崔明霞，薛婷婷

(滁州學(xué)院土木與建筑工程學(xué)院，安徽 滁州 239000)

0 引言

華山松(PinusarmandiiFranch.)為松科(Pinaceae)松屬(Pinus)高大喬木，原產(chǎn)于中國，因集中產(chǎn)于陜西的華山而得名，集材用、觀賞、種子食用等多種用途。種子生活力的高低直接影響到植物栽培，在對華山松的需求日益增大的情況下，加強種子檢驗顯得十分重要。

種子生活力是指種子能夠萌發(fā)的潛在能力或種胚所具有的生命力，它決定著種子或種胚在發(fā)芽和出苗期間活力水平和行為的綜合表現(xiàn)，是評價種子品質(zhì)的重要指標之一[1-3]。檢測種子生活力主要采用四唑試驗和標準發(fā)芽試驗[4-6]。四唑檢驗原理為四唑溶液穿透生物組織，與氫離子釋放的酶參與呼吸過程形成不溶性紅色化合物，所以呼吸組織被染成紅色[7-9]。四唑溶液染色因其快速高效準確等特點，已經(jīng)成為檢驗種子品質(zhì)的重要手段[10-12]。

華山松種子存在休眠，且萌發(fā)時間長，標準萌發(fā)實驗難以直接、迅速檢驗其萌發(fā)情況[13-14]；也有報道以X射線水襯比法測定華山松種子生活力[14]，但該方法操作較復(fù)雜，且不能精確判斷單粒種子中各組織與各區(qū)域的細胞存活情況。因此選擇四唑染色是測定華山松種子生活力的較好方式。

對于不同植物種類，最適宜的四唑溶液質(zhì)量分數(shù)、染色時間和預(yù)處理方式均有不同；四唑染色能夠判定種子中各個組織與各個區(qū)域的存活情況，但不同組織與不同區(qū)域的存活模式對不同植物種類的萌發(fā)與成苗的影響不同，因此不同的物種也存在不同的生活力判定方式。本文從染色條件與生活力判定角度對以四唑染色方式測定華山松種子生活力進行研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

華山松種子由滁州學(xué)院種子中心實驗室提供。種子縱徑11.620 4±1.04 mm，橫徑7.732 4±0.62 mm，種子千粒質(zhì)量242.408 g。

四唑試劑為僅供科研使用的飛凈(phygene)牌PH1792(紅四氮唑)。

1.2 方法

預(yù)處理：從充分混合的種子中，隨機選取種子剝?nèi)シN殼[15]，浸泡12 h后，將種仁用刀片通過胚中軸的中部縱向切開使胚根和組織暴露在四唑溶液中。

四唑配制：根據(jù)國家標準林木種子檢驗規(guī)程GB2772—1999[16]的規(guī)定，配制質(zhì)量分數(shù)為0.5%和0.2%的四唑溶液。

四唑染色：將預(yù)處理的種子分別放入質(zhì)量分數(shù)為0.5%和0.2%的四唑溶液中，使溶液淹沒種仁，而后分別放入15、20、25、30 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中避光染色，每個試驗處理50粒種子，并進行4次生物學(xué)重復(fù)。每隔1 h觀察記錄一次，觀察至連續(xù)3次記錄無明顯變化為止。

觀察鑒定:染色結(jié)束后，瀝去溶液，用清水沖洗，將種子擺在濕潤的濾紙上。逐粒記錄種子染色的區(qū)域。

萌發(fā)試驗：種子吸脹10 d后，與濕沙混合均勻，在4 ℃條件下層積60 d，然后置于4層濕潤濾紙上，放入10、15、20、25、30 ℃恒溫光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)45 d，每天記錄種子萌發(fā)情況。萌發(fā)試驗每次取100粒種子，重復(fù)3次試驗。以形成正常幼苗作為萌發(fā)標準[17]。

數(shù)據(jù)處理：所得數(shù)據(jù)用SPSS19 軟件進行方差分析與多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同條件下染色結(jié)果

觀察染色后的華山松種子，整理為4種染色模式，如圖1所示。本次試驗未出現(xiàn)胚完全不著色的情況。

將華山松種子種仁用刀片通過胚中軸的中部縱向切開后，在不同質(zhì)量分數(shù)(0.2%、0.5%)的四唑試劑(TTC)和不同染色溫度條件下的染色結(jié)果如表1所示。

判定最佳染色條件時，僅選擇染色模式1，即胚與胚乳完全染色的情況進行多重比較。結(jié)果表明：

注：1.胚和胚乳完全染色；2 .胚完全染色，少于1/3部分的胚乳未染色;3.胚完全染色，多于1/3的子葉未染色；4.胚部分未染色(胚根，子葉，胚軸的部分或全部未染色)，胚乳全部或部分染色。

表1 不同質(zhì)量分數(shù)的TTC與不同溫度下的種子染色結(jié)果

在30 ℃條件下，以質(zhì)量分數(shù)為0.5%的四唑溶液染色，染色率最高，達到75%，顯著高于其他染色條件下的染色率(P<0.05)。而染色時間在30 ℃條件下，無論四唑溶液質(zhì)量分數(shù)為0.2%或0.5%，均低于其他染色溫度下的染色時間，僅需5 h。因此，在30 ℃條件下，質(zhì)量分數(shù)為0.5%的四唑溶液為最佳染色條件。

2.2 萌發(fā)率結(jié)果

表2和表3為華山松種子在不同溫度的恒溫培養(yǎng)箱中的萌發(fā)情況。華山松種子在20 ℃萌發(fā)率最高，為90%，且開始萌發(fā)時間最早，第4 d開始萌發(fā)；在15 ℃時萌發(fā)率為89%；在25 ℃時萌發(fā)率為79%；培養(yǎng)溫度為10 ℃時，種子萌發(fā)率為61%，且有21%種子未萌發(fā)，也未腐爛；培養(yǎng)溫度為30 ℃時，萌發(fā)率最低，為28%，腐爛率也高達39%，萌發(fā)開始時間最遲，為15 d。

表2 不同溫度下華山松種子萌發(fā)率

表3 不同溫度下華山松種子的發(fā)芽時間

2.3 染色結(jié)果判定

由表1可知，在四唑溶液質(zhì)量分數(shù)為0.5%，溫度為30 ℃時，染色結(jié)果最佳。故采用此條件下的染色結(jié)果來判定有生活力的種子染色模式。華山松種子吸脹后放入20 ℃恒溫培養(yǎng)箱中萌發(fā)45 d后，計算萌發(fā)率為(90±3)%。表4顯示判定染色后有生活力的類型和其對應(yīng)的萌發(fā)率結(jié)果，并對比不同類型比例染色率數(shù)值與萌發(fā)率數(shù)值的差異。染色模式1為胚乳與胚全部著色，顯然應(yīng)作為有生活力的種子。因此判定時，比較染色模式1與染色模式2、3、4的各種組合的情況所占比例與萌發(fā)率的差異。

表4 染色后華山松種子有生活力的類型及其萌發(fā)率

采用染色判讀類型和萌發(fā)率的差異分析，如表4所示，顯示了類型1和類型2的數(shù)據(jù)結(jié)果和種子萌發(fā)率(90%)結(jié)果相比差異性最小，僅2%，顯著低于其他組合情況，其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。也就是說，除了胚和胚乳完全染色的情況外，胚完全染色且胚乳染色比例不低于2/3的種子也具有生活力。

3 結(jié)論與討論

1)試驗表明：在30 ℃下用質(zhì)量分數(shù)為0.5%的四唑溶液染色，為最佳染色條件，且染色時間僅需要5 h；胚全部染色，胚乳染色面積不小于2/3的種子具有生活力。

2)試驗結(jié)果表明：在30 ℃條件下染色優(yōu)于前人提出的20 ℃條件下染色[13]，而在很多情況下，30～35 ℃的染色條件均優(yōu)于較低的溫度，30～35 ℃也是很多植物的建議染色溫度[17]。

3)雖然統(tǒng)計結(jié)果顯示，染色模式3和染色模式4不宜判作有生活力的種子，但由于本試驗所用的該批次白皮松種子生活力較高，染色模式3與4所占的比例較低，對于種胚的染色所得的染色類型較少，因此很難判斷胚根、胚軸或子葉的小部分面積未染色時，對種子整體質(zhì)量的影響，沒有數(shù)據(jù)說明種子是否還具有生活力。因此還需以中、低等生活力的種子進行研究，獲得更精細的判讀標準。

4)對比染色率與萌發(fā)率時所用的萌發(fā)標準，一般的萌發(fā)結(jié)果往往有3種判斷類型：胚根突破種皮；胚根生長到一定程度，或形成正常幼苗；田間出苗率。這3種萌發(fā)標準類型適用的情況不同。胚根突破種皮往往作為生理層面的萌發(fā)標準[18-20]，多用于種子休眠的研究；雖然種子的生活力被定義為萌發(fā)的潛在能力或種胚所具有的生命力，但國際上使用產(chǎn)生正常幼苗作為種子有生活力的標準[17]，那些胚根能夠突破種皮但不能形成正常幼苗的種子不被認為具有生活力。有時四唑染色的結(jié)果也被用于預(yù)判田間成苗率，這是由于四唑染色也能用于判定種子活力。種子在大田萌發(fā)時，受環(huán)境影響，低活力的種子萌發(fā)后不能存活，而四唑染色也可以通過特定的染色模式鑒別出不適宜田間萌發(fā)的種子。