吳 霜 ,馬玲玲,張思雨 ,王 東,李 勇,王玉炯,曾 瑾

( 1.寧夏大學(xué) 西部特色生物資源保護(hù)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，銀川 750021;2.寧夏大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，銀川 750021)

產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens)作為一種廣泛分布于土壤、水域等環(huán)境中的革蘭氏陽性厭氧菌，由美國著名病理學(xué)家Welchii和Nuttad在一具腐敗尸體產(chǎn)生氣泡的血管中首次分離獲得，又稱魏氏梭菌[1]。該菌是一種梭狀芽孢桿菌，因能分解肌肉和結(jié)締組織中的糖而導(dǎo)致組織氣疽，菌體能形成莢膜，因此稱為產(chǎn)氣莢膜梭菌[2]。臨床上，產(chǎn)氣莢膜梭菌可以引起食物中毒[3]、壞死性結(jié)腸炎、腸毒血癥等，也可引起氣性壞疽、梭菌性肌無力等全身性疾病[4]。

產(chǎn)氣莢膜梭菌的致病因子是其產(chǎn)生的多種外毒素，目前所知的產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素有18種之多[5]，其中β2毒素是Gibert等[6]首次從仔豬壞死性腸炎病料的培養(yǎng)物上清液中分離得到的，是一種具有細(xì)胞毒性和致死性的強(qiáng)毒素，β2毒素與多種動(dòng)物的胃腸道疾病有關(guān)，該毒素在患有腸炎動(dòng)物糞便中的陽性檢出率極高，可達(dá)80%～91%，而在正常的動(dòng)物糞便中的檢出率只有11.1%，此結(jié)果有力證明了β2毒素引起動(dòng)物腸炎這一觀點(diǎn)[7]。針對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌β2毒素的檢測，目前主要是PCR相關(guān)的核酸檢測，但該方法僅能檢測菌株是否含有β2毒素的編碼基因，而不能檢測β2毒素基因是否表達(dá)，并對(duì)動(dòng)物造成影響。Gohari等[8]報(bào)道，在使用Real-timePCR以及ELISA檢測方法對(duì)加拿大安大略省的55匹患有腹瀉的馬的糞便進(jìn)行產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素檢測過程中，使用捕獲ELISA方法檢測到在7.2% 的糞便樣本中存在β2毒素。Aschfalk等[9]對(duì)收集的挪威北部海岸捕獲的大西洋鱈魚糞便進(jìn)行細(xì)菌學(xué)檢測時(shí)，使用ELISA方法檢測了產(chǎn)氣莢膜梭菌α、β1以及ε毒素，而在檢測β2毒素時(shí)僅使用PCR方法，并檢測到2.1%的菌株為β2毒素基因攜帶菌株。本研究以純化的產(chǎn)氣莢膜梭菌β2毒素重組蛋白為包被抗原建立一種快速有效、可以高通量使用的間接ELISA檢測方法，為產(chǎn)氣莢膜梭菌病的流行病學(xué)調(diào)查和疫苗免疫效果評(píng)價(jià)等提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

產(chǎn)氣莢膜梭菌β2毒素重組表達(dá)菌株BL21(DE3)pTIG-cpb2、α毒素重組表達(dá)菌株BL21(DE3)pET28-alpha、β1毒素重組表達(dá)菌株BL21(DE3)pTIG-cpb1、ε毒素重組表達(dá)菌株BL21(DE3)pTIG-epsilon、對(duì)照菌株BL21(DE3)pET32a均由本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建并保存[10]；201份牛血清采自寧夏石嘴山市益農(nóng)金禾養(yǎng)殖有限公司；2份產(chǎn)氣莢膜梭菌陽性血清、21株產(chǎn)氣莢膜梭菌雜交瘤細(xì)胞株為本實(shí)驗(yàn)室前期制備并保存[11]、單增李斯特菌(ATCC 19115)、沙門氏菌(CMCC 50115)、4種大腸桿菌(C83905、C83922、C83529、C83684)、銅綠假單孢菌、金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

HRP-羊抗鼠IgG(ZB-2305)、HRP-山羊抗牛IgG(AI11015)、PBS粉劑(pH 7.5)購自北京中杉金橋生物有限公司；BCA蛋白檢測試劑盒購自南京凱基生物有限公司；SuperBlockTMT20 BlockingBuffer購自Thermo Scientific(WB315798)；鄰苯二胺(OPD)購自麥克林生物有限公司；PAGE凝膠快速試劑盒購自上海雅酶生物技術(shù)有限公司；牛血清白蛋白、Tween-20、IPTG、透析袋購自索萊寶生物科技有限公司；美國BD Difco脫脂奶粉購自上海凌儀生物科技有限公司；快速封閉液(P30500)購自新賽美生物科技有限公司；6×DNA/6×Protein Loading buffer購自全式金生物技術(shù)有限公司；胎牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；雅酶雙色預(yù)染蛋白Marker(WJ102)購自上海雅酶生物科技有限公司；小鼠單克隆抗體亞型鑒定試劑盒購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株的表達(dá)及純化

β2毒素重組表達(dá)菌株BL21(DE3)pTIG-cpb2凍存物劃線至含氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上，過夜培養(yǎng)，挑取單菌落搖瓶37 ℃培養(yǎng)，菌液培養(yǎng)至OD600為0.6～0.8時(shí)，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，取菌體裂解上清液，以AKTA純化系統(tǒng)用鎳親和層析法進(jìn)行蛋白純化，所得蛋白經(jīng)透析后，經(jīng)SAS-PAGE、Western Blot鑒定并進(jìn)行BCA定量后分裝保存于4 ℃為抗原備用。

1.2.2 產(chǎn)氣莢膜梭菌β2毒素單克隆抗體ELISA功能的篩選

本課題組前期利用β2毒素的10個(gè)抗原肽段制備了9/1E23、2/C337、7/2H7、7/2G7等21株陽性雜交瘤細(xì)胞株[11]，以純化的產(chǎn)氣莢膜梭菌β2毒素重組蛋白為包被抗原，4 ℃過夜，用5%脫脂牛奶37 ℃封閉2 h，以21株單克隆抗體做為一抗，分別作27、28、29、210、211、212和213的倍比稀釋，同時(shí)設(shè)PBS空白對(duì)照，37 ℃作用1 h，以HRP-羊抗鼠IgG為二抗，按1∶2 000稀釋，37 ℃孵育30 min，加入OPD和0.03% H2O2顯色15 min后，加入終止液(2 mol/L H2SO4溶液)，讀取OD450值，篩選具有良好ELISA定量檢測功能的抗體，作為后續(xù)建立方法所用一抗。

1.2.3 產(chǎn)氣莢膜梭菌β2毒素單克隆抗體特異性檢測

為檢測產(chǎn)氣莢膜梭菌β2毒素單克隆抗體9/1E23的特異性，對(duì)表達(dá)產(chǎn)氣莢膜梭菌4種主要毒素的大腸桿菌菌株：BL21(DE3)pET28-alpha、BL21(DE3)pTIG-cpb1、BL21(DE3)pTIG-cpb2和BL21(DE3)pTIG-epsilon進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，制備蛋白樣進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，并以產(chǎn)氣莢膜梭菌β2毒素單克隆抗體為一抗，HRP-羊抗鼠 IgG為二抗進(jìn)行Western Blot檢測，驗(yàn)證McAb 9/1E23與α毒素、β1毒素、ε毒素以及大腸桿菌菌體蛋白是否存在交叉反應(yīng)。

1.2.4 產(chǎn)氣莢膜梭菌β2毒素單克隆抗體9/1E23的純化

(1)單克隆抗體小鼠腹水的制備。取6只健康狀態(tài)良好的BALB/c小鼠，每只腹腔注射0.5 mL的弗氏不完全佐劑進(jìn)行預(yù)處理，用于后期制備腹水。將凍存于液氮罐中的McAb 9/1E23雜交瘤細(xì)胞接種至含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中復(fù)蘇，進(jìn)行細(xì)胞傳代培養(yǎng)。待細(xì)胞生長旺盛時(shí)，調(diào)整細(xì)胞數(shù)量為5×106個(gè)/mL。每只BALB/c小鼠腹腔注射雜交瘤細(xì)胞0.2 mL。7～14 d后，收集腹部隆起的小鼠的腹水，裝入離心管中8 000 r/min離心10 min，收集上清液，標(biāo)記好后保存于-80℃冰箱中備用。(2)9/1E23雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液的制備及純化。復(fù)蘇9/1E23雜交瘤細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞傳代培養(yǎng)，待細(xì)胞狀態(tài)良好后按1∶100的比例將細(xì)胞分傳于75 cm2的培養(yǎng)瓶中，并置于CO2培養(yǎng)箱中直至細(xì)胞過度生長以富集抗體，約5 d后，待培養(yǎng)液變酸(變黃色)后，將細(xì)胞培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到50 mL離心管中，室溫下10 000 r/min離心10 min，收集上清液，用0.22 μm濾器進(jìn)行過濾除菌，采用AKTA純化系統(tǒng)使用Protein G純化獲得McAb，對(duì)純化樣品進(jìn)行SDS-PAGE鑒定，并經(jīng)BCA定量后加入50%甘油保存于-80℃冰箱中備用。

1.2.5 McAb 9/1E23亞型的鑒定

9/1E23雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液進(jìn)行1∶100稀釋，加入50 μL/孔至小鼠單克隆抗體亞型鑒定試劑盒的ELISA孔中，將羊抗鼠IgA+lgIM+lgG-HRP 50 μL/孔加入樣品孔中，室溫孵育1 h，加入顯色液觀察。

1.2.6 基于McAb 9/1E23的間接ELISA檢測方法的建立

(1)特異性試驗(yàn)。分別以β2毒素重組蛋白、4種大腸桿菌(C83905、C83922、C83529、C83684)、單增李斯特菌、沙門氏菌、銅綠假單孢菌、金黃色葡萄球菌和藤黃微球菌的菌體培養(yǎng)物為包被抗原，以純化的McAb 9/1E23為一抗，進(jìn)行ELISA檢測，每份樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)，驗(yàn)證McAb 9/1E23的檢測特異性。(2)間接ELISA反應(yīng)條件的優(yōu)化。采用方陣滴定法，以β2毒素重組蛋白為包被抗原，以純化的McAb 9/1E23為一抗，分別對(duì)抗原包被濃度(0.25、0.5、1和1.5 μg/mL)，封閉液(1%、3%、5%牛血清白蛋白，1%、3%、5%脫脂奶粉)，封閉時(shí)間(0.5、1.0、1.5和2 h)，一抗稀釋度(28、29、210、211、212、213和214)，HPR-山羊抗小鼠IgG稀釋度(1∶1 000、1∶2 000、1∶ 4 000和1∶ 8 000)等ELISA反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化。(3)臨界值的確定。利用所建立的間接ELISA檢測方法，對(duì)28份陰性抗體進(jìn)行ELISA測定，并計(jì)算平均OD450值(x)和標(biāo)準(zhǔn)方差(s)。當(dāng)樣品OD450值>x+3s時(shí)，判定為陽性；OD450值

2 結(jié)果及分析

2.1 β2毒素重組蛋白的表達(dá)、純化及質(zhì)譜鑒定

2.1.1 β2毒素重組蛋白的SDS-PAGE、Western Blot分析及蛋白濃度的測定

培養(yǎng)本實(shí)驗(yàn)室保存的BL21(DE3)(pTIG-cpb2)菌株并利用AKTA純化系統(tǒng)，采用鎳親和層析法，收集100 mmol/L咪唑峰[圖1(a)]，獲得純化的β2毒素重組蛋白，SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示28 ku處有目的條帶[圖1(b)]，與所報(bào)道的β2蛋白分子質(zhì)量一致；以產(chǎn)氣莢膜梭菌β2毒素單克隆抗體9/1E23為一抗，HRP-山羊抗小鼠IgG為二抗，Western Blot結(jié)果顯示，28 ku目的蛋白帶能被β2毒素單克隆抗體9/1E23特異性識(shí)別。經(jīng)過BCA法蛋白定量檢測，純化蛋白濃度為4.8 μg/uL，可作為后續(xù)ELISA方法的包被用抗原。

(a)BL21(DE3)pTIG-cpb2重組菌株表達(dá)蛋白純化結(jié)果。(b)表達(dá)蛋白純化結(jié)果SDS-PAGE及Western Blot檢測結(jié)果[M：Marker；1：BL21(DE3)pET32a；2：純化前的BL21(DE3)pTIG-cpb2菌體蛋白；3：流穿峰蛋白；4：100 mmol/L咪唑洗脫峰蛋白；5：透析后的純化蛋白]。圖1 β2毒素重組蛋白的表達(dá)、純化及鑒定結(jié)果Figure 1 Expression,purification and identification results of β2 toxin recombinant protein

2.1.2 重組產(chǎn)氣莢膜梭菌β2毒素蛋白質(zhì)譜鑒定

由于目前商品化的產(chǎn)氣莢膜梭菌β2毒素抗體難以獲得，為了進(jìn)一步確認(rèn)BL21(DE3)pTIG-cpb2菌株表達(dá)的重組β2毒素蛋白的氨基酸序列與所報(bào)道的一致性，在對(duì)pTIG-cpb2載體進(jìn)行核苷酸序列測定的基礎(chǔ)上，對(duì)BL21(DE3)pTIG-cpb2菌株進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)后，切取SDS-PAGE電泳凝膠上的28 ku處目的條帶，委托杭州景杰生物科技有限公司進(jìn)行質(zhì)譜分析，肽段質(zhì)譜檢測拼接后氨基酸序列(圖2)經(jīng)在NCBI 網(wǎng)站上進(jìn)行Protein BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比對(duì)，結(jié)果顯示目的蛋白肽氨基酸序列具有與產(chǎn)氣莢膜梭菌β2毒素最相似的匹配度，表明BL21(DE3)pTIG-cpb2表達(dá)并純化所獲得的目的蛋白為重組產(chǎn)氣莢膜梭菌β2毒素蛋白。

d:脫酰基位點(diǎn)；o:氧化還原位點(diǎn)。圖2 β2毒素重組蛋白質(zhì)譜分析后肽段拼接序列Figure 2 Peptide splicing sequence afterβ2 toxin recombinant protein profiling analysis

2.2 產(chǎn)氣莢膜梭菌β2毒素單克隆抗體特異性檢測

表達(dá)產(chǎn)氣莢膜梭菌4種主要毒素的大腸桿菌菌株經(jīng)誘導(dǎo)后制備蛋白樣進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳[圖3(b)]，以產(chǎn)氣莢膜梭菌β2毒素單克隆抗體為一抗進(jìn)行Western Blot檢測；結(jié)果顯示McAb9/1E23經(jīng)稀釋1 000倍時(shí)可以特異性識(shí)別28 ku 的β2毒素重組蛋白，而與α毒素、β1毒素、ε毒素以及大腸桿菌菌體蛋白均未見交叉反應(yīng)，表明制備的產(chǎn)氣莢膜梭菌示McAb 9/1E23具有良好的特異性[圖3(a)]。

(a)Western Blot檢測結(jié)果;(b) SDS-PAGE凝膠電泳檢測結(jié)果。M：Marker；1：BL21(DE3)pET32a；2：BL21(DE3)pET28-alpha；3：BL21(DE3)pTIG-cpb1；4：BL21(DE3) pTIG-cpb2；5：BL21(DE3)pTIG-epsilon。圖3 產(chǎn)氣莢膜梭菌β2毒素單克隆抗體特異性檢測結(jié)果Figure 3 Clostridium perfringens β2 toxin monoclonal antibody specific detection results

2.3 產(chǎn)氣莢膜梭菌β2毒素單克隆抗體ELISA功能的篩選

本課題組前期利用β2毒素的10個(gè)抗原肽段制備了21株產(chǎn)氣莢膜梭菌雜交瘤細(xì)胞株[11]，本實(shí)驗(yàn)中對(duì)21個(gè)單克隆抗體進(jìn)行ELISA檢測能力的鑒定和篩選；結(jié)果顯示(圖4)，單克隆抗體9/1E23、2/C337、7/2H7和7/2G7具有ELISA定量檢測功能，并且在稀釋212倍時(shí)仍可檢測到目的蛋白，其中McAb 9/1E23表現(xiàn)尤為出色，可用于進(jìn)一步建立間接ELISA檢測方法的一抗使用。

圖4 21株單克隆抗體的ELISA功能篩選結(jié)果Figure 4 ELISA function screening results of 21 monoclonal antibodies

2.4 9/1E23單克隆抗體的純化及亞型鑒定

2.4.1 McAb 9/1E23的純化

制得9/1E23雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液后，利用AKTA純化系統(tǒng)，采用Protein G親和柱上樣，利用pH 2.7的100 mmol/L的甘氨酸-HCL溶液進(jìn)行洗脫[圖5(a)]，收集洗脫峰蛋白并經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳分析，可見53 ku左右的重鏈和23 ku左右的輕鏈蛋白條帶[圖5(b)]，結(jié)果表明純化結(jié)果較好；經(jīng)過BCA法定量計(jì)算所得McAb 9/1E23蛋白濃度為2 μg/μL。

(a)McAb 9/1E23純化峰圖；(b)McAb9/1E23純化結(jié)果SDS-PAGE結(jié)果(M：Marker;1、2：9/1E23雜交瘤細(xì)胞株培養(yǎng)上清液；3：純化時(shí)流穿蛋白；4：純化后的McAb 9/1E23)。圖5 McAb 9/1E23純化結(jié)果Figure 5 McAb 9/1E23 purification results

2.6 間接ELISA反應(yīng)條件的優(yōu)化結(jié)果

2.4.2 McAb 9/1E23亞型的鑒定

采用抗體分型試劑盒，對(duì)雜交瘤細(xì)胞株9/1E23培養(yǎng)上清液進(jìn)行ELISA測定，結(jié)果表明McAb 9/1E23重鏈為IgG2b 型，輕鏈為κ型(圖6)。

圖6 McAb 9/1E23亞型的ELISA鑒定結(jié)果Figure 6 ELISA identification results of McAb 9/1E23 subtype

2.5 特異性實(shí)驗(yàn)

分別以β2毒素重組蛋白、4種大腸桿菌、單增李斯特菌、沙門氏菌、銅綠假單孢菌、金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌的菌體培養(yǎng)物及產(chǎn)氣莢膜梭菌其他主要毒素重組蛋白為包被抗原，以純化的McAb 9/1E23為一抗，驗(yàn)證McAb 9/1E23的檢測特異性。結(jié)果顯示(圖7)，產(chǎn)氣莢膜梭菌β2毒素蛋白包被抗原OD450為1.784，其他幾種菌OD450均低于陽性臨界值0.121，說明McAb 9/1E23具有良好的ELISA檢測特異性功能。

圖7 McAb 9/1E23特異性試驗(yàn)結(jié)果Figure 7 McAb 9/1E23 specificity test results

根據(jù)方陣滴定試驗(yàn)結(jié)果顯示，β2重組蛋白包被濃度為0.5 μg/mL，McAb 9/1E23稀釋比為1∶210時(shí)，OD450為1.15，OD450值為1左右，P/N大于2為18.4，此時(shí)陰性對(duì)照OD450值為0.063[圖8(a)]；HRP-山羊抗小鼠酶標(biāo)抗體在稀釋比為1∶2 000時(shí)，McAb 9/1E23的OD450為1.647，陽性抗體與陰性對(duì)照P/N值最大為31，此時(shí)陰性對(duì)照OD450為0.049[圖8(b)]。因此在ELISA檢測中，確定β2重組蛋白最適包被濃度為0.5 μg/mL，McAb 9/1E23抗體稀釋比為1∶210，反應(yīng)條件為37 ℃ 2 h，HRP-山羊抗小鼠酶標(biāo)抗體的最佳稀釋比為1∶2 000，最佳反應(yīng)條件為37 ℃ 30 min[圖8(c)]，最佳封閉條件為5%脫脂牛奶，37 ℃封閉2 h。

(a)最佳抗原包被濃度的確定;(b)抗體稀釋倍數(shù)的確定;(c)酶標(biāo)二抗最佳稀釋度的確定。圖8 間接ELISA反應(yīng)條件的優(yōu)化結(jié)果Figure 8 Optimization results of indirect ELISA reaction conditions

2.7 臨界值的確定

利用所建立的間接ELISA檢測方法，對(duì)30份陰性抗體進(jìn)行ELISA測定，并計(jì)算這些樣品的平均OD450值(x)和標(biāo)準(zhǔn)方差(s)。當(dāng)樣品OD450值>x+3s時(shí)，判定為陽性；OD450值

圖9 臨界值的確定Figure 9 Determination of critical value

通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，其中陰性對(duì)照總體平均值為0.064，標(biāo)準(zhǔn)差s為0.019，故陽性臨界值為0.121，陰性臨界值為0.102。

2.8 間接ELISA檢測方法靈敏性試驗(yàn)

將McAb 9/1E23按照倍比稀釋，對(duì)建立并優(yōu)化的間接ELISA檢測方法進(jìn)行靈敏性測試，結(jié)果顯示在McAb 9/1E23稀釋到1∶ 214時(shí)OD450為0.244(圖10)，仍在陽性臨界值0.121以上，說明建立并優(yōu)化好的間接ELISA檢測方法靈敏性較高。

圖10 優(yōu)化后的間接ELISA檢測方法靈敏性試驗(yàn)結(jié)果Figure 10 Sensitivity test results of the optimized indirect ELISA detection method

2.9 間接ELISA檢測方法穩(wěn)定性試驗(yàn)

利用所建立的間接ELISA檢測方法，對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌β2毒素陽性抗體(McAb 9/1E23)、陰性抗體(McAb 9/C556)進(jìn)行批次和批間檢測，計(jì)算變異系數(shù)，驗(yàn)證該方法的穩(wěn)定性，結(jié)果顯示3次批內(nèi)檢測變異系數(shù)為1.317%～2.556%，3次批間檢測變異系數(shù)為0.223%～4.673%(表1)，批間和批內(nèi)重復(fù)的變異系數(shù)均小于5%，表明建立的該方法具有良好的穩(wěn)定性。

表1 間接ELISA檢測方法穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Indirect ELISA test method stability test results

2.10 符合性試驗(yàn)

利用所建立的間接ELISA檢測方法，分別對(duì)臨床收集的201份健康牛血清、2份陽性血清、1份陰性血清樣品進(jìn)行ELISA檢測，結(jié)果顯示，檢出201健康牛血清均為陰性，2份陽性血清為陽性，符合率均為100%，表明該方法檢測結(jié)果可信度較高。

3 討論與結(jié)論

目前已報(bào)道的檢測β2毒素在動(dòng)物中的流行情況的方法較少，主要是采用基于PCR技術(shù)的核酸檢測[12-16]，部分文獻(xiàn)中使用多克隆抗血清進(jìn)行免疫組化或ELISA檢測[13,17-18]。臨床上亟需一種操作方便、靈敏性高、特異性好和穩(wěn)定可靠的方法進(jìn)行養(yǎng)殖場動(dòng)物產(chǎn)氣莢膜梭菌的流行病學(xué)調(diào)查和抗體水平的檢測，而ELISA檢測方法具有此優(yōu)勢，因此，建立一種針對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭β2毒素的間接ELISA檢測方法非常必要[19-20]。

產(chǎn)氣莢膜梭菌的培養(yǎng)較為復(fù)雜，產(chǎn)毒條件苛刻，而且產(chǎn)生的毒素種類繁雜[11]，很難獲得天然單一的β2毒素，而大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)作為最早開發(fā)和應(yīng)用最廣泛的經(jīng)典表達(dá)系統(tǒng)，具有遺傳背景清晰、選育快、成本低、表達(dá)量高、蛋白純化容易、穩(wěn)定性好、應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)。本課題組利用基因重組技術(shù)構(gòu)建并篩選獲得BL21(DE3)pTIG-cpb2重組大腸桿菌，實(shí)現(xiàn)了β2重組毒素的大量表達(dá)，并利用AKTA純化系統(tǒng)的金屬離子親和層析法獲得純化的重組β2毒素。同時(shí)，目前未見有產(chǎn)氣莢膜梭菌β2 毒素的檢測抗體出售，因此我們在對(duì)表達(dá)載體進(jìn)行核苷酸測序的基礎(chǔ)上，對(duì)重組β2毒素蛋白進(jìn)行了質(zhì)譜鑒定，進(jìn)一步確認(rèn)重組β2毒素的氨基酸序列，同時(shí)還解決了因外源表達(dá)時(shí)混有細(xì)菌蛋白干擾檢測的問題。本研究建立的ELISA檢測方法以純化的重組β2 毒素為包被抗原，未見其他菌體或毒素的陽性血清發(fā)生交叉反應(yīng)，提高了該方法的特異性。

本課題組前期利用β2毒素的10個(gè)抗原肽段制備了21株陽性的雜交瘤細(xì)胞株，其中的McAb 9/1E23具有良好的Western Blot、ELISA和免疫熒光檢測功能[11]。本研究在前期工作基礎(chǔ)上從21株單克隆抗體中篩選出了4株具有良好ELISA檢測功能的雜交瘤細(xì)胞株，分別為9/1E23、2/C337、7/2H7和7/2G7，選取其中1株(9/1E23)作為一抗，以HRP-羊抗鼠IgG為二抗，通過優(yōu)化反應(yīng)條件，建立了產(chǎn)氣莢膜梭菌β2毒素抗體間接ELISA檢測方法。在靈敏性試驗(yàn)中，本研究建立的ELISA檢測方法可以檢測到稀釋倍數(shù)達(dá)1∶214的抗體，表明該方法的靈敏性較好；在穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)中，本方法的批間、批內(nèi)重復(fù)變異系數(shù)均小于5%，表明該方法的重復(fù)性好；同時(shí)在符合性試驗(yàn)中，本研究建立的ELISA檢測方法的陰性符合率為100%，由于本次進(jìn)行檢測的201份牛血清，采集于寧夏石嘴山市益農(nóng)金禾養(yǎng)殖有限公司待轉(zhuǎn)場的健康牛群，因此未見有β2毒素陽性血清檢出；而陽性血清為本實(shí)驗(yàn)室保存的使用本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的產(chǎn)氣莢膜梭菌β2毒素重組融合蛋白免疫的小鼠血清[11]，本次陽性復(fù)合率為100%，表明該方法檢測結(jié)果可信度高。