武穎

（德州市城市園林規(guī)劃設(shè)計研究院，山東德州 253000）

菊花屬菊科多年生宿根草本植物，是我國四大傳統(tǒng)名花（牡丹、菊花、山茶、水仙）之一，也是花中“四君子”（梅、蘭、竹、菊）之一，自古以來就深受國人喜愛。我國有重陽節(jié)賞菊花、飲菊花酒的習俗，菊花栽培種植歷史悠久，品種資源豐富，文化內(nèi)涵深遠，具有較強的觀賞價值和經(jīng)濟價值。菊花傳統(tǒng)繁殖方式多采用扦插繁殖和分株繁殖，繁殖周期長，受季節(jié)限制較大。近年來，隨著植物組織培養(yǎng)技術(shù)的快速發(fā)展，因其在產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)、品種脫毒等方面的優(yōu)勢，也成為菊花新優(yōu)品種、名貴稀有品種繁殖的重要途徑。菊花品種“粉十八”花瓣面為玫粉紅色，背粉白色，平瓣，瓣面上玫粉紅色間有白色暈斑或紅白暈染，瓣根多為白色。筒狀花發(fā)達，露心，花姿艷麗，猶如一名翩翩起舞的少女，極具觀賞價值，適合家庭盆栽養(yǎng)殖。本研究以“粉十八”莖尖、莖段為外植體，對其進行離體組織培養(yǎng)研究。

1 菊花組織培養(yǎng)概念和優(yōu)勢

1.1 菊花組織培養(yǎng)的概念

菊花組織培養(yǎng)技術(shù)，是指選取菊花莖段、莖尖、葉片、花蕾、花藥等作為外植體，消毒處理后接種于人工配制、添加不同激素的培養(yǎng)基上進行誘導(dǎo)，建立無菌體系，使其再生形成完整植株的技術(shù)方法。該技術(shù)依賴于植物細胞的全能性，通過組織培養(yǎng)可以得到完整的菊花植株。

1.2 菊花組織培養(yǎng)的優(yōu)勢

菊花的繁殖方法較多，傳統(tǒng)方法多采用扦插繁殖和分株繁殖，傳統(tǒng)繁殖需要大量母本植株，周期長，受季節(jié)和環(huán)境限制大。另外，菊花病毒病種類多，使用攜帶病毒的母本進行扦插，會引起病毒病的擴張和蔓延，從而導(dǎo)致幼苗質(zhì)量差，優(yōu)良品種長此以往會發(fā)生退化現(xiàn)象。采用菊花組培技術(shù)，繁殖系數(shù)高、生長周期短，可在短時間內(nèi)繁殖出大量生長一致的組培苗，還可進行品種的脫毒、復(fù)壯、種質(zhì)資源保存，保持品種特性。培養(yǎng)條件既可人為控制，管理方便，又可擺脫自然地理環(huán)境和季節(jié)的限制，有利于工廠化生產(chǎn)和自動化控制等。利用組織培養(yǎng)技術(shù)，還能解決因長期采用扦插和分株繁殖導(dǎo)致的種性退化、產(chǎn)量下降等問題。

2 材料與方法

2.1 試驗材料

采用錦繡川景區(qū)菊花養(yǎng)殖基地春季新生長出的“粉十八”嫩莖作為外植體進行試驗，屬于植物器官培養(yǎng)。春季是植物生長發(fā)育的黃金季節(jié)，取幼齡生長健壯的外植體更容易誘導(dǎo)成功。在晴朗天氣采集可減小外植體消毒難度，最大程度減少外植體污染，有利于建立無菌體系，外植體采集后應(yīng)盡快處理，放置過久生物活性會下降。從植物體上切割分離下來用以無菌培養(yǎng)的部分稱為外植體，外植體是用于組培快繁的初代接種材料，包括植物細胞、器官、組織或原生質(zhì)體[1]。外植體的選擇是組織培養(yǎng)試驗重要的基礎(chǔ)性環(huán)節(jié)，對建立無菌體系及能否成功誘導(dǎo)出愈傷組織或不定芽起著重要作用。選擇時需考慮植物品種、年齡及生長狀態(tài)等多方面因素，通常選用易于消毒、代謝旺盛、有較強再生能力的組織或器官作為外植體[2]。

2.2 試驗方法與設(shè)計

2.2.1 不同滅菌處理對外植體的影響。將采集到的“粉十八”頂端幼嫩莖段于清水沖洗30min，剪去葉片，放置于超凈工作臺，用70%～75%的酒精消毒10s。酒精穿透力強，對植物細胞具有較大殺傷力，幼嫩的植物器官應(yīng)合理控制消毒時間，消毒后立即放入滅菌劑進一步消毒。0.1%升汞溶液，分別處理3min、5min、8min；2%次氯酸鈉溶液，分別處理8min、10min、15min；10%次氯酸鈉溶液，分別處理5min、7min、10min。為使滅菌劑更好地浸潤外植體，在滅菌劑中添加幾滴0.1%吐溫-80，消毒期間輕輕晃動盛放消毒液和外植體的器皿，使消毒液與植物材料充分接觸。

2.2.2 接種。外植體經(jīng)過處理后，在無菌條件下放置于培養(yǎng)基上的過程稱為接種。外植體消毒處理后，用無菌水沖洗4～6 次，直至無菌水中不見泡沫。無菌濾紙吸干水分后切成1cm 的莖尖和莖段，用消毒后的鑷子夾住，垂直插入啟動培養(yǎng)基，莖段至少應(yīng)攜帶1 個莖節(jié)，接種時插入深度不可淹沒莖節(jié)。每個培養(yǎng)瓶最好只接1 個外植體，最多不超過3 個，避免相互污染。接種操作在超凈工作臺進行，外植體消毒后應(yīng)立即接種于啟動培養(yǎng)基，如若不能馬上接種，應(yīng)浸潤于無菌水中，時間不宜過長。

2.2.3 不同激素濃度對外植體初代啟動的影響。將“粉十八”外植體切成1～1.5cm 帶芽莖段，接種于啟動培養(yǎng)基，外植體不宜過大。啟動培養(yǎng)基中添加6-BA（濃度分別 為2.0mg/L、1.0mg/L、0.5mg/L）、NAA（濃度分別為0.3mg/L、0.2mg/L、0.1mg/L）2 種激素，共9 種培養(yǎng)基。每種培養(yǎng)基接種30 個外植體，重復(fù)3 次，通過試驗觀察不同激素濃度和配比誘導(dǎo)外植體的效果。

2.2.4 不同激素濃度對繼代培養(yǎng)的影響?！胺凼恕鼻o段啟動培養(yǎng)后得到無菌側(cè)芽，但數(shù)量有限，需轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，獲得大量叢生芽，即繼代培養(yǎng)，將啟動培養(yǎng)得到的叢生芽切割成單個轉(zhuǎn)接于繼代培養(yǎng)基。無菌材料在適宜的環(huán)境和營養(yǎng)條件下，可通過調(diào)節(jié)激素濃度和不同類型激素的相對配比，人為控制增殖系數(shù)。繼代培養(yǎng)基中添加不同濃度和配比的6-BA（濃度分別為2.0mg/L、1.0mg/L、0.5mg/L）和NAA（濃度分別為0.05mg/L、0.1mg/L、0.2mg/L）2 種激素，共9 種培養(yǎng)基，每種培養(yǎng)基接種30 個無菌芽，重復(fù)3 次，觀察記錄其增殖效果。

2.2.5 不同激素濃度對生根培養(yǎng)的影響。繼代培養(yǎng)得到的叢生芽，轉(zhuǎn)接于生根培養(yǎng)誘導(dǎo)生根。菊花容易生根，采用1/2 MS+NAA 0.02mg/L、1/2 MS+NAA 0.2mg/L 及不添加任何激素的MS 培養(yǎng)基3 種生根培養(yǎng)基，剪切生長健壯的叢生芽于生根培養(yǎng)基，7d 后觀察其生根情況。

2.2.6 培養(yǎng)條件。試驗獲得的無菌瓶苗放置于無菌培養(yǎng)室進行培養(yǎng)，無菌培養(yǎng)室溫度23～28℃，室內(nèi)相對濕度70%～80%，人工補光，光照2000Lux，每天光照14h。

2.2.7 生根苗移栽。生根培養(yǎng)2 周后，挑選健壯的無菌苗進行移栽，根系長度不宜太長，以不在培養(yǎng)基中彎曲為宜。因無菌培養(yǎng)室與大田環(huán)境存在較大差異，為保證無菌苗在大田環(huán)境能夠正常成活并生長，移栽前需煉苗。先在栽培場所封口煉苗7d，開蓋繼續(xù)煉苗3d，最后用鑷子小心夾出生根苗，清洗根部培養(yǎng)基后，種植于添加種植基質(zhì)的穴盤，放置20～30d，溫室15～35℃，相對濕度達70%以上，待其成活并正常生長后定植于大田，正常養(yǎng)護。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同滅菌劑濃度和滅菌時間對外植體消毒的影響

外植體消毒所使用的滅菌劑，既要起到滅菌作用，又不能傷害植物活性。由表1 可知，經(jīng)0.1%升汞溶液處理的“粉十八”莖尖全部失活；莖段經(jīng)升汞溶液處理5min、8min 后，均失去活性；莖段用0.1%升汞溶液處理3min 后，污染率為40%，浪費嚴重，達不到最佳滅菌效果。此外，升汞屬于劇毒藥劑，殘留不易去除，對外植體活性具有殺傷力，且會對環(huán)境造成嚴重傷害。因此，本試驗采用的幼嫩莖尖、莖段不宜采用升汞作滅菌劑處理。

表1 0.1%升汞溶液處理“粉十八”外植體污染率

由表2 可知，2%次氯酸鈉對外植體活性殺傷力較小，但污染率高。處理外植體8min 污染率為100%；處理莖尖、莖段10min 外植體污染率分別為86.6%、80%；處理莖尖、莖段15min 外植體污染率分別為63.6%、50%。

表2 2%次氯酸鈉溶液處理“粉十八”外植體污染率

次氯酸鈉消毒液對外植體殺傷力小，殘留少，適宜的濃度和時間也能起到良好的滅菌作用。由表3 可知，用10%次氯酸鈉溶液處理莖段10min，污染率僅為6.7%。綜合考慮，莖段經(jīng)酒精短暫處理后，用10%次氯酸鈉溶液消毒10min，是最佳的外植體消毒方法。

表3 10%次氯酸鈉溶液處理“粉十八”外植體污染率

3.2 不同激素濃度對外植體初代啟動的影響

外植體接種于啟動培養(yǎng)基后，基部膨大形成愈傷組織，腋芽在激素的刺激下萌發(fā)，愈傷組織繼續(xù)培養(yǎng)可長出綠色叢芽。由表4 可知，啟動培養(yǎng)基中NAA 濃度超過0.2mg/L 時，外植體基部分化出較多愈傷組織，但芽誘導(dǎo)率低，無法誘導(dǎo)出健壯側(cè)芽。當NAA 濃度為0.1mg/L，誘導(dǎo)出的側(cè)芽長勢健壯，生長速度快。但高濃度的6-BA會導(dǎo)致玻璃化，6-BA 濃度為2.0mg/L 時，普遍存在玻璃化現(xiàn)象。當培養(yǎng)基中激素濃度為 MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L 時，平均芽誘導(dǎo)率達到100%，且芽壯，顏色呈深綠色，生長速度快，適合作為“粉十八”啟動培養(yǎng)基。

表4 不同激素濃度對外植體啟動培養(yǎng)的影響

3.3 不同激素濃度對繼代培養(yǎng)的影響

由表5 可知，當增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.05mg/L 和 MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.1mg/L 時，增殖系數(shù)分別為5.83、4.2，轉(zhuǎn)接后的無菌芽2 周后長出深綠色、健壯的叢生芽，4 周后即可達到重復(fù)轉(zhuǎn)接或生根水平。當培養(yǎng)基中6-BA 濃度為1.0mg/L 時，葉片卷曲、生長緩慢，6-BA 濃度為2.0mg/L 時，葉片畸形，玻璃化現(xiàn)象較重。由此可知，6-BA 雖然可以促進芽的形成、側(cè)芽的生長，但濃度過高不利于植物正常生長。如果生長素比例大，則不定芽生長健壯，而增殖系數(shù)較低，達不到快速繁殖的目的。如果只用細胞分裂素，植株增殖系數(shù)雖大，但組培苗較細弱，需加入生長素以促進莖生長，需要一個壯苗的過程[3]。只有將二者比例調(diào)整到適宜水平，才能使健壯的不定芽快速增殖。

表5 不同激素濃度對繼代培養(yǎng)的影響

3.4 不同激素濃度對生根培養(yǎng)的影響

根據(jù)試驗，生根培養(yǎng)基為 1/2MS+NAA 0.02mg/L，1/2MS+NAA 0.2mg/L 時，7d 后無菌瓶苗均長出1cm 的白色不定根，且瓶苗顏色深綠，長高趨勢明顯，莖部長粗，葉片更加肥厚，適宜作為“粉十八”無菌瓶苗生根誘導(dǎo)的培養(yǎng)基。菊花易生根，空白MS 培養(yǎng)基作為生根培養(yǎng)基也可長出根系。在空白培養(yǎng)基培養(yǎng)10d 開始長出白色不定根，但生長速度緩慢，無法達到壯苗目的。

3.5 移栽大田后成活率

生根苗經(jīng)馴化后定植于大田，小苗生長健壯，葉色深綠，成活率可達95%。

4 結(jié)語

“粉十八”是菊花十八系列之一，花瓣少，基部白色筒狀，花瓣自基部延伸開展變大，黃色花心外露，花為奶白色，上面有淡紫紅色條紋或色暈，花瓣呈輻射狀略下垂，花姿奇特優(yōu)美，極具觀賞價值。由于分枝較少，無法為扦插繁殖提供大量母本，因而繁殖成活率低。本研究采用組織培養(yǎng)的方式，在MS 培養(yǎng)基中添加6-BA、NAA 2 種激素，探索不同激素濃度和配比，對誘導(dǎo)側(cè)芽、大量分化叢生芽的效果，并誘導(dǎo)生根、移栽馴化，試圖通過組培打破季節(jié)限制，短時間內(nèi)得到大量生長一致的幼苗。

試驗成功的關(guān)鍵在于激素的濃度和配比，啟動培養(yǎng)階段的NAA 濃度過高，會誘導(dǎo)產(chǎn)生大量愈傷組織，但愈傷組織包裹住原有外植體，無法分化形成不定芽；而6-BA 濃度過高，又會引起玻璃化，不利于轉(zhuǎn)接后的增殖。試驗結(jié)果表明，啟動階段MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L 時，可誘導(dǎo)腋芽萌發(fā)，獲得健壯的無菌芽，為后續(xù)繼代培養(yǎng)提供無菌體系。

繼代培養(yǎng)時，6-BA 濃度應(yīng)比啟動培養(yǎng)基低，有利于誘導(dǎo)形成大量叢生芽。6-BA 濃度過高既會引起玻璃化現(xiàn)象，又會導(dǎo)致葉片卷曲，甚至出現(xiàn)畸形，植株生長緩慢。試驗發(fā)現(xiàn)，繼代培養(yǎng)基中，激素濃度為啟動培養(yǎng)基的一半時，可取得較好的誘導(dǎo)叢芽效果，即培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.05mg/L 時，可誘導(dǎo)出健壯的叢芽，增殖系數(shù)也能滿足生產(chǎn)需求。菊花易生根，為實現(xiàn)生根和壯苗雙重效果，生根培養(yǎng)基可采用1/2MS+NAA 0.02mg/L，7d 左右就可誘導(dǎo)長出白色根系，且移栽后成活率高。