趙應(yīng)龍，馬真明，張曉梅，于青越，吳俊達(dá)，王國君，張以芳，柴俊

(1.永平縣杉陽鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)綜合服務(wù)中心畜牧獸醫(yī)組，云南 永平 672607；2.尋甸縣塘子街道辦事處農(nóng)業(yè)綜合服務(wù)中心畜牧科，云南 尋甸 655203； 3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650201)

豬鏈球菌病(Swine Streptococcosis)是由多種致病性鏈球菌所致的豬不同臨床類型多種疾病的總稱[1]。導(dǎo)致該病的鏈球菌主要包括豬鏈球菌、馬鏈球菌中的類馬亞種和獸疫亞種以及蘭氏分群中的D、E、L群鏈球菌[2]。所有致病性鏈球菌中豬鏈球菌2型(Streptococcus suis serotype 2)致病力最強，分離和檢出率也最高[3]。臨床上，豬只感染豬鏈球菌2型后的癥狀主要包括出血性敗血癥、腦膜炎、關(guān)節(jié)炎、心包炎、化膿性淋巴結(jié)炎等[4]。鏈球菌本為革蘭氏陽性菌，但在長期放置的培養(yǎng)基、陳舊的膿液標(biāo)本中可表現(xiàn)為革蘭氏陰性[5]，該種改變對病原的診斷會造成一定的影響。豬鏈球菌病屬我國二類動物疫病，可感染各年齡階段的豬，對人體也有一定的危害，屬人獸共患病[6]。

豬只對鏈球菌的抵抗力最差，且鏈球菌病的發(fā)生不隨地域區(qū)別和品種差異而有所區(qū)別[7]。豬鏈球菌病急性型表現(xiàn)為體溫升高至40～41.5℃，呈稽留熱，患病豬只脖頸、耳廓、下腹部及四肢末端的皮膚有出血斑點并呈現(xiàn)暗紅色，天然孔道有不易凝固的暗紅色血液流出[8]。急性病變均可轉(zhuǎn)化為慢性病變，患病豬只全身關(guān)節(jié)多有漿液纖維素性炎癥，從而導(dǎo)致豬只行走時疼痛、跛行、喜臥、難以站立等。患病較為嚴(yán)重的豬只甚至出現(xiàn)后肢癱瘓、麻痹，最終死亡[9]。此外，該病可感染特定人群，如生豬飼養(yǎng)員、獸醫(yī)、屠宰人員等并導(dǎo)致死亡[10]。該病不僅對世界養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展造成嚴(yán)重威脅，也會危害人類的健康，應(yīng)引起人們的高度關(guān)注。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

大理州某豬場送檢的具有敗血癥、心包炎、關(guān)節(jié)炎等癥狀的病豬肝臟、脾臟組織及關(guān)節(jié)液樣品。

1.2 主要試劑

營養(yǎng)肉湯、血瓊脂培養(yǎng)基按常規(guī)方法配置；革蘭氏染色劑、細(xì)菌DNA提取試劑盒、凝膠DNA回收試劑盒、2×Taq Super Mix、Nuclease-free Water、DL-5000 marker、瓊脂糖均購自北京全式金生物技術(shù)股份有限公司。參考鏈球菌16S rRNA序列設(shè)計檢測引物一對，引物序列如下，16S-F：5′-AGAGGTTGATCCTGGCTCAG-3′；16S-R：5′-GGTTAGCTTGTTACGACTT-3′，預(yù)期擴增出1 130bp的目的條帶，引物由擎科生物公司合成。

1.3 細(xì)菌的分離純化及鏡檢

首先在無菌環(huán)境下將病豬的肝臟、脾臟組織樣品剪碎同關(guān)節(jié)液樣品一起放入營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，于37℃恒溫振蕩器中過夜培養(yǎng)擴菌，然后將菌液用平板劃線法接種于血瓊脂培養(yǎng)基上，于37℃恒溫培養(yǎng)18～24h，觀察菌落形態(tài)，挑取單個可疑菌落進行純培養(yǎng)及革蘭氏染色鏡檢。

1.4 細(xì)菌的PCR擴增、測序及分子鑒定

按細(xì)菌基因組RNA試劑盒說明書，對分離純化培養(yǎng)的菌液進行基因組RNA提取，提取的RNA進行16S rRNA擴增。PCR反應(yīng)總體系25μL：2×Taq Super Mix 12.5μL、上下游引物各1μL、RNA模板1μL、Nuclease-free Water 9.5μL，瞬時離心；PCR反應(yīng)條件為：94℃ 10min，94℃ 30s、57℃ 30s、72℃ 2min，30個循環(huán)，72℃ 10min；PCR擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，陽性樣品膠回收送擎科生物科技有限公司進行測序，測序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行比對分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)及鏡檢結(jié)果

經(jīng)營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基擴增的菌液劃線于血瓊脂培養(yǎng)基上，37℃恒溫培養(yǎng)24h后可見直徑約1mm、表面稍凸、光滑潮濕、邊緣整齊、呈灰白色半透明狀的圓形菌落，且在菌落周圍形成1～2mm寬的完全透明的溶血環(huán)，即典型的β型溶血(圖1)。

圖1 分離菌株在血瓊脂培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)

從血瓊脂培養(yǎng)基上挑取單個可疑菌落進行革蘭氏染色鏡檢，可觀察到有成對或3～5個排列的藍(lán)紫色短鏈狀、大小均一的革蘭氏陽性球菌(圖2)。

圖2 分離菌株的革蘭氏染色鏡檢結(jié)果

2.2 分離菌株P(guān)CR鑒定結(jié)果

PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，可見目的條帶約為1 130 bp，與預(yù)期條帶相符，大小與陽性對照片段相同(圖3)。測序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行比對分析后與豬鏈球菌2型的同源性為99.9%。

3 討論

豬鏈球菌的血清型較多，其中1、2、7、9型較為常見，2型是最常見的一種[11]。該病原可通過破損的皮膚和黏膜傷口進入機體的血液和淋巴循環(huán)從而造成嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致較高的發(fā)病率和死亡率[12]。有研究結(jié)果顯示，豬鏈球菌對常用的四環(huán)素類藥物和大環(huán)內(nèi)酯類藥物有較高的耐藥性[13]，且存在多重耐藥性和耐藥基因遺傳的情況[14]。因此，快速進行疾病的病原診斷以及藥敏試驗篩選出敏感藥物才能有效控制疾病。此外，要控制本病不僅需要根據(jù)當(dāng)?shù)亓餍芯昝舾兴幬镆约坝行Ф鄡r疫苗的篩選來制定合理的免疫程序，按時進行免疫接種，還需要加強飼養(yǎng)管理，改善飼養(yǎng)環(huán)境，對病死豬進行無害化處理，定期對欄舍進行消毒，積極治療才能最大程度地減少養(yǎng)殖戶的損失。