陳阿梅，溫金玉，黃俊祥，成小芳，阮秀杭，方美娥，魏新華

帕金森病(Parkinson′s disease，PD)是一種常見的神經(jīng)退行性疾病[1]，其主要病理特征為中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元變性及黑質(zhì)殘存神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)路易小體，其中路易小體的形成是由于α突觸核蛋白(α-α-synuclein，α-syn)的產(chǎn)生和清除不平衡導(dǎo)致異常蛋白沉積所致[2-3]。

一直以來，學(xué)術(shù)界認(rèn)為中樞神經(jīng)系統(tǒng)缺乏淋巴系統(tǒng)。2012年Iliff等[4]在小鼠中首次證實(shí)了中樞神經(jīng)系統(tǒng)中也有類似淋巴管的結(jié)構(gòu)存在，并將其命名為類淋巴系統(tǒng)或膠質(zhì)淋巴系統(tǒng)(glymphatic system)。其后的研究進(jìn)一步證實(shí)了膠質(zhì)細(xì)胞終足上的一些水通道蛋白(aquaporin，AQP)介導(dǎo)了腦實(shí)質(zhì)與血管周圍間隙之間的液體交換和物質(zhì)清除[5-6]。然而，包括釓對(duì)比劑在內(nèi)的示蹤劑鞘內(nèi)注射為有創(chuàng)性檢查方法，因此，建立一種非侵入性的方法來評(píng)估人類的類淋巴系統(tǒng)具有重要意義。

近年來，MRI已逐漸被應(yīng)用于無創(chuàng)性評(píng)估腦類淋巴系統(tǒng)[7]。Taoka等[8]提出了一種新的非侵入性方法——血管周圍間隙擴(kuò)散張量成像分析(diffusion tensor image analysis along the perivascular space, DTI-ALPS)來評(píng)估人腦的類淋巴系統(tǒng)的功能。隨后，此方法被應(yīng)用于癡呆、特發(fā)性快動(dòng)眼睡眠障礙和2型糖尿病等多種疾病[9-11]。但至今僅有少數(shù)幾項(xiàng)研究中使用DTI-ALPS方法來評(píng)估PD患者類淋巴系統(tǒng)的活性[12-13]，且均為小樣本研究，研究結(jié)果尚待進(jìn)一步證實(shí)。本研究利用PD相關(guān)數(shù)據(jù)庫中的DTI圖像，通過計(jì)算血管周圍間隙擴(kuò)散指數(shù)(ALPS-index)來評(píng)估類淋巴系統(tǒng)的功能，并分析此指數(shù)與PD患者疾病嚴(yán)重程度、臨床指標(biāo)及腦脊液生物標(biāo)志物的相關(guān)性，旨在進(jìn)一步探討類淋巴系統(tǒng)在PD發(fā)病機(jī)制中的作用。

材料與方法

1.病例資料

將153例PD患者和59例健康志愿者(health control，HC)納入本研究。所有受試者的MRI和臨床數(shù)據(jù)來自于帕金森病進(jìn)展標(biāo)記物研究項(xiàng)目(Parkinson′s Progression Markers Initiative，PPMI)數(shù)據(jù)庫(www.ppmi-info.org/data)，其中PD組納入的是新診斷和未接受治療的PD患者的基線數(shù)據(jù)。PPMI數(shù)據(jù)庫為多中心縱向數(shù)據(jù)庫，每個(gè)PPMI中心的此項(xiàng)研究獲得其相應(yīng)的倫理委員會(huì)的審核批準(zhǔn)，所有受試者在參與本計(jì)劃前簽署了書面知情同書。

所有受試者有完整的MRI資料(包括3D T1WI和DTI)及腦脊液生物標(biāo)志物[包括β淀粉樣蛋白(amyloid-β,Aβ)42、α-突觸核蛋白(α-synuclein,α-syn)、總tau蛋白(total tau protein,t-tau)、磷酸化tau蛋白(phosphorylated tau protein，p-tau)]檢測結(jié)果。每例被試接受多種認(rèn)知和運(yùn)動(dòng)測試量表的評(píng)估以全面分析神經(jīng)心理狀況，主要包括霍普金斯語言學(xué)習(xí)測試(Hopkins Verbal Learning Test，HVLT)(包含即刻/總回憶測試、辨別記憶測試、維持記憶測試)、蒙特利爾認(rèn)知功能評(píng)估(Montreal Cognitive Assessment，MoCA)、狀態(tài)-特質(zhì)焦慮問卷(State-Trait Anxiety Inventory，STAI)、 老年抑郁量表(The Geriatric Depression Scale，GDS)、賓夕法尼亞大學(xué)嗅覺識(shí)別測試(University of Pennsylvania Smell Identification Test，UPSIT)、統(tǒng)一帕金森病分級(jí)量表(Unified Parkinson′s Disease Rating Scale，UPDRS)第1～3部分和全部(total)、以及H-Y分級(jí)量表(Hoehn and Yahr stages)。

2.檢查方法

使用Siemens MAGNETOM Skyra 3.0T MRI掃描儀。掃描序列及參數(shù)如下。①DTI： TE 88 ms，TR 500～9000 ms，體素大小2.0 mm×2.0 mm×2.0 mm，采集矩陣1044×1044，層數(shù)72，采集了b=0 s/mm2和64個(gè)擴(kuò)散敏感梯度方向的b=1000 s/mm2圖像；②3D-T1WI：TE 2.98 ms，TR 2300.00 ms，體素大小1.0 mm×1.0 mm×1.0 mm，采集矩陣240×256。采集參數(shù)和詳細(xì)協(xié)議可在PPMI網(wǎng)站上獲得。參與PPMI項(xiàng)目的每個(gè)研究中心的工作人員均接受了培訓(xùn)，以確保MRI數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)化采集。在隨后的數(shù)據(jù)分析中，剔除了數(shù)據(jù)缺失的受試者。

3.圖像后處理和評(píng)價(jià)

所有MRI圖像由兩位有多年神經(jīng)影像學(xué)診斷經(jīng)驗(yàn)的放射科醫(yī)師分別進(jìn)行評(píng)估，他們不了解每例患者的臨床信息，如兩者的意見不同則請(qǐng)第3位副主任及以上放射科醫(yī)師共同協(xié)商確定。

基于DTI數(shù)據(jù)，使用FSL軟件生成擴(kuò)散張量圖像，包括彩色編碼的各向異性分?jǐn)?shù)(fractional anisotropy，F(xiàn)A)圖和擴(kuò)散率(diffusivity，D)圖?；诿繋瑪U(kuò)散率圖像(FSL軟件自動(dòng)生成)，可分別獲得X、Y和Z軸方向上的擴(kuò)散率。由于在側(cè)腦室體部層面上，血管周圍間隙(perivascular space，PVS)的方向垂直于側(cè)腦室壁(多為左右方向/X軸方向)，該方向也垂直于投射(projection)纖維(主要為Z軸方向)及聯(lián)合(asso-ciation)纖維的方向(主要為Y軸方向)，因此，投射和聯(lián)合纖維沿X軸方向的擴(kuò)散率至少部分代表沿PVS方向的擴(kuò)散率。在FA偽彩圖側(cè)腦室體部層面，于左半球(所有受試者為右利手)的投射纖維、聯(lián)合纖維 和皮層下纖維區(qū)域分別勾畫一個(gè)直徑為5 mm的ROI(圖1a)，可分別獲得每種纖維在X軸、Y軸和Z軸方向上的擴(kuò)散率(圖1b)。

圖1 側(cè)腦室體部層面3種神經(jīng)纖維走行示意圖[8]。a)各向異性分?jǐn)?shù)(FA)偽彩圖顯示了3種纖維的走行方向，投射纖維為Z軸方向(藍(lán)色)，聯(lián)合纖維(綠色)為Y軸方向，皮層下纖維(紅色)為X軸方向，在3種纖維內(nèi)分別放置1個(gè)直徑為5mm的ROI來測量其擴(kuò)散系數(shù)； b)圖中為血管周圍間隙的方向(灰柱)與3種神經(jīng)纖維走向的關(guān)系，血管周圍間隙的方向垂直于投射纖維和聯(lián)合纖維。

使用Image J圖像處理工具，通過計(jì)算ALPS指數(shù)來評(píng)估類淋巴系統(tǒng)的功能。根據(jù)Taoka等[8]的研究，該指標(biāo)由4個(gè)擴(kuò)散系數(shù)值的比值所得，計(jì)算公式如下：

(1)

其中Dxxproj和Dxxassoc分別為投射纖維和聯(lián)合纖維的Dxx值(Dxx表示在X軸方向上的擴(kuò)散率)，Dyyproj為投射纖維在Y軸方向上的擴(kuò)散率，Dzzassoc為聯(lián)合纖維在Z軸方向上的擴(kuò)散率。

4.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 23.0軟件對(duì)2組受試者的人口統(tǒng)計(jì)學(xué)及臨床量表評(píng)分進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料先進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，計(jì)數(shù)資料采用構(gòu)成比(百分率)表示。連續(xù)變量的組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或非參數(shù)秩和檢驗(yàn)(Mann-WhitneyU)，分類變量的組間比較采用卡方檢驗(yàn)。采用Pearson或Spearman相關(guān)分析對(duì)PD患者的DTI-ALPS指數(shù)與年齡、性別及受教育年限的相關(guān)性進(jìn)行分析，控制年齡和性別因素后，采用Pearson偏相關(guān)分析對(duì)PD患者的DTI-ALPS指數(shù)與臨床量表評(píng)分及腦脊液生物標(biāo)記物之間的相關(guān)性進(jìn)行檢驗(yàn)。采用雙側(cè)檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

PD組和HC組的臨床特征及組間比較結(jié)果見表1。兩組間年齡、性別構(gòu)成比及受教育年限的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。PD組的STAI評(píng)分高于HC組(P=0.04)，而兩組的HVLT、MoCA、GDS和UPSIT評(píng)分的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。兩組的Aβ42、a-syn、t-tau和p-tau濃度及t-tau/Aβ42、p-tau/Aβ42的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 PD組和HC組的臨床特征及組間比較結(jié)果

HC組和PD組的ALPS指數(shù)平均值分別為1.508±0.316和1.389±0.218。與HC組比較，PD組的ALPS指數(shù)值明顯減低，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=3.769，P<0.001)。

相關(guān)性分析結(jié)果：PD組中，ALPS指數(shù)值與UPDRS-Ⅲ評(píng)分呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.245，P=0.002；圖2a)，與年齡呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.256，P=0.001；圖2b)，與腦脊液p-tau濃度呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.357，P<0.001；圖2c)，與性別、受教育年限、HVLT評(píng)分(即刻/總回憶評(píng)分、辨別記憶評(píng)分、維持記憶評(píng)分)、MoCA評(píng)分、UPDRS-Ⅰ評(píng)分、UPDRS-Ⅱ評(píng)分、UPDRS-Ⅲ評(píng)分、UPDRS總分及H-Y分級(jí)均無顯著者相關(guān)性(P>0.05)，與Aβ42、a-syn和t-tau濃度及Aβ42/t-tau、Aβ42/p-tau均無顯著相關(guān)性(P>0.05)。

圖2 相關(guān)性分析散點(diǎn)圖。a)PD組ALPS指數(shù)值與UPDRS-Ⅲ評(píng)分呈顯著負(fù)相關(guān)；b)PD組ALPS指數(shù)值與年齡呈負(fù)相關(guān)；c)PD組ALPS指數(shù)值與腦脊液p-tau濃度呈負(fù)相關(guān)。

討 論

腦類淋巴系統(tǒng)是最近發(fā)現(xiàn)的大腦廢物排泄系統(tǒng)[4,14]。腦脊液(cerebrospinal fluid，CSF)沿大腦表面動(dòng)脈及穿支小動(dòng)脈走行的血管周圍間隙(paravascular space)流入腦實(shí)質(zhì)，并在此與間質(zhì)液(interstitial fluid,ISF)進(jìn)行交換，然后CSF/ISF混合液流出至靜脈的血管周圍間隙并最終流出大腦。其中，血管周圍間隙是由內(nèi)側(cè)的動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞和外側(cè)的血管周圍星形膠質(zhì)細(xì)胞終足構(gòu)成。而終足上的一些水通道蛋白(aquaporin，AQP)，如AQP4，介導(dǎo)腦實(shí)質(zhì)與血管周圍間隙的液體交換。

有研究顯示腦類淋巴系統(tǒng)促進(jìn)β淀粉樣蛋白等可溶性蛋白的排出，促進(jìn)葡萄糖、脂質(zhì)、氨基酸和神經(jīng)調(diào)質(zhì)的分布[14]。Iliff等[4]首次使用雙光子顯微鏡對(duì)在小鼠體內(nèi)對(duì)類淋巴系統(tǒng)的動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了示蹤研究，將熒光示蹤劑注入枕大池后，發(fā)現(xiàn)腦脊液沿著皮層動(dòng)脈迅速進(jìn)入大腦實(shí)質(zhì)。除了熒光材料外，在后續(xù)的動(dòng)物研究中釓對(duì)比劑被用作示蹤劑，經(jīng)鞘內(nèi)注射后，也可顯示類淋巴系統(tǒng)的動(dòng)力學(xué)[15]。但上述方法均為侵入性手段。

2017年Taoka等[8]提出了一種非侵入性方法——沿血管周圍間隙擴(kuò)散張量成像分析(DTI-ALPS)來評(píng)估人腦類淋巴系統(tǒng)的活動(dòng)。這種方法基于擴(kuò)散張量成像，通過測量擴(kuò)散率來評(píng)估水分子在血管周圍間隙不同方向上的運(yùn)動(dòng)。在側(cè)腦室體部水平，髓靜脈垂直于側(cè)腦室壁，血管周圍間隙與髓靜脈方向一致，為左右方向(X軸)；投射纖維在側(cè)腦室旁沿頭-足方向走行，聯(lián)合纖維中的上縱向束(uperior longitudinal fascles,SLFs)在投射纖維外側(cè)沿前-后方向走行，皮層下纖維主要在皮層下區(qū)域沿左-右方向走行。因此，在這個(gè)區(qū)域，血管周圍間隙垂直于投射纖維和聯(lián)合纖維，當(dāng)觀察到投射纖維或聯(lián)合纖維的擴(kuò)散率發(fā)生變化時(shí)，可以推斷這種變化有一部分原因來自于血管周圍間隙(即類淋巴系統(tǒng))的病理變化。

既往的研究中已觀察在一些神經(jīng)退行性疾病的患者中，腦組織中的蛋白質(zhì)廢物的清除減少[16]。Taoka等[8]報(bào)道伴有輕度認(rèn)知障礙的阿爾茨海默病患者的ALPS指數(shù)值下降，有可能是由于腦脊液中的Aβ異常沉積抑制了類淋巴系統(tǒng)的運(yùn)輸功能。然而，支持帕金森病患者存在類淋巴系統(tǒng)功能障礙的研究相對(duì)較少。Zou等[17]發(fā)現(xiàn)A53T小鼠PD模型的類淋巴系統(tǒng)功能出現(xiàn)減退，免疫熒光檢查顯示AQP4主要分布在α-syn陽性的神經(jīng)元周圍，提示類淋巴系統(tǒng)AQP4的異常分布與α-syn沉積有關(guān)。為進(jìn)一步探討AQP4對(duì)α-syn的清除作用，該團(tuán)隊(duì)研究人員比較了AQP4基因敲除小鼠和野生型小鼠類淋巴系統(tǒng)的清除效率，結(jié)果表明AQP4的缺失會(huì)降低α-syn在腦內(nèi)的清除速率，說明a-syn的清除速率降低與類淋巴系統(tǒng)的功能障礙密切相關(guān)，這可能是PD發(fā)生的一個(gè)促進(jìn)因素。Ma等[18]根據(jù)HY分期，將PD患者分為早期和晚期2組，結(jié)果顯示PD患者的ALPS指數(shù)值低于HC組，尤其是因晚期PD組的ALPS指數(shù)值顯著低于HC組(P=0.006)。在本研究中，PD組ALPS指數(shù)值明顯低于HC組，與上述研究結(jié)果一致，進(jìn)一步證實(shí)了DTI-ALPS指數(shù)值降低所反映的類淋巴系統(tǒng)功能障礙可能參與了PD的發(fā)病機(jī)制。

本研究結(jié)果顯示PD組的DTI-ALPS指數(shù)值與年齡呈負(fù)相關(guān)，提示在類淋巴系統(tǒng)功能的下降中患者年齡可能也是影響因素。既往有研究結(jié)果表明，在大腦衰老過程中，高血壓和AQP-4水通道蛋白的丟失可能會(huì)影響局部間質(zhì)內(nèi)液體的引流，并影響α-syn的清除，其中血管周圍間隙是一個(gè)重要的通路[19]。另外，有證據(jù)表明，類淋巴通路循環(huán)是由動(dòng)脈搏動(dòng)、血管慢速運(yùn)動(dòng)、呼吸運(yùn)動(dòng)和腦脊液壓力等多種因素驅(qū)動(dòng)的[16]。隨著年齡增大，動(dòng)脈粥樣硬化導(dǎo)致的動(dòng)脈搏動(dòng)減弱有可能降低類淋巴系統(tǒng)活性、影響代謝產(chǎn)物及異常蛋白的清除[20]。 Ma等[18]的研究結(jié)果顯示，PD晚期組的ALPS指數(shù)值與年齡呈負(fù)相關(guān)，與我們的結(jié)果一致。但年齡是否為類淋巴系統(tǒng)功能降低的獨(dú)立危險(xiǎn)因子，尚需排除其他混雜因素進(jìn)一步證實(shí)。

目前尚無DTI-ALPS指數(shù)值與UPDRS評(píng)分相關(guān)的直接證據(jù)，但另一項(xiàng)來自PPMI數(shù)據(jù)庫的研究結(jié)果顯示左側(cè)基底節(jié)的血管周圍間隙負(fù)擔(dān)與MDS-UPDRS III評(píng)分存在顯著相關(guān)性[21]。本研究中，校正年齡及性別因素后，DTI-ALPS指數(shù)值與MDS-UPDRS-Ⅲ評(píng)分呈顯著負(fù)相關(guān)，提示DTI-ALPS指數(shù)可以反映PD患者運(yùn)動(dòng)癥狀的嚴(yán)重程度和進(jìn)展情況。前期多項(xiàng)研究結(jié)果顯示ALPS指數(shù)值與認(rèn)知水平相關(guān)，如Chen等[12]對(duì)25例認(rèn)知功能正常的PD患者、25例伴有輕度認(rèn)知功能障礙的PD患者和38例伴有癡呆的PD患者以及47例健康對(duì)照者進(jìn)行對(duì)照研究，結(jié)果顯示輕度認(rèn)知功能障礙的PD患者PD-MCI組和伴有癡呆的PD患者的ALPS指數(shù)值明顯低于正常對(duì)照組。另一項(xiàng)研究在校正了年齡、性別后建立單變量一般線性模型，亦顯示認(rèn)知功能正常組與AD組(P<0.026)和輕度認(rèn)知障礙組(P<0.025)的DTI-ALPS指數(shù)值有顯著差異。然而，本研究中DTI-ALPS指數(shù)值與MoCA基線評(píng)分無顯著相關(guān)性(P>0.05)，分析原因有可能是本研究中納入的均為初始診斷為PD的患者，因此大部分患者的認(rèn)知功能尚無明顯下降，不能代表全部PD患者群體。

tau是一種微管相關(guān)蛋白，在一些神經(jīng)退行性疾病中其可能被釋放到細(xì)胞外空間。α-synuclein可以加速tau的磷酸化，tau可破壞軸突運(yùn)輸，并導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)α-syn的進(jìn)一步聚集[22]。p-tau被認(rèn)為比總tau更有害，在阿爾茨海默病患者中發(fā)現(xiàn)了其濃度明顯升高[23]。盡管存在這些機(jī)制聯(lián)系，但幾項(xiàng)關(guān)于腦脊液tau蛋白在PD病理進(jìn)程中作用的研究得出了相互矛盾的結(jié)果[24-25]。本研究在校正年齡、性別及受教育年限后，觀察到PD患者的DTI-ALPS指數(shù)與腦脊液p-tau濃度呈顯著負(fù)相關(guān)，在近期的一項(xiàng)研究中通過路徑分析證實(shí)腦脊液內(nèi)的tau部分介導(dǎo)了血管周圍間隙對(duì)PD患者認(rèn)知結(jié)局的影響[21]，但其在PD發(fā)病機(jī)制中的作用仍需進(jìn)一步研究。

本研究有以下幾點(diǎn)局限性。首先，我們的方法只能計(jì)算X、Y、Z軸三個(gè)方向上的擴(kuò)散率，因此，在血管周圍間隙不沿X、Y或Z軸方向走行的區(qū)域，或血管周圍間隙與主導(dǎo)纖維束方向平行的區(qū)域，不能進(jìn)行獨(dú)立評(píng)估；第二，ROI是人工放置的，可能有存在主觀因素導(dǎo)致的偏倚；第三，我們沒有考慮任何其它生理因素的影響，包括腦血流灌注或腦脊液搏動(dòng)等，但本研究中使用高b值(b=1000 s/mm2)DTI，可以部分抵消生理狀態(tài)的影響；最后，本研究為橫斷面研究，尚需在今后進(jìn)行縱向研究，進(jìn)一步探討類淋巴系統(tǒng)功能在帕金森病進(jìn)展過程中的時(shí)間變化軌跡。

總之，本研究結(jié)果顯示，PD患者的DTI-ALPS指數(shù)值明顯低于正常對(duì)照組，并且與疾病嚴(yán)重程度、年齡增長和腦脊液p-tau濃度呈顯著正相關(guān)，提示DTI-ALPS指數(shù)可以反映腦類淋巴系統(tǒng)活性，并有可能成為診斷和監(jiān)測PD進(jìn)展的潛在神經(jīng)影像學(xué)標(biāo)志物。