陳杰鋒 高 艷

(無限極(中國)有限公司，廣東 廣州 510000)

金銀花為忍冬科植物，是一種常用的清熱去火中草藥，具有清熱解毒、疏散風熱的功效，多用于虛火上升、癰腫疔瘡、溫病發(fā)熱、熱毒血痢、風熱感冒等治療[1]。中草藥牙膏是我國口腔清潔護理用品行業(yè)的特色，牙齦炎、牙周炎、牙齦出血等炎癥而多為“上火”引起，在牙膏中添加金銀花，作為日常護理用品，可以輔助起到清熱去火、消炎等作用?，F(xiàn)代藥理研究表明金銀花提取物的主要成分是綠原酸，監(jiān)測牙膏中綠原酸含量，可以間接反應金銀花中草藥在牙膏中的含量以及穩(wěn)定性。因此，研究了牙膏中綠原酸含量的測定方法，用于檢測牙膏中綠原酸含量。

1 實驗和方法

1.1 儀器與材料

1)Agilent 1200Series高效液相色譜儀系統(tǒng)(G1329A ALS，G1311A Quat Pump，G1322A Degasser，G1316A TCC，G1315D DAD)；

2)梅特勒-托利多XSE205型電子天平(感量0.01mg)；

3)梅特勒-托利多ML204T型電子天平(感量0.1mg)；

4)昆山市超聲儀器有限公司KQ-400DE型數控超聲波清洗器；

5)Thermo Fisher Sorvall ST 16R離心機；

6)IKA MS3渦旋振蕩器；

7)綠原酸標準品(中國食品藥品檢定研究所，含量以96.1%計)；

8)植雅牙膏(規(guī)格：140克/支，無限極(中國)有限公司生產)；

9)乙腈(色譜純，默克股份兩合公司)；

10)甲醇(色譜純，默克股份兩合公司)；

11)磷酸(優(yōu)級純，天津市科密歐化學試劑有限公司)；

12)石英砂(分析純，廣州化學試劑廠)；

13)超純去離子水。

1.2色譜條件

1)色譜柱：Waters Xbridge C18(250mm×4.6mm，5μm)；

2)流動相：A相(乙腈)，B相(0.1%磷酸溶液)，梯度洗脫，見表1；

表1 流動相梯度洗脫表

3)流量：1.0 mL/min；

4)柱溫：30℃；

5)進樣量：20μL；

6)檢測波長：327nm。

1.3 標準品溶液的制備

綠原酸標準儲備溶液(1)：精密稱取綠原酸標準品10mg(精確至0.01mg)至50mL容量瓶中，用50%甲醇水溶液溶解并定容至刻度，搖勻，配制成200μg/mL標準儲備溶液(1)。

綠原酸標準儲備溶液(2)：準確吸取5mL濃度為200μg/mL的綠原酸標準儲備溶液(1)，于100mL容量瓶中，用50%甲醇水溶液定容至刻度，搖勻，配制成10μg/mL標準儲備溶液(2)。

1.4 供試品溶液的制備

稱取試樣1g(精確至0.1mg)于50mL具塞刻度離心管中，加入約1g石英砂，再準確加入甲醇-磷酸混合溶液(甲醇+磷酸+水=50+2+48，體積比)20mL，稱定質量，渦旋振蕩2min，35℃水浴中超聲提取30min，冷卻至室溫后用甲醇-磷酸混合溶液補足損失質量，5000r/min離心分離10min，取上清液經0.22μm微孔濾膜過濾，濾液作為試樣溶液上機待測。

1.5 測定和計算

按上述條件測定標準工作溶液和待測溶液，根據色譜峰的保留時間和紫外光譜圖定性，根據標準工作溶液濃度和色譜峰面積回歸直線方程定量，按公式(1)計算樣品中綠原酸的含量。

(1)

式中：X——試樣中綠原酸的含量，mg/kg；

C——從標準曲線中得出的綠原酸濃度，μg/mL；

V——試樣溶液的體積，mL；

m——試樣質量，g。

2 結果與討論

2.1 前處理條件的確定

2.1.1 提取溶劑的選擇

根據綠原酸的結構以及理化性質，對提取溶劑和提取方法進行考察，篩選合理的提取方法?？紤]到牙膏試樣在水中分散效果較好，本方法采用有機溶劑-水體系作為提取溶劑?？疾炝瞬煌壤募状妓芤汉鸵掖妓芤?30%，50%，70%，90%，100%)對含有綠原酸的牙膏試樣的提取效果，結果見圖1。使用甲醇水溶液作為溶劑時，甲醇比例從30%增大到50%，測得試樣中綠原酸含量逐漸增多，在50%時，測得含量最大值，繼續(xù)增大甲醇比例，測得綠原酸含量逐漸減少。使用乙醇水作為溶劑時，乙醇比例在30%時，測得含量最大值，繼續(xù)增大乙醇比例，測得綠原酸含量逐漸減少。綜合兩個溶劑體系對綠原酸的提取情況，使用50%甲醇水溶液測得的綠原酸含量最高。同時，考慮到牙膏一般具有較好的水分散性，提取溶劑中有機溶劑的比例越高，牙膏在提取溶劑中的分散效果越差。因此選擇50%甲醇-水溶液作為綠原酸的提取溶劑。另外，為了提高牙膏在提取溶劑中的分散效果，本次實驗選擇加入適量石英砂對牙膏試樣進行輔助分散。

圖1 不同比例有機溶劑水溶液的提取效果對比

2.1.2 提取溶劑中磷酸濃度的選擇

在提取溶劑中添加一定濃度的磷酸可使碳酸鈣基質牙膏溶解更充分，提高綠原酸的提取效率。本次實驗考察了在提取溶劑中添加不同濃度的磷酸(0%，0.5%，1%，2%，4%，6%)(體積分數)對含有綠原酸的牙膏試樣的提取效果，結果見圖2。隨提取溶劑中磷酸濃度逐漸增大，測得試樣中綠原酸含量逐漸增多，磷酸濃度在2%時，測得含量最大值，繼續(xù)增大磷酸濃度，測得綠原酸含量有所下降。因此選擇在提取溶劑添加磷酸的濃度為2%，即甲醇-磷酸-水溶液(50+2+48)(體積比)作為綠原酸的提取溶劑。

圖2 提取溶劑中不同磷酸濃度的提取效果對比

2.2 儀器色譜條件的確定

2.2.1 檢測波長的選擇

通過使用二極管陣列檢測器(DAD)對綠原酸標準品溶液在190～400nm波長范圍內進行掃描，結果顯示(見圖3)，綠原酸在紫外光327nm波長處有最大特征吸收，故本方法選擇327nm作為檢測波長。

圖3 綠原酸標準溶液的紫外吸收光譜圖

2.2.2 色譜柱的選擇

本實驗考察了Waters Xbridge C18、Agilent Eclipse Plus C18、Kromasil C18和 Acclaim 120 C18等不同型號相同規(guī)格(250mm×4.6mm，5μm)的C18色譜柱對綠原酸和試樣基質的分離效果。結果顯示，在優(yōu)化的流動相條件下各種C18色譜柱能實現(xiàn)綠原酸和試樣基質的有效分離，尤其使用Waters Xbridge C18(250mm×4.6 mm，5μm)色譜柱時，峰形尖銳對稱。綜合考慮，最終選擇使用C18色譜柱作為分離色譜柱。

2.2.3 流動相中磷酸濃度的選擇

綠原酸為含有羥基和鄰二酚羥基的強極性有機酸[2]，溶于水后會出現(xiàn)部分解離，容易產生主峰拖尾現(xiàn)象，在流動相中加入一定比例的酸，能抑制酸解離，有助于提高主峰與干擾峰的分離度，改善峰形[3,4]。本實驗考察了乙腈-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.2%磷酸溶液、乙腈-0.4%磷酸溶液3種流動相體系對綠原酸和試樣基質的分離效果。結果顯示，三種磷酸濃度的流動相體系采用梯度洗脫均能夠實現(xiàn)綠原酸和試樣基質的良好分離，考慮到流動相的酸性較大可能會對色譜柱的性能和使用壽命造成一定影響。因此，本方法采用乙腈-0.1%磷酸為流動相。

2.3 線性范圍與檢出限

分別精密量取1.3步驟中綠原酸標準儲備溶液(2)0.3mL、0.5mL、1.0mL、2.0ml、5.0mL置于10mL容量瓶中，用50%甲醇水溶液稀釋至刻度，配制成濃度為0.3μg/mL、0.5μg/mL、1.0μg/mL、2.0μg/mL、5.0μg/mL標準工作溶液系列，依前述色譜條件進行測定。記錄色譜峰峰面積，以標準工作溶液濃度(μg/mL)為橫坐標，峰面積為縱坐標，進行線性回歸，得出綠原酸的回歸方程為：

y=36.11088x-0.51537

R2=0.9999

由以上回歸方程可知綠原酸在0.3μg/mL～5.0μg/mL之間呈良好線性關系。

取牙膏試樣按1.4步驟制備待測溶液，通過將該測試溶液逐級稀釋并上機測試，測定目標物的信噪比(S/N)，將所得信噪比大于3時對應的稀釋后濃度作為方法的檢出濃度。結果顯示，本方法的檢出濃度為0.026μg/mL。當試樣稱樣量為1g，溶液定容體積為20mL時，方法檢出限為0.52mg/kg(此檢出限為采用安捷倫品牌二極管陣列檢測器測試所得，如采用其他品牌二極管陣列檢測器開展測試，應重新確定檢出限，以實際測試值為準)。

2.4 方法特異性

本實驗分別考察了3種基質牙膏(二氧化硅基質、碳酸鈣基質和磷酸氫鈣基質)陰性樣品和添加綠原酸標準品后的色譜圖。結果如圖4～9所示，表明三種基質中存在的物質對本方法目標檢測物質沒有干擾。

圖4 二氧化硅基質(陰性樣品)牙膏溶液譜圖

2.5 重復性試驗

分別平行稱取三種不同基質牙膏試樣6份，依照1.4步驟制備的供試品溶液，依前述色譜條件進樣測定綠原酸含量，結果見表2。6次進樣測得三種不同基質牙膏中綠原酸含量平均值分別為16.6mg/kg、16.2mg/kg、10.6mg/kg，RSD分別為1.6%、1.1%、2.4%。結果表明，該方法重復性良好。

圖5 二氧化硅基質(陰性樣品)牙膏加標溶液譜圖

圖6 碳酸鈣基質(陰性樣品)牙膏溶液譜圖

圖7 碳酸鈣基質(陰性樣品)牙膏加標溶液譜圖

圖8 磷酸氫鈣基質(陰性樣品)牙膏溶液譜圖

圖9 磷酸氫鈣基質(陰性樣品)牙膏加標溶液譜圖

表2 試樣重復性測定結果

2.6 中間精密度試驗

由不同操作人員A、B，分別對同一批次牙膏試樣平行稱取試樣6份，依照1.4步驟制備供試品溶液，依前述色譜條件進樣測定綠原酸含量，結果見表3。測得牙膏試樣中綠原酸含量的平均值分別為16.2mg/kg和16.3mg/kg，RSD為1.0%。結果表明，該方法中間精密度良好。

表3 綠原酸含量測定的中間精密度實驗數據

2.7 準確度(回收率)試驗

分別平行稱取3種基質(二氧化硅、碳酸鈣、磷酸氫鈣)牙膏試樣(陽性樣品)各9份，每份約0.5g(稱樣量減半)，共3組，分別定量加入綠原酸標準溶液，添加濃度水平為試樣本底含量的50%、100%、150%，按1.4步驟處理后進行上機測定，結果見表4～6。從表中可看出，三種基質牙膏試樣在不同濃度下的平均加標回收率為95.8%～101.7%，相對標準偏差為0.7%～2.3%。結果表明，本方法準確可靠，精密度高。

表4 二氧化硅基質牙膏試樣加標回收率測定結果

表5 碳酸鈣基質牙膏試樣加標回收率測定結果

表6 磷酸氫鈣基質牙膏試樣加標回收率測定結果

2.8 穩(wěn)定性試驗

取牙膏試樣按1.4步驟制備供試品溶液，依前述的色譜條件在0h、6h、12h、18h、24h分別進樣，測定綠原酸含量，結果見表7。牙膏試樣中綠原酸含量平均值為16.1mg/kg，RSD為1.0%，結果表明，在24小時內供試品溶液穩(wěn)定性良好。

表7 放置時間對綠原酸測試結果的影響

2.9 樣品測試

分別取6個不同批次牙膏試樣，依照1.4步驟制備供試品溶液，上機進樣測定綠原酸含量，結果分別見表8。

表8 牙膏試樣中綠原酸含量測定結果

3 討論

本研究根據綠原酸的結構及理化性質，對提取溶劑和提取方法進行了系統(tǒng)考察，并結合牙膏試樣在水中分散效果較好的特點，通過實驗最終選擇50%甲醇-水溶液作為提取溶劑。同時，通過實驗證明，在提取溶劑中添加2%磷酸(體積分數)可使碳酸鈣基質牙膏溶解更充分，有效提升綠原酸的提取效率。

經反復實驗，最終確定使用Waters Xbridge C18(250mm×4.6mm，5μm)色譜柱；流動相為乙腈(A)-0.1%磷酸(B)，梯度洗脫：0～10min(12%A)，10～20min(90%A)，20～25min(12%A)；流速1.0mL/min；柱溫：30℃；檢測波長327nm；進樣量：20μL。結果表明，此方法條件下綠原酸色譜峰形較理想，分離效果好，綠原酸質量濃度在0.3μg/mL～5.0μg/mL范圍內與其峰面積呈良好的線性關系(R2= 0.9999)，將該方法應用于牙膏試樣的測定，其方法特異性、重復性、中間精密度、穩(wěn)定性、準確度良好，添加3個濃度水平的平均加標回收率為95.8%～101.7%，RSD為0.7%～2.3%。

本實驗針對不同基質的牙膏試樣，利用高效液相色譜法(HPLC)建立了靈敏、準確、簡便測定牙膏中綠原酸含量的檢測方法，可作為天然本草牙膏中關鍵功效成分的質量控制方法，在中草藥牙膏產品的安全質量和應用研究領域發(fā)揮作用。