胡玉婷，侯冠軍

(安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水產(chǎn)研究所 水產(chǎn)增養(yǎng)殖安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合肥 230031)

翹嘴鲌(Culteralburnus)俗稱翹嘴、鲌魚、大白魚等，屬鯉科(Cyprinidae)鲌亞科(Culterinae)鲌屬(Culter)，是鲌亞科中體型最大的魚類，廣泛分布于除青藏高原以外的中國各大水系[1]，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。然而近年來，翹嘴鲌野生資源因環(huán)境污染、過度捕撈等遭到嚴(yán)重破壞，性成熟個(gè)體呈小型化、低齡化趨勢[2-5]。由于有意的增殖放流或無意的養(yǎng)殖逃逸事件不斷發(fā)生，許多地區(qū)翹嘴鲌野生資源基因庫受到了嚴(yán)重干擾[6]。黃小彧[5]基于線粒體控制區(qū)的研究發(fā)現(xiàn)，長江水系14個(gè)翹嘴鲌群體沒有形成明顯的譜系結(jié)構(gòu)和地理結(jié)構(gòu)。另外，隨著翹嘴鲌繁殖與養(yǎng)殖業(yè)的無序發(fā)展，盲目繁育、引種、雜交及累代養(yǎng)殖，導(dǎo)致養(yǎng)殖群體也出現(xiàn)生長慢、小型化、性成熟早等種質(zhì)衰退或混雜現(xiàn)象[7-8]。雷雙永[8]利用微衛(wèi)星(SSR)標(biāo)記對翹嘴鲌4個(gè)育種群體(黑龍江水系群體、淮河水系群體、長江上游和下游水系群體)的遺傳差異進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示4個(gè)育種群體均存在雜合子缺失現(xiàn)象，群體內(nèi)近親繁育程度較高，群體遺傳多樣性水平較低。優(yōu)良的翹嘴鲌種質(zhì)是其繁養(yǎng)殖業(yè)持續(xù)健康發(fā)展的物質(zhì)基礎(chǔ)，野生親本的管理不當(dāng)可能導(dǎo)致近親繁殖的增加和遺傳多樣性水平下降，從而影響種質(zhì)資源的保護(hù)效果與進(jìn)一步利用。目前國內(nèi)關(guān)于翹嘴鲌微衛(wèi)星標(biāo)記的開發(fā)及利用微衛(wèi)星標(biāo)記研究群體遺傳變異的研究已有一些報(bào)道[8-11]，但尚未見對來自長江、淮河、新安江翹嘴鲌群體比較研究的報(bào)道。為了揭示翹嘴鲌野生群體的遺傳背景及遺傳變異現(xiàn)狀，研究采用10對微衛(wèi)星標(biāo)記研究安徽省翹嘴鲌4個(gè)野外采樣群體的遺傳多樣性與遺傳分化，對其種質(zhì)資源狀況進(jìn)行科學(xué)的遺傳評估，可為翹嘴鲌的種質(zhì)資源保護(hù)和利用工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

2020年4月—8月，分別在長江水系的武昌湖(WCH)、淮河干流鳳臺(tái)峽山口(HH)、新安江休寧縣溪口鎮(zhèn)(XAJ)和巢湖(CH)采集翹嘴鲌樣品，樣品數(shù)分別為30尾。剪取新鮮樣品魚肌肉保存于95%乙醇中用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取、PCR 擴(kuò)增及測序

使用試劑盒(DB324，北京天根)按照指定的步驟提取基因組DNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后低溫備存。參考相關(guān)文獻(xiàn)[9-11]，篩選10對擴(kuò)增條帶清晰、多態(tài)性高且片段長度適宜的微衛(wèi)星引物，見表1。委托上海生工生物公司合成含熒光標(biāo)記(HEX和6-FAM)的引物。

PCR擴(kuò)增總體系20 μL：10 μL的2×TaqPCR MasterMix(含buffer,TaqDNA Polymerase,Mg2+,dNTPs)，上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，模板DNA(約50 ng)1 μL，7 μL的ddH2O。PCR擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，53℃～63℃(表1)退火30 s，72℃延伸40 s，32個(gè)循環(huán)；72℃再延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)ABI 3730XL自動(dòng)測序儀檢測后由軟件Genemarker 2.2讀取等位基因大小。

表1 翹嘴鲌微衛(wèi)星引物特征Table 1 Characteristics of microsatellite primers of C. alburnus

1.2.2 數(shù)據(jù)分析

使用軟件CONVERT 1.31[12]把等位基因數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為后續(xù)軟件分析所需的各種格式。PopGene 1.32軟件[13]統(tǒng)計(jì)各微衛(wèi)星位點(diǎn)和群體的等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、觀測雜合度(Ho)、期望雜合度(He)、群體間Nei’s遺傳距離(Da)和Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)，Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)偏離指數(shù)的計(jì)算公式為D=(Ho-He)/He。軟件Cervus 3.0[14]計(jì)算多態(tài)信息含量(PIC)?；谲浖﨧EGA X[15]中的Nei’s遺傳距離構(gòu)建群體UPGMA聚類樹。軟件Arlequin3.5[16]用于檢測群體遺傳分化指數(shù)(Fst)和分子方差分析(AMOVA)，群體間基因流(Nm)計(jì)算公式為Nm=0.25(1-Fst)/Fst。利用Structure 2.3.4[17]軟件進(jìn)行遺傳聚類分析并使用CLUMPP1.1.2軟件[18]對結(jié)果比對和整合，確定最佳分組K值，再用DISTRUCT程序[19]對聚類結(jié)果繪圖，最后使用Adobe Illustrator CS 6打開繪圖數(shù)據(jù)可編輯保存為各種圖片格式。

2 結(jié)果與分析

2.1 微衛(wèi)星位點(diǎn)多態(tài)性

10對微衛(wèi)星位點(diǎn)在翹嘴鲌群體的遺傳多樣性參數(shù)數(shù)值見表2，說明所選10對微衛(wèi)星適宜于4個(gè)翹嘴鲌群體的遺傳研究，以多態(tài)信息含量PIC為例，除位點(diǎn)EST13(0.469)外，其他微衛(wèi)星位點(diǎn)數(shù)值范圍為0.546～0.947，平均值0.781，均大于0.5的微衛(wèi)星高度遺傳多樣性標(biāo)準(zhǔn)[20]。

表2 翹嘴鲌10對微衛(wèi)星位點(diǎn)遺傳多樣性Table 2 Genetic diversity parameters among 10 loci of C. alburnus

2.2 不同采樣群體翹嘴鲌遺傳多樣性

表3顯示：各采樣群體平均等位基因數(shù)(Na)為10.4～12.2，其中巢湖(CH)群體最少，武昌湖(WCH)群體最多；平均有效等位基因數(shù)(Ne)為5.9～6.9，其中淮河(HH)群體最少，巢湖(CH)群體最多；3個(gè)群體的觀測雜合度小于期望雜合度，說明群體內(nèi)存在雜合子缺失現(xiàn)象；而新安江(XAJ)群體觀測雜合度大于期望雜合度，說明存在雜合子過?，F(xiàn)象；所有群體的平均多態(tài)信息含量(PIC)較高，均大于0.5。

表3 翹嘴鲌的群體遺傳多樣性參數(shù)Table 3 Genetic diversity parameters of C. alburnus populations

2.3 不同采樣群體翹嘴鲌遺傳結(jié)構(gòu)

2.3.1 遺傳距離、遺傳分化指數(shù)及基因流

表4顯示，群體間遺傳距離為0.147～0.290，其中新安江和巢湖群體遺傳距離最小，新安江和淮河群體遺傳距離最大。群體間遺傳分化指數(shù)(Fst)普遍較低，除兩對群體間略大于0.05外，其余群體間均小于0.05，顯示了較低的遺傳分化程度；同時(shí)所有群體間的基因流Nm均大于4。

表4 翹嘴鲌群體間遺傳距離(左下方)、遺傳分化指數(shù)Fst(右上方)及基因流Nm (括號中)Table 4 Pairwise genetic distances (bottom left),F-statistics (top right) and gene flow values among C. alburnus populations

2.3.2 分子變異分析

AMOVA結(jié)果(表5)顯示，僅4.29%的遺傳變異來自采樣群體間，而采樣群體內(nèi)的遺傳變異高達(dá)95.71%。基于群體間Nei’s遺傳距離構(gòu)建的UPGMA聚類樹(圖1)顯示：新安江群體與長江水系的巢湖群體聚為一支，再依次與武昌湖群體、淮河群體聚集。

表5 翹嘴鲌群體遺傳結(jié)構(gòu)的分子變異(AMOVA)分析Table 5 AMOVA analysis of genetic structure of C.alburnus

圖1 翹嘴鲌群體間UPGMA聚類樹Figure 1 UPGMA clustering tree of four populations of C. alburnus based on genetic distance

2.3.3 Structure軟件遺傳聚類分析

遺傳聚類分析結(jié)果(圖2)顯示，最佳遺傳聚類分組為K=4，但這些遺傳組與4個(gè)采樣點(diǎn)不相對應(yīng)，不同采樣群體的樣本間遺傳相似個(gè)體交叉較多。比較而言，新安江和巢湖群體遺傳相似個(gè)體較多，淮河群體較為獨(dú)立，武昌湖群體中遺傳組成較為復(fù)雜。

圖2 基于微衛(wèi)星數(shù)據(jù)的翹嘴鲌群體遺傳結(jié)構(gòu)圖Figure 2 Population genetic structure of C. alburnus sampled based on microsatellite analysis

2.4 Hardy-Weinberg平衡分析

表6表明，顯著偏離Hardy-Weinberg平衡(P<0.05)的12個(gè)群體與位點(diǎn)的組合中，10個(gè)存在雜合子缺失現(xiàn)象(D<0)，2個(gè)存在雜合子過?，F(xiàn)象(D>0)。

表6 Hardy-Weinberg平衡的卡方檢驗(yàn)概率值(P)與遺傳偏離指數(shù)(D)Table 6 Hardy-Weinberg equilibrium Chi-square test probability value (P) and genetic deviation index(D)

3 討論

3.1 翹嘴鲌遺傳多樣性

遺傳多樣性是生物多樣性的重要組成部分，是物種或群體長期進(jìn)化的產(chǎn)物，也是其生存適應(yīng)和發(fā)展進(jìn)化的前提，其遺傳多樣性越高，適應(yīng)環(huán)境變化的能力越強(qiáng)。因此關(guān)于遺傳多樣性的研究，不僅可以揭示物種或群體過去的進(jìn)化歷程，也能進(jìn)一步分析其進(jìn)化潛力和未來命運(yùn)。

采用微衛(wèi)星標(biāo)記檢測遺傳多樣性時(shí)，一般用等位基因數(shù)、雜合度和多態(tài)信息含量等遺傳參數(shù)衡量大小。通常每個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)至少有4個(gè)等位基因才能較好地用于遺傳多樣性評估；與觀測雜合度(Ho)相比，期望雜合度(He)不易受到樣本量影響，能更好地反映遺傳多樣性水平[20-22]；當(dāng)多態(tài)信息含量PIC>0.5時(shí)一般認(rèn)為其為高度多樣性[23]。研究所用10對微衛(wèi)星的等位基因數(shù)(Na)范圍為6～35、He為0.536～0.954，PIC中除位點(diǎn)EST13(0.469)外，其他均大于0.5，說明這些微衛(wèi)星位點(diǎn)能有效評估翹嘴鲌群體的遺傳多樣性。4個(gè)采樣點(diǎn)翹嘴鲌樣本的Na、Ne、Ho、He、PIC分別介于10.4～12.2、5.9～6.9、0.654～0.800、0.739～0.778和0.689～0.738，明顯高于雷雙永[8]基于8對微衛(wèi)星(SSR)標(biāo)記對翹嘴鲌4個(gè)育種群體(黑龍江水系、淮河水系、長江上游和下游水系群體)的多樣性參數(shù)值，其4個(gè)群體的等位基因數(shù)(Na：3.8～5.5) 和有效等位基因數(shù)(Ne：2.6～3.7)均較低，觀測雜合度(Ho)(0.265 0～0.317 5)也明顯低于其期望雜合度(He)。而其他基于線粒體基因序列的相關(guān)研究[4-6]也表明，翹嘴鲌野生群體遺傳多樣性多數(shù)處于中低程度。盡管存在不同分子標(biāo)記的檢測差異，該研究中的翹嘴鲌群體遺傳多樣性依然較高，尚具有較大選育價(jià)值。

3.2 翹嘴鲌群體遺傳結(jié)構(gòu)

遺傳分化指數(shù)Fst是目前廣泛評價(jià)群體間遺傳分化程度的重要指標(biāo)，當(dāng)Fst<0.05時(shí)，群體間遺傳分化程度較低；當(dāng)0.050.25時(shí)，則群體間遺傳分化大[20-23]?？?cè)后w的遺傳分化指數(shù)Fst為0.043，成對群體間的Fst介于0.025～0.056；而分子方差分析(AMOVA)結(jié)果顯示，遺傳變異主要來自于群體內(nèi)(95.71%)，群體間僅占比4.29%，均表明低度遺傳分化。群體間基因交流值(Nm)為4.21～9.75，而一般認(rèn)為當(dāng)Nm>4時(shí)群體間基因交流頻繁，對遺傳漂變作用的抵制能力強(qiáng)[22,24]?；谌后w間遺傳距離構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示，新安江群體與巢湖群體親緣關(guān)系最近，與淮河群體最遠(yuǎn)。用Structure 2.3.4軟件對4個(gè)群體的遺傳聚類分析結(jié)果顯示，K=4為最佳遺傳分類組，但各遺傳分類組與采樣群體是不相對應(yīng)的，不同采樣群體中存在嚴(yán)重的種質(zhì)混雜現(xiàn)象，尤其武昌湖群體，未有主導(dǎo)性的遺傳類群存在，顯示了其復(fù)雜的遺傳組成。

黃小彧[5]基于線粒體控制區(qū)的研究發(fā)現(xiàn)，長江水系14個(gè)翹嘴鲌群體沒有形成明顯的譜系結(jié)構(gòu)和地理結(jié)構(gòu)；伊西慶[6]基于線粒體ND2基因?qū)χ袊鴸|部6個(gè)主要湖泊的研究結(jié)果顯示：洞庭湖與洪澤湖、巢湖群體間不存在明顯遺傳分化。武昌湖位于長江中下游的洞庭湖和巢湖之間，洪澤湖位于淮河下游，表明新安江翹嘴鲌群體可能受到巢湖翹嘴鲌引種的影響，導(dǎo)致其與長江群體遺傳差異不顯著。

3.3 Hardy-Weinberg平衡偏離原因分析

武昌湖、巢湖和淮河干流3個(gè)群體的觀測雜合度小于期望雜合度，說明這些群體存在明顯雜合子缺失現(xiàn)象，而新安江(XAJ)群體觀測雜合度大于期望雜合度，說明該群體存在雜合子過剩現(xiàn)象。導(dǎo)致野生群體雜合子缺失的因素一般是與自然選擇、種群內(nèi)交、無效等位基因和稀有等位基因丟失等有關(guān)[25]，如近親繁殖、環(huán)境脅迫、過度捕撈等因素；而導(dǎo)致野生群體雜合子過剩的因素一般出現(xiàn)在研究對象與其他群體間基因交流頻繁，如人為引進(jìn)攜帶不同等位基因的外來個(gè)體。翹嘴鲌武昌湖和淮河兩個(gè)群體同時(shí)存在雜合子缺失或過剩的現(xiàn)象，表明它們近期可能既經(jīng)歷過如過度捕撈等因素導(dǎo)致的多樣性下降問題，也經(jīng)歷了外來引種的過程，且以前者為主；而巢湖群體則主要經(jīng)歷了過度捕撈等導(dǎo)致的雜合子缺失問題，而新安江群體則受到了巢湖群體的引種影響。國內(nèi)其他地區(qū)翹嘴鲌研究結(jié)果[4]顯示：翹嘴鲌歷史上曾經(jīng)歷了不少地區(qū)的相互引種，導(dǎo)致一些野生群體存在種質(zhì)混雜現(xiàn)象，而有意無意地人工引種，都勢必會(huì)增加群體間的基因流動(dòng)，從而減小引入群體和土著群體之間的遺傳差異，導(dǎo)致地理距離較遠(yuǎn)的群體遺傳進(jìn)化關(guān)系較近。

綜上，安徽省4個(gè)翹嘴鲌采樣群體(巢湖、武昌湖、新安江和淮河干流)的遺傳多樣性高，群體間遺傳分化不顯著，但群體間可能存在種質(zhì)混雜。