陸 娟，昂玉潔，王 萍，屈長青,2

(1.阜陽師范大學 生物與食品工程學院，阜陽 236037；2.抗衰老中草藥安徽省工程技術研究中心，阜陽 236037)

有絲分裂(mitosis)是高等生物體細胞增殖的主要方式，根據染色體的形態(tài)與動態(tài)變化可以將分裂過程分為前期、中期、后期和末期。為了方便觀察有絲分裂各期分裂相，就必須選擇細胞分裂較旺盛且易取的組織作為實驗材料。大蒜生根率較高，幾乎不受季節(jié)限制，且染色體數(shù)目較少(2n=16)，顯微鏡下易于觀察，所以它是學生實驗材料的首選[1]。有絲分裂實驗不僅是現(xiàn)行中學生物學教材中必做的實驗之一，也是大學細胞生物學實驗的選做實驗之一，但是按照中學教材中所述方法進行實驗成功率很低[2]，大學的實驗教材也未提及具體的改善方法。

趙東利等[3]發(fā)現(xiàn)10-9mol/L吲哚乙酸(IAA)最利于大蒜根生長發(fā)育，較低濃度促進大蒜根的生長，較高濃度抑制生長。吲哚-3-乙酸是生長素在植物體內主要的存在形式，生長素通過調節(jié)細胞生長、細胞分裂以及細胞特異性的分化等生理功能參與一系列生長發(fā)育過程[4]。農業(yè)生產中IAA常用于誘導植物生根和繁育無籽番茄。

目前還沒有關于吲哚乙酸對大蒜根尖有絲分裂周期性影響的報道。本文研究用10-9mol/L IAA培養(yǎng)的大蒜根尖在上午8點至下午4點的有絲分裂情況，為植物細胞有絲分裂實驗更好地開展提供指導。

1 材料和方法

1.1 材料

大蒜(AlliumsativumL.)。0.1%龍膽紫染液、0.1%番紅染液和改良的苯酚品紅染液。

1.2 方法

1.2.1 材料的處理

剝去蒜頭的膜質鱗葉，再去掉蒜瓣的外包薄膜，放于托盤中，分別加入水和10-9mol/L IAA，使蒜瓣浸入水中，28 ℃恒溫培養(yǎng)，每天換水或IAA溶液一次。當大蒜根長至2～3 cm時進行剪取，置于Carnoy固定液(體積比95%乙醇∶冰醋酸=3∶1)中固定2 h以上，棄固定液，加入保存液(75%乙醇)，4 ℃冰箱中保存。

1.3 大蒜根尖細胞有絲分裂裝片的制備

將固定的大蒜根尖取出，去除伸長區(qū)，僅留下乳白色分生區(qū)(約0.15 cm)，放入解離液(1 mol/L鹽酸)中解離10 min進行軟化，水洗3次；將軟化后的根尖放入載玻片上的染液液滴中，用解剖針將根尖壓碎、染色；用鉛筆輕敲蓋玻片，使細胞分散均勻、除去氣泡，用吸水紙吸干蓋玻片周圍的染液。顯微鏡下觀察。

1.4 染色液的選擇

將保存的大蒜根尖經軟化、壓碎后分別用龍膽紫染液、番紅染液和改良的苯酚品紅染液進行染色，壓片后鏡檢觀察。

1.5 IAA對大蒜根尖有絲分裂相的影響

2021年3月中旬將大蒜剝皮后分別用水和10-9mol/L IAA進行培養(yǎng)，于8：00、9：00、10：00、11：00、12：00、13：00、14：00、15：00和16：00剪取大蒜根尖，固定、保存。經軟化、搗碎、改良的苯酚品紅染液染色，壓片后鏡檢觀察。

1.6 統(tǒng)計方法

選取40倍鏡下細胞分布均勻、染色效果較好的視野進行觀察，每個根尖選取5個視野，每個時間點選取5個根尖共25個視野。統(tǒng)計不同時間點大蒜有絲分裂相的數(shù)目和有絲分裂指數(shù)，總細胞數(shù)是觀察的間期細胞和分裂期細胞(前期、中期、后期和末期)的總和；其中，中后期比例=(中期細胞數(shù)+后期細胞數(shù))/總細胞數(shù)×100%，有絲分裂指數(shù)=分裂期細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。

2 結果與分析

2.1 染色液的選擇

大蒜根尖分別用龍膽紫、番紅和改良的苯酚品紅等3種染液染色后進行鏡檢觀察(圖1)。結果表明，龍膽紫和番紅著色力較強，細胞質不同程度地被染成相應的顏色，影響染色體的觀察和計數(shù)。雖然使用改良的苯酚品紅染液染色時間(8～10 min)較其他染色液長(龍膽紫3～5 min、番紅3～5 min)，卻可使細胞質幾乎不著色或著色較淺，將染色體染成清晰的淡紫色。

(a)0.1%龍膽紫；(b)0.1%番紅；(c)改良的苯酚品紅。圖1 不同染料處理的大蒜根尖細胞(10×40)Figure 1 The garlic tip cells stained by three dyes(10×40)

2.2 IAA對大蒜根尖有絲分裂相的影響

將分別用水和10-9mol/L IAA培養(yǎng)、固定保存的大蒜根尖進行軟化、染色、壓片后鏡檢，統(tǒng)計分析40倍鏡下25個視野中的有絲分裂指數(shù)和中后期分裂相比例。

由表1和表2可以看出：水培的大蒜根尖在8：00—16：00有絲分裂存在高峰期，14：00時出現(xiàn)了最高峰期(分裂指數(shù)為3.68%)，10：00時出現(xiàn)了一個次高峰期(分裂指數(shù)為2.95%)；并且有絲分裂指數(shù)為1.91%～3.68%，細胞分裂的中、后期細胞所占比例為0.38%～1.47%。10-9mol/L IAA培養(yǎng)的大蒜根尖在8：00—16：00有絲分裂也存在高峰期，8：00時有絲分裂指數(shù)最高(9.11%)，隨后分裂指數(shù)幾乎呈現(xiàn)為降低的趨勢，到16：00時兩種方法培養(yǎng)的大蒜根尖有絲分裂指數(shù)持平(1.91%)，并且有絲分裂指數(shù)為1.91%～9.11%，細胞分裂的中后期細胞所占比例為0.80%～3.55%。

表1 水培養(yǎng)的大蒜根尖有絲分裂各期細胞數(shù)目的統(tǒng)計表Table 1 Statistical table of each mitotic stage cell number of garlic tips cultured in water

表2 IAA培養(yǎng)的大蒜根尖有絲分裂各期細胞數(shù)目的統(tǒng)計表Table 2 Statistical table of each mitotic stage cell number of garlic tips cultured in indoleacetic acid solution (10-9 mol/L)

3 討論

迄今為止，許多研究工作者已經對植物根尖有絲分裂的實驗開展了研究，他們發(fā)現(xiàn)植物的有絲分裂指數(shù)與根尖長度、培養(yǎng)溫度等條件有關。李愛玲等[1]發(fā)現(xiàn)8：00至14：00尤其是上午8：00至10：00可以獲得大量的有絲分裂中后期分裂相細胞(根長1.5～3 cm)；李今等[2]發(fā)現(xiàn)大蒜的最佳培養(yǎng)溫度為4 ℃、最佳培養(yǎng)時間為3 d時(根長2～3 cm)有絲分裂指數(shù)較高，且1 g/L的番紅染液比改良的苯酚品紅染液染色效果好。肖桂芝等[5]發(fā)現(xiàn)大蒜根尖有絲分裂指數(shù)與根尖長度、取材時間有關，一般根長為2～4 cm。另外，肖桂芝等[6]和曹芳等[7]研究也發(fā)現(xiàn)低溫(4 ℃)處理可以提高大蒜的有絲分裂指數(shù)；李志超等[8]也發(fā)現(xiàn)溫度和取材時的根長度及它們之間的交互作用對大蒜和洋蔥根尖有絲分裂指數(shù)有顯著影響。除此以外，王玉清等[9]對實驗材料的選擇、取材的時間、解離、漂洗及染色液的選擇等方面進行了綜述，并提出了改進意見。趙廣宇等[10]對利用紅蔥根尖觀察有絲分裂提出了優(yōu)化方案，并探究了廢電池浸出液對紅蔥根尖分生區(qū)有絲分裂的影響。

各種實驗教材中關于壓片法制備植物有絲分裂標本的方法除染色劑不同(Schiff試劑、苯酚品紅或改良的苯酚品紅)外，其它大體相同，只是有的先搗碎根尖再染色[11]，而有的先染色再搗碎根尖[12-14]。在本試驗中采用的是先搗碎根尖再進行染色，并用解剖針輕輕攪拌，根尖細胞染色較均一。

姚世鴻等[15]研究表明，大蒜根尖細胞在一晝夜中存在有絲分裂最高峰期和幾個次高峰期。雖然本試驗沒有研究夜間根尖細胞的有絲分裂情況，但在白天8：00—16：00水培養(yǎng)的大蒜根尖就存在高峰期(14：00)和次高峰期(10：00)，而10-9mol/L IAA培養(yǎng)的大蒜根尖僅存在高峰期(8：00)。10-9mol/L IAA培養(yǎng)的大蒜根尖與水培養(yǎng)得到的大蒜根尖相比，有絲分裂指數(shù)大大提高，由1.91%～3.68%增加到1.91%～9.11%，并且中、后期細胞由0.38%～1.47%增加到0.80%～3.55%。IAA不僅可以改變大蒜有絲分裂的高峰期，還可以增加有絲分裂指數(shù)、提高中后期細胞的比例，這可能與IAA的生理功能有關。因此，為了提高有絲分裂實驗成功率和實驗效果，建議大蒜根尖培養(yǎng)時，添加10-9mol/L IAA，并于早晨8：00(根長2～3 cm)取材為宜。