董 柯，李 霞，魏臻武，朱道辰，蔣建雄

（1.江蘇大學生物質(zhì)能源研究院/環(huán)境與安全工程學院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；2.揚州大學動物科學與技術(shù)學院，江蘇 揚州 225009）

中國主要農(nóng)作物秸稈可收集資源量每年可達到約7 億t，但農(nóng)作物秸稈的資源化利用效率極低，大部分秸稈在田間被直接焚燒或者廢棄，不僅造成了巨大的資源浪費，而且也引起了嚴重的環(huán)境污染［1，2］。隨著中國養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，家畜粗飼料短缺的問題越來越突出，因此，將農(nóng)作物秸稈用作牛羊粗飼草有利于緩解畜牧養(yǎng)殖業(yè)面臨的飼草不足等問題，同時也為秸稈的資源化合理利用提供了有效途徑［3］。但農(nóng)作物秸稈由于木質(zhì)纖維素含量偏高、粗蛋白質(zhì)等營養(yǎng)成分含量偏少等原因，難以被家畜直接消化利用。青貯是一種簡單、實用的秸稈飼料化利用方式，一方面可以改善飼草的營養(yǎng)和風味，提高動物的采食量，另一方面可以延長飼草的保存期。青貯是通過乳桿菌等產(chǎn)酸菌厭氧發(fā)酵產(chǎn)生乳酸、乙酸以及其他揮發(fā)性有機酸，使飼草生物質(zhì)pH 降低，從而抑制了酵母菌、霉菌等有害微生物滋生，經(jīng)發(fā)酵制成營養(yǎng)價值和適口性均較好的優(yōu)質(zhì)飼料。植物表面附著的乳酸菌數(shù)量較少，且生存能力不強，僅依靠植物表面的乳酸菌不足以進行青貯發(fā)酵，因此青貯的主要方式是加入產(chǎn)乳酸菌劑進行發(fā)酵［4-9］。產(chǎn)乳酸菌在飼草青貯發(fā)酵中的作用極其重要，發(fā)酵質(zhì)量直接受其影響，常見的產(chǎn)乳酸菌來自乳桿菌屬（Lactobacillus）、腸球菌屬（Enterococcus）、乳球菌屬（Lactococcus）、明 串 珠 菌 屬（Leuconostoc）、片 球 菌 屬（Pediococcus）、魏斯氏菌屬（Weissella）以及芽孢桿菌屬（Bacillus）等［10-18］。

由于不同青貯原料的理化性質(zhì)千差萬別，分離篩選各種產(chǎn)酸能力強、青貯發(fā)酵效果好的特異菌種資源對成功調(diào)制青貯飼草至關(guān)重要。目前，分離鑒定適宜青貯發(fā)酵的乳酸菌，以獲得發(fā)酵品質(zhì)更高的青貯飼料，成為研究的重點［9，19］。從優(yōu)質(zhì)自然發(fā)酵青貯或發(fā)酵蔬菜中分離篩選產(chǎn)乳酸菌是一條高效、快捷的途徑，特別是湖南老壇泡菜和鹽菜中含有豐富的耐鹽、耐酸脅迫的產(chǎn)乳酸菌，并且這些產(chǎn)乳酸菌的適用性和安全性均較高。本研究從泡菜、鹽菜等傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜以及構(gòu)樹葉和燕麥優(yōu)質(zhì)自然發(fā)酵青貯中分離鑒定產(chǎn)乳酸菌，并闡明這些產(chǎn)乳酸菌的生長特性與產(chǎn)酸特性，挖掘部分優(yōu)異的產(chǎn)乳酸菌，研究其對青貯飼草發(fā)酵品質(zhì)的影響，為發(fā)展農(nóng)作物秸稈青貯飼草提供優(yōu)質(zhì)的菌種資源及科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 植物材料 泡菜和咸菜是在老壇中腌制的優(yōu)質(zhì)湖南傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜。燕麥（Avena sativaL.）青貯和構(gòu)樹（Broussonetia papyrifera）葉青貯為江蘇大學生物質(zhì)能源研究院調(diào)制并保存2 年的優(yōu)質(zhì)自然發(fā)酵青貯。

1.1.2 細菌培養(yǎng)基 MRS 液體培養(yǎng)基：牛肉膏10 g/L，酵母膏 5 g/L，蛋白胨10 g/L，葡萄糖 20 g/L，磷酸氫二鉀2 g/L，乙酸鈉5 g/L，七水硫酸鎂0.2 g/L，四水硫酸錳0.05 g/L，吐溫-80 1 g/L，檸檬酸三銨2 g/L，pH 6.2。

MRS 固體篩選培養(yǎng)基：MRS 液體培養(yǎng)基種添加瓊脂15 g/L 和溴甲酚紫 0.8 g/L，pH 6.2。

碳源基礎培養(yǎng)基：牛肉膏10 g/L，酵母膏5g/L，蛋白胨10 g/L，磷酸氫二鉀2 g/L，乙酸鈉5 g/L，七水硫酸鎂0.2 g/L，四水硫酸錳0.05 g/L，吐溫-80 1 g/L，檸檬酸三銨2 g/L，pH 6.2。

氮源基礎培養(yǎng)基：麥芽糖20 g/L，磷酸氫二鉀2 g/L，乙酸鈉5 g/L，七水硫酸鎂0.2 g/L，四水硫酸錳0.05 g/L，吐溫-80 1 g/L，檸檬酸三銨2 g/L，pH 6.2。

1.2 產(chǎn)酸菌株的分離與純化

取5 g 發(fā)酵材料研磨粉碎后加入無菌生理鹽水室溫下浸提30 min，將原液按從10-1至10-8的濃度梯度進行稀釋，分別取200 μL 于MRS 固體篩選培養(yǎng)基上涂板，室溫下倒置培養(yǎng)24 h［20］。從平板上挑取分散度較好且有黃色透明環(huán)的菌落，在新鮮MRS 固體篩選培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，獲得純化的單一菌落。單菌落接種于 MRS 液體培養(yǎng)基中，30 ℃下 200 r/min 振蕩培養(yǎng)24 h，菌液加入15%甘油后分裝，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 產(chǎn)酸菌株16S rDNA 序列分析

產(chǎn)酸菌基因組DNA 采用Ezup 柱式細菌基因組DNA 抽提試劑盒提取。采用擴增16s rDNA 片段的通用引物，27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和 1541R：5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′［21］。PCR 反應體系為 25 μL：1×PremixTaqTM、DNA 模板20～40 ng、正反向引物各0.2 μmol/L。PCR 反應條件為：95 ℃預變性3 min；94 ℃變性 45 s，56 ℃退火 45 s，72 ℃延伸 2 min，35 個循環(huán)；72 ℃延伸 7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離后采用SanPrep 柱式DNA 膠回收試劑盒回收目標條帶，送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序，測序引物仍為27F和1 541R。以拼接好的16S rDNA 序列作為探針在NCBI 數(shù)據(jù)庫中做BLASTn 比對，采用生物信息學軟件ClustalX1.83 進行多序列比對分析，采用軟件MEGA7 根據(jù)Kimura 2-parameter 模型計算序列間進化距離，利用鄰接法（Neighbor-Joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，系統(tǒng)發(fā)育樹可靠性采用1 000 次重復的自展值（Bootstrap）評價，系統(tǒng)發(fā)育樹用軟件TreeView展示。

1.4 菌液pH 和產(chǎn)酸圈大小的測定

將活化后的菌液（OD600nm=1.0）按6%接種量加入到新鮮MRS 液體培養(yǎng)基中，25 ℃厭氧條件下靜置培養(yǎng)48 h。將菌液于10 000 r/min 離心5 min，取上清液分別用于測定有機酸種類和含量、產(chǎn)酸圈大小以及pH。產(chǎn)酸圈大小的測定采用牛津杯法，菌液pH 的測定采用便攜式微量pH 計。

1.5 菌株產(chǎn)酸曲線和生長曲線的測定

將活化后的菌液（OD600nm=1.0）按6%接種量加入到新鮮MRS 液體培養(yǎng)基中，混合均勻后再分裝至2 mL 離心管中，25 ℃厭氧條件下靜置培養(yǎng)，每隔4 h分別測定菌液OD600nm和pH。

1.6 菌株pH 耐受性的測定

將活化后的菌液（OD600nm=1.0）以6%接種量分別加入到 pH 3、4、5 的 MRS 液體培養(yǎng)基中，混合均勻后再分裝到2 mL 離心管中，25 ℃厭氧條件下靜置培養(yǎng) 72 h，每隔 12 h 測定菌液OD600nm。

1.7 菌株產(chǎn)酸種類及含量的測定

將產(chǎn)酸菌發(fā)酵產(chǎn)物的上清液經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾后，用Prominence LC 高效液相色譜儀測定有機酸的種類及含量。液相色譜條件［22］：色譜柱為C18柱，流動相為甲醇和0.02 mol/L NaH2PO4（pH 2.7），梯度洗脫，洗脫液為甲醇+NaH2PO4（14∶86），流速1 mL/min，柱溫30 ℃，檢測波長210 nm，進樣體積20 μL。

1.8 最佳碳源和氮源及碳氮比的確定

在碳源基礎培養(yǎng)基中分別加入20g/L 葡萄糖、蔗糖、麥芽糖或可溶性淀粉制備成不同的碳源培養(yǎng)基。將產(chǎn)酸菌菌液（OD600nm=1.0）以2%接種量接入4種碳源培養(yǎng)基中，37 ℃下180 r/min 培養(yǎng)24 h，測定OD600nm確定最佳碳源。

在氮源基礎培養(yǎng)基中分別加入20 g/L 蛋白胨、大豆蛋白胨、酪蛋白胨、酵母粉、牛肉膏、硫酸銨制備成不同的氮源培養(yǎng)基。將產(chǎn)酸菌菌液（OD600nm=1.0）以2%接種量接入6種氮源培養(yǎng)基中，37 ℃下180 r/min培養(yǎng)24 h，測定OD600nm確定最佳氮源。

選擇最佳的碳源和氮源分別以1∶1、1∶2、1∶3、1∶1.5、1.5∶1、2∶1、3∶1 的配比制備細菌培養(yǎng)基。將產(chǎn)酸菌菌液（OD600nm=1.0）以2%接種量接入上述培養(yǎng)基中，37 ℃下 180 r/min 培養(yǎng) 24 h，測定OD600nm確定最佳碳氮比。

1.9 玉米秸稈青貯飼草的制備

果穗采收后，將玉米秸稈用粉碎機切成約3 cm的小段，采用真空袋法調(diào)制青貯，共設12 組產(chǎn)酸菌處理組和1 組不加菌的對照組（CK），其中單一菌種和混合菌種各6 組，菌種的添加量為1×109CFU/kg秸稈，室溫下青貯60 d。

1.10 青貯發(fā)酵品質(zhì)的測定

青貯飼草的pH 測定采用微量pH 計，有機酸含量測定采用高效液相色譜儀。采用烘干法測定青貯飼草中的干物質(zhì)（DM），采用范式法測定粗纖維（CF）、酸性洗滌纖維（ADF）和酸性洗滌木質(zhì)素（ADL），采用凱氏定氮法測定粗蛋白質(zhì)（CP），采用蒽酮-硫酸比色法測定可溶性碳水化合物（WSC），采用灰化法測定灰分（Ash）。飼料有氧穩(wěn)定性測定：青貯開封后，取出100 g 樣品放入250 mL 燒杯中，敞口放置，環(huán)境溫度為25 ℃，每日定時記錄青貯溫度，當青貯溫度超過室溫2 ℃時被認為呈現(xiàn)不穩(wěn)定狀態(tài)。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)酸菌的分離及其分子鑒定

經(jīng)過多輪劃板培養(yǎng)，獲得96 個產(chǎn)酸的單菌落，其中20 個來源于構(gòu)樹葉青貯、20 個來源于燕麥青貯、17 個來源于鹽菜、39 個來源于泡菜。對96 個單菌落進行分子生物學分類鑒定，擴增的16s rDNA 片段長度約為1 500 bp，并將序列在NCBI 數(shù)據(jù)庫中做BLASTn 比對分析。結(jié)果表明，有27 株彎曲乳桿菌（Lactobacillus curvatus）、6 株植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、6 株短乳桿菌（Lactobacillus brevis）、35 株布氏乳桿菌（Lactobacillus buchneri）、1 株戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）、19 株芽孢桿菌屬（Bacillussp.）、1 株科氏葡萄球菌（Staphylococcus cohnii）和1 株腸球菌屬（Enterococcussp.）。其中，彎曲乳桿菌、植物乳桿菌和短乳桿菌均來源于構(gòu)樹葉及燕麥青貯；戊糖片球菌僅來源于構(gòu)樹葉青貯；布氏乳桿菌和芽孢桿菌屬來源于泡菜與鹽菜；而腸球菌屬和科氏葡萄球菌僅從咸菜中分離到。利用16S rDNA 片段測序尚無法確定19 株芽孢桿菌屬和1 株腸球菌屬的具體分類名。

通過對發(fā)酵液pH 和產(chǎn)酸圈直徑的測定與比較，從中初步篩選出16 個具有較強產(chǎn)酸能力的菌株，48 h 發(fā)酵液pH 大多低于4.0，而且菌液pH 越低的菌株，其產(chǎn)酸圈直徑也越大（表1）。16 株產(chǎn)酸菌分別為2 株彎曲乳桿菌（G3 和Y5）、2 株植物乳桿菌（G17和Y17）、2 株短乳桿菌（G14 和Y4）、2 株布氏乳桿菌（PC-C1 和 PC2-1-1）、5 株芽孢桿菌屬（YC1-1-4、PC1-1、YC1-4-5、PC2-1-21、YC2-1），戊糖片球菌（G18）、科氏葡萄球菌（YC1-2-8）以及腸球菌屬各1株（YC2-6）。NJ系統(tǒng)發(fā)育樹如圖1 所示。

圖1 16 株產(chǎn)酸菌基于16S rDNA 序列的NJ 系統(tǒng)發(fā)育樹

表1 16 株產(chǎn)酸菌培養(yǎng)48 h 后發(fā)酵產(chǎn)物的pH 及產(chǎn)酸圈直徑

2.2 產(chǎn)酸菌的生長特性及產(chǎn)酸特性

初步篩選出的16 株產(chǎn)酸菌在靜置培養(yǎng)24 h 后菌液pH 均降至4.2 以下。其中，植物乳桿菌的pH 最低，達3.72，短乳桿菌的pH 最高，達4.02。進一步對同一菌種不同菌株之間的生長速率及產(chǎn)酸速率進行比較。結(jié)果表明，短乳桿菌Y4 和G14 在培養(yǎng)的前16 h 內(nèi)生長迅速，pH 快速下降，16 h 后變化趨緩，在整個培養(yǎng)過程中Y4 的OD600nm均明顯高于G14，其pH 則明顯低于 G14，Y4 的 pH 在培養(yǎng) 24 h 后即可達到4.0 左右（圖2a）。對于彎曲乳桿菌G3 和Y5，在培養(yǎng)后的12 h 內(nèi)，G3 的生長速率明顯高于Y5，之后G3的生長開始下降，而Y5 的生長則持續(xù)緩慢上升，到24 h 時兩者OD600nm基本接近，但兩者的產(chǎn)酸曲線基本一致，pH 在 24 h 后均接近 4.0（圖 2b）。植物乳桿菌G17 和Y17 的生長曲線基本保持一致，均能持續(xù)快速生長，且具有很強的產(chǎn)酸能力，培養(yǎng)12 h 后pH達到 4.0 左右，24 h 后降至約 3.7（圖 2c）。2 株布氏乳桿菌之間的生長曲線及產(chǎn)酸曲線表現(xiàn)出較大差異，其中，PC2-1-1 生長極其緩慢，培養(yǎng)24 h 后其OD600nm僅達到2.5，pH仍有5.1，而PC-C1持續(xù)快速生長，24 h后其OD600nm約13.0，pH 降至3.7（圖2d）。2 株芽孢桿菌之間的生長速率和產(chǎn)酸能力同樣也有較大差異，其中YC1-1-4 持續(xù)緩慢生長，培養(yǎng)24 h 后其OD600nm達到 9.0 左右，pH 降至 3.9 左右，而 PC1-1 則在前期生長緩慢，16 h 后才開始進入快速生長期，24 h 后其OD600nm接近8.0，pH 達到4.3 左右（圖2e）。

圖2 不同產(chǎn)酸菌產(chǎn)酸曲線和生長曲線

2.3 產(chǎn)酸菌的pH 耐受性

MRS 液體培養(yǎng)基的初始pH 為3 時，所有產(chǎn)酸菌株的繁殖速度極為緩慢，在培養(yǎng)72 h 后OD600nm均低于2.0。培養(yǎng)基pH 提高至4 或5 時，產(chǎn)酸菌株的繁殖速度與pH 為3 時的相比均有明顯增加，但也僅有植物乳桿菌（G17 和 Y17）在 pH 4 與 pH 5 的 MRS 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)72 h 后其OD600nm分別超過了5.0 和6.0。植物乳桿菌對低pH 的耐受性最強，其次是布氏乳桿菌、短乳桿菌和戊糖片球菌，彎曲乳桿菌對低pH 的耐受性最差（圖3）。

圖3 產(chǎn)酸菌的pH 耐受性

2.4 菌株產(chǎn)有機酸的種類及含量

采用HPLC 測定了16 株產(chǎn)酸菌48 h 發(fā)酵液中乳酸和其他揮發(fā)性有機酸的種類及含量。結(jié)果（表2）表明，產(chǎn)酸菌主要產(chǎn)生乳酸、乙酸和丙酸以及少量的異丁酸、丁酸和戊酸，均未檢測到異戊酸。同一種菌不同來源菌株的產(chǎn)酸含量具有差異性，產(chǎn)有益酸（乳酸、乙酸和丙酸）的總含量占優(yōu)勢的菌種有彎曲乳桿菌G3、植物乳桿菌G17、短乳桿菌Y4、芽孢桿菌YC1-1-4、布氏乳桿菌 PC-C1、腸球菌 YC2-6 和戊糖片球菌G18。

2.5 最佳碳源、氮源及碳氮比

產(chǎn)酸菌在不同碳源培養(yǎng)基中生長狀況有顯著性差異，其中在可溶性淀粉培養(yǎng)基中細菌幾乎無生長，G17 在蔗糖培養(yǎng)基中生長量最高，而其他產(chǎn)酸菌則在麥芽糖培養(yǎng)基中生長最好，培養(yǎng)24 h 后OD600nm均達到7.0 以上（表3）。綜合比較，麥芽糖為產(chǎn)酸菌的最佳碳源。另一方面，產(chǎn)酸菌在硫酸銨為氮源的培養(yǎng)基中生長量極低，而在其他5 種氮源培養(yǎng)基中的生長量也存在顯著性差異，在培養(yǎng)24 h 后，OD600nm大小依次為酪蛋白胨＞酵母粉＞大豆蛋白胨＞胰蛋白胨（表4），因此酪蛋白胨為最佳氮源。但從性價比考慮，選用酵母粉為佳。7 種產(chǎn)酸菌均在C/N 為1∶3 的培養(yǎng)基中生長最好，顯著高于在其他C/N 比中的生長狀況（表5）。

表3 產(chǎn)酸菌在不同碳源培養(yǎng)基下培養(yǎng)24 h 的OD600 nm

表4 產(chǎn)酸菌在不同氮源培養(yǎng)基下培養(yǎng)24 h 的OD600 nm

表5 產(chǎn)酸菌在不同C/N 培養(yǎng)基下培養(yǎng)24 h 的OD600 nm

2.6 玉米秸稈青貯的pH 和有機酸含量

添加產(chǎn)酸菌的青貯和對照組相比飼料的pH 無顯著性差異，但添加產(chǎn)酸菌顯著提高了青貯中有機酸含量，并且混合菌的效果要好于單菌（表6）。其中，乳酸含量以添加植物乳桿菌+短乳桿菌的處理最高，乙酸含量以添加戊糖片球菌+短乳桿菌的處理最高，各處理中丙酸含量較少。除對照組之外，所有添加產(chǎn)酸菌的處理組均未檢測出異丁酸。

表6 玉米秸稈青貯飼草的pH 及有機酸含量

2.7 玉米秸稈青貯的營養(yǎng)成分

青貯發(fā)酵后各處理組干物質(zhì)含量均低于原料的干物質(zhì)含量（表7），添加植物乳桿菌+布氏乳桿菌的處理組干物質(zhì)含量顯著高于對照組（P＜0.05）。青貯后可溶性糖含量降低，添加短乳桿菌、植物乳桿菌、腸球菌、植物乳桿菌+短乳桿菌的可溶性糖含量顯著高于對照組（P＜0.05）。青貯后添加短乳桿菌的處理組酸性洗滌纖維含量與對照組差異不大，而其他各組酸性洗滌纖維含量均顯著低于對照組（P＜0.05）。添加布氏乳桿菌、短乳桿菌、植物乳桿菌+布氏乳桿菌的酸性洗滌木質(zhì)素與對照組無差異，其他各組酸性洗滌木質(zhì)素含量均顯著低于對照組（P＜0.05）。除了短乳桿菌處理組的粗纖維含量與對照組差異不顯著之外，其他各組粗纖維含量顯著低于對照組（P＜0.05）。添加菌劑可降低粗灰分的含量，各組與對照組差異顯著（P＜0.05）。此外，添加戊糖片球菌+植物乳桿菌的粗蛋白質(zhì)含量顯著低于對照組（P＜0.05），其余各組粗蛋白質(zhì)含量均顯著高于對照組（P＜0.05）。

表7 玉米秸稈青貯飼草的營養(yǎng)成分

2.8 玉米秸稈青貯的有氧穩(wěn)定性

青貯飼料暴露于空氣中，溫度上升到高于環(huán)境溫度2 ℃時所需的時間即為有氧穩(wěn)定性。對照組有氧穩(wěn)定性低于120 h，添加戊糖片球菌或腸球菌的處理組有氧穩(wěn)定性低于對照組，分別為93 h 和104 h，其余各組有氧穩(wěn)定性均高于對照組。添加單菌處理組中以布氏乳桿菌和短乳桿菌的有氧穩(wěn)定性較高，而添加混合菌處理組中則是植物乳桿菌+布氏乳桿菌、植物乳桿菌+短乳桿菌、布氏乳桿菌+短乳桿菌有氧穩(wěn)定性較高，其中布氏乳桿菌+短乳桿菌處理組有氧穩(wěn)定性最高，達192 h（圖4）。

圖4 不同處理組玉米秸稈青貯的有氧穩(wěn)定性

3 討論

3.1 不同發(fā)酵產(chǎn)品中產(chǎn)酸菌的多樣性

本研究從4 種自然發(fā)酵產(chǎn)品中共分離鑒定出8種不同種類的產(chǎn)酸菌，其中，構(gòu)樹葉青貯中分離出了彎曲乳桿菌、植物乳桿菌、短乳桿菌和戊糖片球菌，在燕麥青貯中主要分離出了彎曲乳桿菌、短乳桿菌和植物乳桿菌，泡菜中分離出了布氏乳桿菌和芽孢桿菌，鹽菜中分離出了芽孢桿菌、布氏乳桿菌、腸球菌和科氏葡萄球菌，表明同一自然發(fā)酵產(chǎn)品中以及不同自然發(fā)酵產(chǎn)品之間的產(chǎn)酸菌具有多樣性，各種發(fā)酵產(chǎn)品擁有的獨特風味則可能是多種產(chǎn)酸菌共同作用的結(jié)果。植物乳桿菌、彎曲乳桿菌、腸球菌和戊糖片球菌為同型發(fā)酵乳酸菌，該類乳酸菌一般具有較快的發(fā)酵特性，可以顯著降低青貯的pH，有效抑制腐敗菌活性，且調(diào)制的青貯飼草中營養(yǎng)物質(zhì)損失較小；短乳桿菌和布氏乳桿菌為異型發(fā)酵乳酸菌，能夠有效防止青貯開窖后的二次發(fā)酵，從而提高青貯有氧穩(wěn)定性和保存期［23，24］。本研究中還從泡菜和咸菜中還分離出一些屬于芽孢桿菌屬的產(chǎn)酸菌。Bacillus subtilis等芽孢桿菌通過分泌細菌素等抗真菌或抗細菌的成分，抑制植物病原菌的滋生，提高青貯產(chǎn)品有氧穩(wěn)定性，或者分泌纖維素酶等水解酶，提高青貯飼草的消化利用率，因此可以作為青貯添加劑使用［25-27］。本研究中分離到芽孢桿菌，其分泌乳酸以及乙酸、丙酸等揮發(fā)性有機酸，也將有助于提高青貯飼草的品質(zhì)。由于乳酸菌不形成芽孢，因此乳酸菌劑難以長期保存或長途運輸，導致其應用于生產(chǎn)中的成本較高，增加了推廣的難度［28］。而芽孢桿菌通常具有很強的抗逆性，能耐熱、紫外線以及多種溶劑和酸堿等，在保存和運輸過程中損失小，有利于保證菌劑的活性和降低其生產(chǎn)成本，提高青貯產(chǎn)品質(zhì)量［29，30］。

3.2 產(chǎn)酸菌的產(chǎn)酸特性

產(chǎn)酸菌的快速繁殖和青貯過程中pH 的快速降低是保證青貯發(fā)酵品質(zhì)的關(guān)鍵，因此理想的青貯菌劑應具有較高的產(chǎn)酸、耐酸能力且競爭力強，生長旺盛［31］。本研究中初步篩選出16 株產(chǎn)酸能力較強的菌株，其中植物乳桿菌G17 和Y17、彎曲乳桿菌G3、短乳桿菌Y4、布氏乳桿菌PC-C1、芽孢桿菌屬YC1-1-4 的生長及產(chǎn)酸速度快，發(fā)酵液的pH 在靜置培養(yǎng)24 h 后即可降至4.0 左右，有利于在青貯發(fā)酵初期就迅速抑制住酵母菌等其他好氧性雜菌的滋生。但是另一方面，較低的培養(yǎng)基起始pH 會嚴重制約產(chǎn)酸菌的生長，但不同菌種之間耐酸性有差異，例如植物乳桿菌G17 和Y17 對低pH 的耐受性較強，而彎曲乳桿菌耐受性較差，因此，在青貯過程中選擇適宜的起始pH 和產(chǎn)酸菌種有助于提高青貯飼草調(diào)制的成功率。

本研究中分離的產(chǎn)酸菌株在發(fā)酵過程中主要分泌乳酸、乙酸和丙酸等有機酸，而丁酸、異丁酸、戊酸等有機酸的產(chǎn)量很低，但不同菌株在有機酸含量上有所差別。乳酸和乙酸是降低青貯飼草pH 的主要因子［32］，屬于有益酸，而丁酸的含量則直接反映了青貯飼草的腐敗程度。在短鏈脂肪酸中，丙酸的抗真菌效果最佳，在抑制青貯飼草的好氧性腐敗方面具有良好的作用，且不影響青貯產(chǎn)品的發(fā)酵品質(zhì)，因此它可作為好氧微生物抑制劑應用于青貯調(diào)制過程中［33，34］。 G17、G3、Y4、PC-C1、YC1-1-4、YC2-6、G18 等菌株在有益有機酸（乳酸、乙酸和丙酸）總產(chǎn)量上占優(yōu)勢，在青貯調(diào)制中具有較大的應用潛力。

3.3 產(chǎn)酸菌對玉米秸稈青貯發(fā)酵品質(zhì)的影響

青貯發(fā)酵是一個復雜的生物化學過程，主要是附著在植物表面的乳酸菌利用可溶性碳水化合物生長繁殖，其代謝過程產(chǎn)生有機酸，能迅速降低飼料的pH，從而抑制有害微生物的生長，降低營養(yǎng)物質(zhì)的損耗。當飼料pH 低于臨界值4.2 時，發(fā)酵效果較好［35］。本研究中各處理組以及對照組青貯的pH 均低于4.2，因此添加菌劑對玉米秸稈青貯的pH 影響不大，但對青貯中有機酸的含量有顯著影響，本研究發(fā)現(xiàn)添加菌劑處理可以顯著提高乳酸的含量，有效改善青貯的發(fā)酵品質(zhì)。DM 含量直接反映了底物營養(yǎng)物質(zhì)的濃度，研究表明，添加乳酸菌菌劑可顯著提高青貯玉米中DM 的含量［36］，但本試驗中只有添加植物乳桿菌+布氏乳桿菌處理組中青貯的DM 含量高于對照組，添加戊糖片球菌+短乳桿菌的處理中與對照組無顯著差異，其余各處理組的DM 含量則顯著低于對照組。研究表明，當原料含糖量達到10%時，干物質(zhì)的損失主要是由于糖的降解。

粗纖維、酸性洗滌纖維和酸性洗滌木質(zhì)素是衡量飼料營養(yǎng)價值的重要指標，因此測定飼料中纖維含量及木質(zhì)素的含量尤為重要。CF、ADF 和ADL 與動物消化率呈負相關(guān)，青貯飼料中其含量越低，則飼料的消化率越高［37］。本研究中粗纖維、酸性洗滌纖維和酸性洗滌木質(zhì)素的含量均有不同程度的降低，其原因可能是由于青貯期間存在部分產(chǎn)纖維素酶的微生物，其在消耗飼料營養(yǎng)物質(zhì)進行代謝活動時產(chǎn)生纖維素酶，導致粗纖維和酸性洗滌纖維含量降低［38］。此外，有氧穩(wěn)定性也是評價飼料的一個重要指標，提高有氧穩(wěn)定性，防止進一步的干物質(zhì)和能量損失［39］。本研究發(fā)現(xiàn)所有添加了短乳桿菌或布氏乳桿菌的玉米秸稈青貯的有氧穩(wěn)定性與對照相比均有明顯提高，特別是添加短乳桿菌+布氏乳桿菌混合菌可以達到最佳的保護效果，因此這些產(chǎn)酸菌種在生產(chǎn)上有較高應用價值。

4 小結(jié)

本研究中分離篩選的 G3、G17、Y4、YC1-1-4、PC-C1 等菌株生長迅速，產(chǎn)酸快，且分泌的有益有機酸產(chǎn)量高，在玉米秸稈青貯調(diào)制過程中可以顯著地降低飼草的酸性洗滌纖維、酸性洗滌木質(zhì)素、粗纖維和粗灰分含量，并提高粗蛋白質(zhì)含量，特別是短乳桿菌Y4、布氏乳桿菌PC-C1 還可以明顯提高青貯飼草的有氧穩(wěn)定性，在農(nóng)作物秸稈飼草生產(chǎn)中應用潛力大。