馮 景，鄧衍明，齊香玉，陳雙雙，陳慧杰，劉廷利

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院休閑農(nóng)業(yè)研究所/江蘇省高效園藝作物遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210014)

圓錐繡球(HydrangeapaniculataSieb.)為繡球花科(Hydrangeaceae)繡球?qū)俾淙~灌木或小喬木，原產(chǎn)中國，其植株高大、花量多、花期長、適應(yīng)性強(qiáng)、觀賞價(jià)值高，在歐美、日本已大量應(yīng)用于庭院及園林綠化中；此外，圓錐繡球全株含粘液可做糊料，藥用有清熱抗瘧、預(yù)防糖尿病腎病等效果[1-2]。秋季盛花期后，圓錐繡球花的顏色逐漸從綠色轉(zhuǎn)為古銅色，且宿留枝頭長久不落，非常適合做干花。

種子的形態(tài)特征是鑒定種或品種的重要依據(jù)，它不僅表達(dá)了較為穩(wěn)定的遺傳信息，而且與種子的傳播、貯藏、萌發(fā)等過程密切相關(guān)。萌發(fā)吸水是種子由休眠狀態(tài)轉(zhuǎn)變到生活狀態(tài)的重要階段，種皮的機(jī)械障礙通過影響種子的吸水、透氣功能來阻礙種子的萌發(fā)。如夏蠟梅種子外種皮致密堅(jiān)硬，透水能力較差，通過刻傷種皮，可加速吸水從而打破休眠[3]。除了種子自身的遺傳特性外，外界環(huán)境條件也影響著種子的萌發(fā)情況。種子在成熟、收獲及貯藏過程中均會(huì)受微生物侵染，在環(huán)境適宜條件下會(huì)造成種子霉?fàn)€乃至死亡[4]。貯藏溫度與種子含水量是種子活力保持的兩個(gè)重要條件，研究表明，低溫貯藏有利于保持種子的生活力，種子的耐貯性一般隨貯藏溫度降低而提高，種子含水量每下降1%和溫度每下降10 ℃，種子可以貯藏的時(shí)間就增加一倍，而發(fā)芽率無明顯降低[5]。劉燕等[6]對18個(gè)科47種園林花卉種子進(jìn)行了液氮超低溫貯藏，結(jié)果表明45種花卉種子保存后都有一定發(fā)芽率且超低溫保存對一些花卉種子萌發(fā)表現(xiàn)出促進(jìn)作用。

通常認(rèn)為自然條件下繡球由于自交不親和而不能結(jié)實(shí)，故生產(chǎn)上以扦插、分株、組織培養(yǎng)等無性繁殖為主。目前，對繡球的研究集中在栽培技術(shù)、生理生化、分子機(jī)制、花色調(diào)控等方面[7-11]。然而，人們對圓錐繡球種子生物學(xué)特性方面的研究甚少，對其結(jié)實(shí)特性、種子是否能夠正常萌發(fā)及萌發(fā)所需要的環(huán)境條件等均不甚清楚，這在某種程度上限制了圓錐繡球種苗的培育和產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。此外，前期試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)圓錐繡球‘石灰燈’能夠自然結(jié)實(shí)，但在種子萌發(fā)過程中霉變、腐爛現(xiàn)象嚴(yán)重，導(dǎo)致種子發(fā)芽率極低。因此，本文對圓錐繡球‘石灰燈’種子的形態(tài)特征及種子萌發(fā)特性進(jìn)行研究，以期為其種質(zhì)資源的保存、優(yōu)良實(shí)生種苗繁育和雜交育種提供理論依據(jù)和技術(shù)指導(dǎo)，并為繡球?qū)僦参锓N子學(xué)研究提供新的資料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

圓錐繡球‘石灰燈’(H.paniculataSieb. ‘Limelight’)果實(shí)于2021年1月采收于江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院院內(nèi)(32°02′06.6″N，118°52′19.1″E)，經(jīng)室溫自然風(fēng)干后，先搖動(dòng)果序使部分種子散出，再把剩下果實(shí)置于研缽中輕輕碾碎果皮，并用50目篩網(wǎng)篩出飽滿的種子用于試驗(yàn)。收集好的種子置于4 ℃冰箱備用。

1.2 研究方法

1.2.1 種子千粒重及形態(tài)觀 隨機(jī)選取300粒種子，分別測量其長度和寬度，精確到0.01 mm；采用百粒法測定種子的千粒重，即從混合均勻的種子中隨機(jī)抽取100粒，重復(fù)5次，使用千分之一電子天平分別稱重后計(jì)算種子千粒重；隨機(jī)抽取種子30粒，用體視顯微鏡(SZX10, OLYMPUS Co., Tokyo, Japan)觀察種子外部形態(tài)并拍照，然后用刀片剖開，在相差顯微鏡(BX43, OLYMPUS Co., Tokyo, Japan)下觀察種子的發(fā)育狀況并區(qū)分飽滿種子，干癟種子和空粒種子，統(tǒng)計(jì)種子的飽滿率。

1.2.2 種子含水量的測定 參照國際種子檢驗(yàn)規(guī)程[12]，采用高溫烘干法，取1 g種子于(130±2) ℃烘箱烘 4 h，按下式計(jì)算種子含水量MC(%)=(W2-W3)/(W2-W1) × 100。 式中，W1為樣品盒及盒蓋的烘干質(zhì)量(g)，W2為干燥前樣品盒、蓋及樣品的質(zhì)量(g)，W3為干燥后樣品盒、蓋及樣品的質(zhì)量(g)。重復(fù)3次，取平均值。

1.2.3 種子吸水率測定 隨機(jī)抽取50粒種子，置于盛有超純水的離心管中，在25 ℃條件下進(jìn)行吸水試驗(yàn)。吸水過程中，每隔24 h將種子取出后用濾紙吸干表面水分，于千分之一電子天平上稱質(zhì)量，直至恒質(zhì)量，重復(fù)3次。以種子初始含水量經(jīng)換算得到種子在各吸水時(shí)間的含水量。另外計(jì)算種子不同時(shí)間的吸水率(%)：IFW=[(Wt-W0)/W0]× 100。式中，Wt為吸水時(shí)間t時(shí)的種子質(zhì)量，W0為種子吸水前的初始質(zhì)量)。重復(fù)3次，取平均值。

1.2.4 貯藏溫度對種子萌發(fā)的影響 設(shè)置4，-18,-70 ℃貯藏溫度處理，以室溫為對照(CK)，處理時(shí)間為30 d。根據(jù)國際種子檢驗(yàn)規(guī)程[12]，隨機(jī)抽取各處理的種子50粒，置于放有浸濕脫脂棉的培養(yǎng)皿內(nèi)，在25 ℃恒溫光照培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)，重復(fù)3次。以胚根突破種皮且長度超過2 mm為發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)，以連續(xù)5 d內(nèi)沒有新萌發(fā)種子作為發(fā)芽試驗(yàn)截止時(shí)間。試驗(yàn)結(jié)束后計(jì)算發(fā)芽率(GR)、污染率(CR)、平均發(fā)芽時(shí)間(MGT)[13]及發(fā)芽速度(SG)[14]。其中，GR=n/N×100%(式中，n為30 d內(nèi)發(fā)芽的種子數(shù)，N為供試種子數(shù))；CR=c/N×100%(式中，c為30 d內(nèi)污染的種子數(shù)，N為供試種子數(shù))；MGT=∑[(Dn)/∑n](式中，n為在Dd發(fā)芽的種子數(shù)，D為開始發(fā)芽的天數(shù))；SG= ∑(n/D)(式中，n為在Dd發(fā)芽的種子數(shù)，D為開始發(fā)芽的天數(shù))。

1.2.5 消毒處理對種子萌發(fā)的影響 選用75% C2H5OH和15% NaClO作為種子消毒劑，根據(jù)不同消毒時(shí)間共設(shè)置6個(gè)處理(見表1)，以僅用超純水處理的種子作為對照(CK)。處理后進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)，條件同貯藏溫度對種子萌發(fā)影響的試驗(yàn)，發(fā)芽結(jié)束后計(jì)算發(fā)芽率、污染率。

表1 消毒處理

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS(版本23.0)和EXCEL(版本2019)軟件進(jìn)行分析。使用單因素方差分析(ANOVA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，隨后進(jìn)行Duncan多重比較，P<0.05表示差異顯著。

a 成熟蒴果；b 吸水前的種子，種皮呈網(wǎng)脊?fàn)睿籧 吸水后的種子；d胚根先端突破種孔；e 胚軸伸長； f 子葉露出；g 幼莖；h 初生葉；i 主根與側(cè)根；j 無胚種子；k 剖開的正常種子，可見胚分化完全并充滿種腔；i 正常胚(左)與畸形胚(右)；m 完整幼苗。標(biāo)尺：a：1 mm；b—j：0.5 mm；l：0.2 mm；m：5 mm。圖3 圓錐繡球‘石灰燈’種子萌發(fā)過程中的形態(tài)特征

2 結(jié)果與分析

2.1 種子的形態(tài)特征

圓錐繡球‘石灰燈’種子呈長柱型，扁平狀，兩端細(xì)長；種皮木質(zhì)化，網(wǎng)脊型[15]，深褐色具光澤；種子合點(diǎn)端具翅并延伸至珠孔端；成熟種子胚乳飽滿，乳白色或淡黃色，胚白色，直立，嵌入到胚乳中，幾乎充滿種腔(如圖1)。種子平均大小為2.43 mm(長) × 0.69 mm(寬)，種子千粒重為(0.21±0.02) g，種子飽滿率為(26.33±1.72)%。

圖1 圓錐繡球‘石灰燈’種子形態(tài)及結(jié)構(gòu)示意圖

2.2 種子吸水率

圓錐繡球‘石灰燈’種子的初始含水量為4.3%。由圖2可知，種子的吸水過程可分為3個(gè)階段：第1階段為開始吸水后的24 h內(nèi)，種子吸水率快速上升至28.0%，主要是由種子吸脹作用所致；第2階段為24—48 h，種子吸水率繼續(xù)上升，但速度趨緩；第3階段為48—114 h，種子吸水量基本不再增加，吸水速率處于基本穩(wěn)定的狀態(tài)；其中，吸水率在96 h時(shí)達(dá)到最大值，為37.7%，此時(shí)種子達(dá)到吸水飽和狀態(tài)。從種子吸水的整個(gè)過程來看，圓錐繡球‘石灰燈’種子吸脹作用時(shí)間較短，表明其種皮透水性良好。

圖2 圓錐繡球‘石灰燈’種子吸水率的變化

2.3 種子萌發(fā)特性

圓錐繡球‘石灰燈’種子于25 ℃條件下吸水3 d時(shí)，種皮舒展，胚乳中的水分趨向飽和，組織處于吸脹狀態(tài)(圖3-c)；4 d時(shí)，種子珠孔處開裂，胚根先端突破種孔(圖3-d)；6 d左右，胚軸伸長，胚部組織從種皮裂縫中開始顯現(xiàn)出來(即露白)(圖3-e)；種子萌動(dòng)后，種胚細(xì)胞開始加速分裂和分化，生長速度顯著加快，子葉生長增粗的同時(shí)，子葉下部明顯伸長，并將胚根和胚軸繼續(xù)向種皮外推出(圖3-f)；胚根繼續(xù)伸長，胚乳逐漸被消耗，10 d左右，子葉從種皮內(nèi)露出；當(dāng)胚根、子葉發(fā)育到一定程度，極性分化明顯，子葉向上長，胚根向下長，胚根繼續(xù)增粗伸長，形成主根；20 d左右，隨著幼根的繼續(xù)伸長，上胚軸及幼莖呈淡綠色(圖3-g)；幼莖繼續(xù)向上生長，先出葉對生，卵圓形，先端漸尖(圖3-h)；待葉片慢慢長大，質(zhì)地由柔軟逐漸變硬，顏色也由淺綠色逐漸變?yōu)樯罹G色，23 d左右即可形成健壯幼苗(圖3-m)。種子萌發(fā)進(jìn)程見表2。

表2 圓錐繡球‘石灰燈’種子萌發(fā)進(jìn)程

由表3可知，隨著貯藏溫度下降，種子發(fā)芽率呈上升趨勢；-70 ℃條件下，種子發(fā)芽率為12.7%，顯著高于4 ℃處理(6.0%，P<0.05)。同時(shí)，-70 ℃件下污染率最低，為41.3%，顯著低于其他處理。不同貯藏溫度下種子的平均發(fā)芽時(shí)間(MGT)與發(fā)芽速度(SG)均不存在顯著性差異，但以-70 ℃處理下的發(fā)芽速度最高且污染率最低。

表3 貯藏溫度對圓錐繡球‘石灰燈’種子萌發(fā)的影響

由表4可以看出，種子經(jīng)75% C2H5OH和15% NaClO分別處理不同時(shí)間后，污染率均顯著低于對照，發(fā)芽率均顯著高于對照。其中，75% C2H5OH處理中，隨著消毒時(shí)間的延長，種子污染率顯著下降，而發(fā)芽率無明顯變化；15% NaClO處理中，隨著消毒時(shí)間的延長，外種皮明顯褪色，種子污染率與發(fā)芽率均無顯著性差異，但15% NaClO處理3 min后種子發(fā)芽率最高，為22.7%。與未經(jīng)消毒處理的種子相比，發(fā)芽率提高了15.3 %，污染率降低了47.7%。

表4 不同消毒處理下圓錐繡球‘石灰燈’種子污染和發(fā)芽情況

3 討論與結(jié)論

許多種子利用休眠來避開逆境，只有當(dāng)生存環(huán)境變得適宜時(shí)才發(fā)芽。種子形態(tài)學(xué)和生理學(xué)的性質(zhì)決定了休眠類型[16-18]。Baskin把休眠分為5大類即生理休眠(physiological dormancy，PD)、形態(tài)休眠(morphological dormancy，MD)、形態(tài)生理休眠(morphophysiological dormancy，MPD)、物理休眠(physical dormancy，PY)和聯(lián)合休眠(PY+PD)[19]。通常認(rèn)為大部分落葉灌木的種子都具有生理休眠特性，需要低溫層積來打破休眠，促進(jìn)萌發(fā)。低溫層積的時(shí)間因植物種類的不同而不同，一般為30—181 d。已有研究表明喬木繡球(H.arborescens)種子沒有休眠(ND)[20]，而攀援繡球(H.serratifolia)種子具有生理休眠(PD)[21]。但對于圓錐繡球種子是否具有休眠尚存在爭議。Greer等[22]認(rèn)為圓錐繡球‘Big Ben’和‘Pink Diamond’種子具有生理休眠(PD)，需低溫層積42 d打破休眠；但Lu等[23]認(rèn)為圓錐繡球種子沒有休眠。本研究發(fā)現(xiàn)，圓錐繡球種子成熟時(shí)蒴果頂端開裂，這種小而有翅的種子容易被風(fēng)傳播；果實(shí)成熟后胚已分化完全，即具有胚根、胚軸和子葉，且充滿整個(gè)種腔，表明其不存在形態(tài)休眠。同時(shí)，種子吸水后種皮膨脹、軟化，可以使更多的氧透過種皮進(jìn)入種子內(nèi)部，啟動(dòng)萌發(fā)過程，種子在48 h時(shí)基本達(dá)到吸水飽和狀態(tài)，吸脹時(shí)間較短，表明其種皮透水性良好，故不存在機(jī)械障礙。此外，本試驗(yàn)對未萌發(fā)種子解剖發(fā)現(xiàn)，大部分為無胚種子，無胚率為67%—80%，其余為無活力(胚畸形)的種子。因此，本研究表明圓錐繡球‘石灰燈’種子沒有休眠，其萌發(fā)率低的原因主要在于種子發(fā)育不良且污染率較高。

因外部環(huán)境條件、母株?duì)I養(yǎng)狀況、受精后胚胎敗育等因素，均能導(dǎo)致癟?；驘o胚種子。無胚現(xiàn)象在自交與雜交過程中普遍存在，如蘭科植物自交所產(chǎn)生的果實(shí)中接近2/3的種子無胚或胚畸形[24-25]，楸樹早期表現(xiàn)的近交衰退作用致使大量胚珠在合子分裂前敗育，從而造成雜交種子飽滿率、發(fā)芽率低[26]。繡球種子產(chǎn)量通常很低(0—5粒飽滿種子/果實(shí))[27]，Reed等[28]人對圓錐繡球3個(gè)品種自花授粉后結(jié)實(shí)和幼苗萌發(fā)情況的研究表明，自花授粉后可形成果實(shí)，但絕大部分(90 %)種子敗育，只有1個(gè)品種的種子萌發(fā)且發(fā)芽率僅為11.2%。這與本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)種子飽滿率低、發(fā)芽率低的現(xiàn)象相符合，但與陸乙卜等[29]對圓錐繡球種子發(fā)芽率的研究結(jié)果(80%以上)有不同。分析認(rèn)為，這可能是由于試驗(yàn)所用品種差異或采種時(shí)間不同所致。

種子貯藏可以最大限度地延長種子壽命，對種質(zhì)資源的保存具有重要意義。溫度和含水量是種子在貯藏期間保持活力的2個(gè)關(guān)鍵因素。正常種子成熟時(shí)含水量極低，在低溫下能夠長期而穩(wěn)定地保存。本試驗(yàn)中種子初始含水量為4.2%，在4種貯藏溫度貯藏1個(gè)月后，-70 ℃貯藏溫度下污染率顯著低于其他3個(gè)溫度處理。雖然-70 ℃處理下種子發(fā)芽率與4 ℃處理間存在顯著性差異，但種子平均發(fā)芽時(shí)間與發(fā)芽速度并無明顯變化，這可能是本試驗(yàn)貯藏時(shí)間較短，4種處理溫度均能較好地保持種子活力所致。

不同植物種子適用的表面消毒劑不同。發(fā)芽前對種子進(jìn)行消毒處理，選擇合適的消毒劑和消毒時(shí)間是降低污染率、提高發(fā)芽率的關(guān)鍵因素之一。判斷某種消毒方法是否合適，要綜合考慮發(fā)芽率、污染率、平均發(fā)芽時(shí)間、發(fā)芽速度等因素[30]。本研究發(fā)現(xiàn)，消毒后‘石灰燈’種子培養(yǎng)過程中仍極易遭受污染，盡管在污染狀態(tài)下有些種子仍能萌發(fā)，但幼苗極易死亡。有研究表明未經(jīng)消毒處理的圓錐繡球種子萌發(fā)時(shí)的污染率高達(dá)100%[29]。本試驗(yàn)結(jié)果也表明，未經(jīng)消毒處理的種子污染率在60%以上，這可能是圓錐繡球‘石灰燈’種子本身帶菌較多所致。大花繡球與圓錐繡球種間雜交試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，內(nèi)生菌存在于胚珠表面是造成雜種成活率低的主要原因[31]，也從側(cè)面證實(shí)了這一點(diǎn)。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)15% NaClO消毒3 min效果最好，且種子的發(fā)芽率最高；與未經(jīng)消毒處理的種子相比，種子發(fā)芽率提高了15.3%，污染率降低了47.7%。因此，15% NaClO消毒3 min是圓錐繡球‘石灰燈’種子適宜的消毒方法。