產(chǎn)生抗NP作用的相關(guān)信號通路，分析其作用機制。

1.6 分子對接驗證

將篩選所得核心靶點與瘀血痹膠囊活性成分-NP靶標調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中排名靠前的化合物進行分子對接。定義靶蛋白為受體分子，根據(jù)PDB數(shù)據(jù)庫對該靶蛋白共晶小分子配體的文獻說明，選擇該靶蛋白特殊抑制劑（配體）作為活性中心，運用配體擴張法確定活性位點，即以共晶小分子配體的位置為中心，再向外擴增9 ?范圍，這個范圍的球狀受體殘基就構(gòu)成了相關(guān)的活性位點，然后刪除共晶配體以形成活性空腔。采用Discovery Studio 2019軟件中LibDock模塊進行模擬對接，以LibDockScore來評價化合物與靶蛋白的親和力，其值越大，表明親和力越高。

2 結(jié)果與分析

2.1 瘀血痹膠囊潛在的抗NP活性成分及其作用靶點篩選

檢索、篩選后共得瘀血痹膠囊潛在的抗NP活性成分128個，作用靶點11 504個，去重后獲得124個不重復(fù)作用靶點。與1 434個NP疾病靶點進行交集，得到43個交集靶點。

2.2 瘀血痹膠囊活性成分-NP疾病靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

采用Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建瘀血痹膠囊活性成分-潛在靶點網(wǎng)絡(luò)圖（圖1，其中外圈為瘀血痹膠囊活性成分，中圈為瘀血痹膠囊作用靶點與NP疾病靶點的交集靶點，內(nèi)圈為瘀血痹膠囊所含藥味）。由圖1可知，瘀血痹膠囊通過多活性成分、多作用靶點產(chǎn)生抗NP協(xié)同作用。對該網(wǎng)絡(luò)進行進一步的Network Analyze分析，以活性成分的作用靶點個數(shù)為指標排序，獲知槲皮素、山奈酚、木犀草素和4-亞甲基丹參新酮等可能為瘀血痹膠囊之所以具有抗NP作用的主要活性成分。

圖1 瘀血痹膠囊活性成分-潛在靶點網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果

運用STRING數(shù)據(jù)庫繪制交集靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)圖（圖2），然后采用Cytoscape 3.7.2軟件篩選作用靶點，獲知核心作用靶點為白介素-6、白蛋白、血管內(nèi)皮生長因子A、胱天蛋白酶-3、絲裂原激活的蛋白激酶8、雌激素受體-1和β-淀粉樣蛋白前體蛋白，主要集中于表皮/血管內(nèi)皮細胞功能調(diào)節(jié)、炎癥調(diào)控、白蛋白表達、細胞增殖/凋亡/分化、糖脂代謝和神經(jīng)生長等方面。

圖2 瘀血痹膠囊抗NP作用的PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 瘀血痹膠囊抗NP作用靶點的GO富集分析

對交集靶點進行GO富集-有向無環(huán)圖分析，結(jié)果如圖3所示，瘀血痹膠囊抗NP作用主要與核酸轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合活性、跨膜受體活性、細胞分子功能、受體活性4大生物模塊相關(guān)，通過調(diào)節(jié)腎上腺素受體活性、G蛋白偶聯(lián)受體活性、甾體激素受體活性、神經(jīng)遞質(zhì)受體活性、蛋白異二聚化活性和銨離子結(jié)合、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、甾體激素結(jié)合過程，最終產(chǎn)生抗NP作用。

圖3 瘀血痹膠囊抗NP作用靶點的GO富集條目有向無環(huán)圖

2.5 瘀血痹膠囊抗NP作用的細胞內(nèi)信號通路KEGG富集分析

以P值為標準選取與炎癥、免疫、激素和中樞神經(jīng)相關(guān)的20條信號通路進行可視化分析，其中與免疫和中樞神經(jīng)相關(guān)的信號通路數(shù)較多，如神經(jīng)活性配體-受體相互作用信號通路、神經(jīng)退行性疾病途徑-多種疾病信號通路、阿爾茨海默病信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、白介素-17信號通路、T細胞受體信號通路等；細胞的重要信號通路數(shù)也較多，如絲裂原激活的蛋白激酶8信號通路、環(huán)磷酸腺苷信號通路、鈣信號通路等。KEGG富集分析顯示，瘀血痹膠囊的活性成分可能是通過作用于上述諸信號通路而最終產(chǎn)生抗NP作用的（圖4）。

圖4 瘀血痹膠囊抗NP作用靶點的KEGG富集分析

2.6 分子對接驗證

選取PPI網(wǎng)絡(luò)圖中大于2倍degree值中位數(shù)的核心作用靶點作為分子對接受體，同時選取瘀血痹膠囊活性成分-NP疾病靶點網(wǎng)絡(luò)中排名前10位的化合物作為配體，進行分子對接。結(jié)果顯示，這些化合物與白介素-6的對接活性最好，其次為白蛋白、血管內(nèi)皮生長因子A、胱天蛋白酶-3、絲裂原激活的蛋白激酶8等作用靶點；木犀草素、異鼠李素、山奈酚等化合物與各核心作用靶點的分子對接得分均較高（平均值均＞100，表1）。此外，丹參中所含異隱丹參酮、丹參酮ⅡA、丹參酚醌Ⅰ、二氫丹參內(nèi)酯等化合物均較好地結(jié)合在核心作用靶點的活性空腔內(nèi)。

表1 瘀血痹膠囊主要活性成分與核心作用靶點的分子對接得分平均值

3 討論

瘀血痹膠囊在治療類風濕性關(guān)節(jié)炎時表現(xiàn)出有顯著的鎮(zhèn)痛作用，這可能與其含有乳香、沒藥、紅花、丹參等鎮(zhèn)痛藥味有關(guān)。疼痛可分為傷害感受性疼痛和NP兩類[10]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示，瘀血痹膠囊中的活性成分丹參酮ⅡA、迷迭香酸等對NP均有良好鎮(zhèn)痛活性[11-12]。因此，運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究瘀血痹膠囊是否也具有抗NP作用是有一定理由的。

本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，瘀血痹膠囊的主要作用靶點包括細胞因子（血管內(nèi)皮生長因子A、白介素-6）、細胞核受體（雌激素受體-1、雄激素受體、過氧化物酶體增殖物激活受體）、功能調(diào)節(jié)蛋白（白蛋白、c-Fos蛋白、β-淀粉樣蛋白前體蛋白）和酶（絲裂原激活的蛋白激酶8）等，這些作用靶點與神經(jīng)活性、炎癥和免疫功能等密切相關(guān)。GO和KEGG富集分析結(jié)果顯示，瘀血痹膠囊系經(jīng)影響神經(jīng)活性配體-受體相互作用、腫瘤壞死因子、白介素-17、T細胞受體、絲裂原激活的蛋白激酶8、環(huán)磷酸腺苷、鈣等信號通路而調(diào)節(jié)炎癥、細胞增殖/分化/代謝和甾體激素、前列腺素等的受體活性，以及核酸復(fù)制、轉(zhuǎn)錄因子生成，最終產(chǎn)生抗NP作用的。

如前所述，丹參酚醌Ⅰ、二氫丹參內(nèi)酯、丹參酮ⅡA和異隱丹參酮等均具有抗NP活性。分子對接結(jié)果也顯示，這些化合物是瘀血痹膠囊之所以具有抗NP作用的重要活性成分?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示，丹參中的活性成分丹酚酸B、丹參酚醌Ⅰ、丹參素、二氫丹參內(nèi)酯、異隱丹參酮和丹參酮ⅡA等能通過可逆性地阻斷神經(jīng)干動作電位的沖動傳導(dǎo)而產(chǎn)生抗NP作用[13]，沒藥、紅花和川牛膝等中共有的活性成分槲皮素可通過顯著降低腫瘤壞死因子-α、白介素-1β、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶和環(huán)氧化酶-2等的表達水平而有效減輕NP[14]。此外，紅花、香附和黃芪中共有的活性成分山奈酚能通過抑制Toll樣受體4-核因子-κB信號通路，減弱caspase-8、caspase-3和NLRP1/NLRP3炎性小體的活性，減少或阻止炎癥因子的產(chǎn)生，進而減輕腦神經(jīng)細胞損傷，最終產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用[15]。香附、黃芪等中共有的活性成分異鼠李素可通過抑制核因子-κB信號通路，降低腫瘤壞死因子-α、白介素-6和白介素-1β的表達水平，最終產(chǎn)生抗炎鎮(zhèn)痛作用[16]；咖啡酸亦可通過抑制核因子-κB和5-脂氧合酶的活性，下調(diào)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶的表達水平，減少一氧化氮合成，抑制炎癥引起的髓過氧化物酶、丙二醛和亞硝酸鹽水平的升高，抑制多種炎性介質(zhì)的合成和釋放，進而有效減輕炎癥造成的神經(jīng)元氧化損傷，最終產(chǎn)生炎性疼痛減輕作用[16-17]。

總之，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析顯示，瘀血痹膠囊具有多成分、多靶點、多途徑治療NP的潛力，其主要通過影響甾體激素受體活性、轉(zhuǎn)錄因子生成、炎癥過程、神經(jīng)細胞生長/修復(fù)等而產(chǎn)生抗NP作用。本研究結(jié)果為瘀血痹膠囊用于NP治療提供了理論依據(jù)。