李 歡,孫紅艷,于智勇,孫長(zhǎng)花,2

(1.揚(yáng)州市職業(yè)大學(xué) 生物與化工工程學(xué)院，揚(yáng)州 225012；2.揚(yáng)州大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，揚(yáng)州225009；3.中國(guó)教育部國(guó)際農(nóng)業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品安全研究聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，揚(yáng)州 225009)

Toll樣受體(toll-like receptor,TLR)是存在于免疫細(xì)胞(B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞或樹突狀細(xì)胞等)膜上或細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳遞受體，它們通過(guò)識(shí)別細(xì)胞外病原體相關(guān)分子結(jié)構(gòu)而發(fā)揮非常重要的作用[1]。例如，樹突狀細(xì)胞可通過(guò)Toll樣受體識(shí)別病原體結(jié)構(gòu)，激活適應(yīng)性免疫，確定T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫類型、特異性和持續(xù)時(shí)間[2]。巨噬細(xì)胞表面受體TLR可識(shí)別結(jié)核分枝桿菌的結(jié)構(gòu)以激活胞內(nèi)NF-κB等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，誘導(dǎo)特異性基因表達(dá)，促進(jìn)天然和特異性免疫炎癥反應(yīng)[3-4]。目前，在雞中已鑒定出10個(gè)Toll樣受體家族成員[5]：其中TLR2A、TLR2B、TLR3、TLR4、TLR5和TLR7與哺乳動(dòng)物同源；TLR21與魚類和兩棲動(dòng)物相似；而TLR1LA、TLR1LB和TLR15是雞中特有的Toll樣受體。

家禽生產(chǎn)中常見疾病(禽大腸桿菌病、禽白痢、禽霍亂等)均由革蘭氏陰性細(xì)菌引起，發(fā)病率高達(dá)30%～60%，死亡率為10%～30%，每年造成數(shù)億元損失[6]。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是革蘭氏陰性細(xì)菌致病關(guān)鍵因子，可激活炎性細(xì)胞表達(dá)，產(chǎn)生免疫炎癥反應(yīng)。研究表明LPS感染雛雞后，肝臟中促炎因子基因TNF-α、IL1β和抗炎因子基因TGF-β表達(dá)水平均發(fā)生顯著性變化[7]。目前，已發(fā)現(xiàn)Toll樣受體家族成員TLR4是識(shí)別革蘭氏陰性菌LPS的主要受體[8]。在人和鼠中，TLR4既可通過(guò)髓樣分化因子88(MyD88)依賴性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與免疫反應(yīng)，產(chǎn)生炎性因子IL-6、IL-8和IL1β，又能通過(guò)MyD88非依賴性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路產(chǎn)生IFN-β。隨后，Richze團(tuán)隊(duì)[9]發(fā)現(xiàn)LPS感染小鼠時(shí)TLR4可通過(guò)MyD88依賴和非依賴信號(hào)通路產(chǎn)生IFN-α細(xì)胞因子進(jìn)行免疫。但與哺乳動(dòng)物不同，LPS感染僅能激活雞中TLR4的MyD88依賴性信號(hào)通路，產(chǎn)生炎性因子IL-1β和IL-8；不能激活MyD88非依賴性通路，不能產(chǎn)生IFN-β[10]。這說(shuō)明雞體內(nèi)缺乏功能性LPS-特異的TLR相關(guān)分子-TLR相關(guān)干擾素活化子(TRAM-TRIF)信號(hào)通路，只能依靠MyD88依賴性信號(hào)通路在免疫炎癥反應(yīng)中發(fā)揮作用。

雞TLR4位于17號(hào)染色體，包含3個(gè)外顯子，CDS區(qū)長(zhǎng)度為2 532 bp，編碼843個(gè)氨基酸，在骨髓、胸腺、脾臟、法氏囊、卵巢、肝臟、肺臟、氣管等組織或器官中都有高表達(dá)[11-17]。早期關(guān)于TLR4的研究主要集中在人和小鼠中的免疫反應(yīng)[18-19]，之后多集中于TLR4在癌細(xì)胞的增殖和凋亡、器官移植、傷口愈合等過(guò)程中的作用[20]。盡管TLR4在人和鼠中已經(jīng)有了較多研究，但其在家禽中的功能機(jī)制還尚未開展。雞TLR4和人TLR4的同源性小于50%，存在物種特異性且其信號(hào)通路有差異。近期的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序發(fā)現(xiàn)雞TLR4及其信號(hào)通路在禽致病性大腸桿菌或禽腸炎沙門氏桿菌感染時(shí)都會(huì)發(fā)生顯著性變化[15-17]，但對(duì)雞TLR4在免疫細(xì)胞中的功能機(jī)制研究較少。

以雞巨噬細(xì)胞HD11和鼠傷寒沙門氏桿菌衍生的脂多糖LPS為研究材料，利用TLR4基因過(guò)表達(dá)和干擾、qRT-PCR、Western Blot和細(xì)胞凋亡檢測(cè)等技術(shù)和方法分析雞TLR4在細(xì)胞免疫炎癥中的作用，為控制過(guò)度炎癥反應(yīng)提供新思路和干預(yù)靶點(diǎn)，對(duì)緩解應(yīng)激性病理?yè)p傷和提高家禽健康具有實(shí)踐意義。

1 材料與方法

1.1 材料

雞巨噬細(xì)胞HD11來(lái)自揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院遺傳實(shí)驗(yàn)室。RPMI-1640培養(yǎng)基、優(yōu)質(zhì)胎牛血清(FBS)、0.25%胰蛋白酶消化液均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；Silencer?select siRNA試劑盒、NE-PERTMNuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents試劑盒、Pierce?BCA Protein Assay Kit試劑盒、RNAlater?RNA Stabilization Solution購(gòu)自Thermo Fish Scientific公司；RNAqueous?Kit 試劑盒和DNA-freeTMDNA Removal Kit購(gòu)自Gibco公司；Thermoscript RT-PCR試劑盒、LipofectamineTMRNAiMAX、BLOCK-iTTMAlexa Fluor?購(gòu)自Invitrogen；QuantiTect SYBR Green RT-PCR Kit試劑盒購(gòu)自Qiagen公司；Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；LPS購(gòu)自Sigma公司；兔抗雞TLR4及兔抗雞 β-actin抗體購(gòu)自Abcam公司，羊抗兔IgG二抗購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

雞巨噬細(xì)胞HD11移入RPMI-1640培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色后顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。細(xì)胞活力為90%～95%時(shí)用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.2 RNA干擾

根據(jù)雞TLR4基因的不同外顯子，利用BLOCK-iTTMRNAi Designer設(shè)計(jì)3個(gè)siRNA，分別為siRNA-1、siRNA-1-2和siRNA-1-3。siRNA-1：5′-CAGUCUGGUCUUGCUAGACAUUUUCU-3′，siRNA-2：5′-CAGUAGCAUGCUCAGUGACUGUGUGU-3′，siRNA-3：5′-CCGAU-AUCUGAGGAGGAACACUUAU-3′。引物由上海生工生物公司合成。按照Silencer?select siRNA試劑盒說(shuō)明書，將5組siRNA(siRNA-1，siRNA-2，siRNA-3，siRNA-1、-2、-3混合和陰性對(duì)照)(0.1 μmol/L)分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞。LipofectamineTMRNAiMAX轉(zhuǎn)染6 h后熒光顯微鏡下用BLOCK-iTTMAlexa Fluor?紅色熒光質(zhì)控劑(20 μmol/L)評(píng)估轉(zhuǎn)染效率。

1.2.3 LPS刺激HD11細(xì)胞

轉(zhuǎn)染24 h后，不同濃度(0.1、0.5、1.0或5 μg/mL)LPS感染雞巨噬細(xì)胞HD11，0 μg/mL LPS為對(duì)照組。感染2、4、8和12 h后，收集細(xì)胞并放入RNAlater?RNA Stabilization Solution，4 ℃過(guò)夜；后將樣品儲(chǔ)存于-80 ℃，以備后續(xù)RNA提取實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 RNA分離和DNA酶處理

利RNAqueous?Kit試劑盒分離RNA。后用DNA-freeTMDNA Removal Kit處理總RNA。RNA質(zhì)量和數(shù)量分別通過(guò)Nanodrop、瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.5 qRT-PCR實(shí)驗(yàn)

用Thermoscript RT-PCR試劑盒將不同處理組總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。利用7300實(shí)時(shí)PCR儀和QuantiTect SYBR Green RT-PCR試劑盒，以cDNA為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR擴(kuò)增。qRT-PCR分析候選基因TLR4、IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β、IL-8、IFN-α以及標(biāo)準(zhǔn)化基因GAPDH的mRNA表達(dá)量。擴(kuò)增體系(總體積為25 μL)：cDNA 1 μL，QuantiTect SYBR Green RT-PCR Master Mix(2×)12.5 μL，QuantiTect RT Mix 0.25 μL，上游下游引物(表1)各1 μL，ddH2O 9.25 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性15 min；94 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)循環(huán)結(jié)束時(shí)檢測(cè)熒光信號(hào)，以每1 s上升1 ℃的速度從70 ℃升高到90 ℃，進(jìn)行熔解曲線分析，獲得每個(gè)樣本的Ct值，根據(jù)公式ΔΔCt=40-[(檢測(cè)基因的平均Ct值)+(GAPDH的中位Ct值-GAPDH的平均Ct值)×(檢測(cè)基因的斜率/GAPDH的斜率)]。通過(guò)2-ΔΔCt法計(jì)算各基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物序列信息Table 1 Primer sequence information

1.2.6 Western Blot實(shí)驗(yàn)

根據(jù)NE-PERTMNuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents試劑盒說(shuō)明書提取細(xì)胞總蛋白。主要過(guò)程為去除培養(yǎng)瓶中上清培養(yǎng)液，PBS清洗3次，分別用包漿蛋白裂解液I和II漂洗細(xì)胞，去除裂解液。轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管，14 000 r/min離心5 min后取上清液。利用BCA Protein Assay Kit試劑盒測(cè)定蛋白濃度。對(duì)檢測(cè)后的蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行120 V、4 ℃條件的SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜PVDF 90 min，3%牛血清白蛋白封閉2 h；加入目的蛋白(TLR4和β-actin)一抗(1∶1 000)4 ℃孵育過(guò)夜；后TBST洗滌(3～4次，10 min/次)，加入辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記抗體(二抗，1∶2 000)孵育2 h，經(jīng)ECL試劑顯色，化學(xué)發(fā)光顯影。以β-actin作為內(nèi)參對(duì)照基因，用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行顯影檢測(cè)TLR4蛋白表達(dá)情況。

1.2.7 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡

利用碧云天Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒分析不同處理組細(xì)胞凋亡率。將細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板，48 h后吸取細(xì)胞培養(yǎng)液至離心管，PBS洗滌，加入胰酶消化細(xì)胞；收集細(xì)胞培養(yǎng)液并吹打細(xì)胞，3 000 r/min離心5 min，棄上清液，PBS重洗細(xì)胞并計(jì)數(shù)；取5～10萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，3 000 r/min離心5 min，棄上清液，加入195 μL Annexin V-FITC結(jié)合液重懸細(xì)胞；加入5 μL Annexin V-FITC，混勻；加入10 μL PI染色液，混勻；室溫避光10～20 min后立即用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

經(jīng)qRT-PCR檢測(cè)后，利用JMP統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。固定效應(yīng)為siRNA、處理組、時(shí)間以及各效應(yīng)間的相互作用。隨機(jī)效應(yīng)為樣品批次。利用JMP軟件對(duì)siRNA、處理組、時(shí)間效應(yīng)最小二乘(Least squares method,LS)平均值進(jìn)行多重比較。采用圖基真實(shí)顯著差異[Tukey’s honestly significant difference(Tukey HSD)]算法來(lái)確定顯著性差異。顯著水平為P<0.05；極顯著水平為P<0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 LPS劑量和處理時(shí)間對(duì)雞TLR4及其相關(guān)基因表達(dá)的影響

為確定鼠傷寒沙門氏桿菌衍生的LPS感染雞巨噬細(xì)胞HD11的最佳劑量和時(shí)間，通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)TLR4、IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β、IL-8和IFN-α基因在不同感染時(shí)間和感染劑量時(shí)mRNA表達(dá)水平。結(jié)果顯示，LPS不同劑量和感染時(shí)間均可顯著性影響細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)，劑量和時(shí)間之間無(wú)顯著互作(表2)。

表2 LPS劑量和感染時(shí)間對(duì)雞HD11細(xì)胞中免疫相關(guān)基因應(yīng)答的影響Table 2 Effect of LPS dose and infection time on the expression of immune related genes in chicken HD11 macrophages (P values)

與對(duì)照組相比，0.5 μg/mL LPS可顯著性誘導(dǎo)雞巨噬細(xì)胞HD11發(fā)生免疫應(yīng)答反應(yīng)(圖1)；1 μg/mL LPS誘導(dǎo)基因TLR4、IL-1β、IL-8和IL-6表達(dá)量在感染8 h后達(dá)到峰值(圖1)；5 μg/mL LPS在感染8 h后使基因TNF-α、TGF-β和IFN-α的表達(dá)量達(dá)到最高值，但與劑量為1 μg/mL LPS相比差異不顯著(圖1)。因本研究旨在驗(yàn)證LPS感染時(shí)雞巨噬細(xì)胞HD11中TLR4基因功能，故選擇LPS劑量為1 μg/mL、感染時(shí)間為8 h用于后續(xù)功能鑒定實(shí)驗(yàn)。

(a)LPS感染2 h后免疫相關(guān)基因表達(dá)量；(b)LPS感染4 h后免疫相關(guān)基因表達(dá)量；(c)LPS感染8 h后免疫相關(guān)基因表達(dá)量；(d)LPS感染12 h后免疫相關(guān)基因表達(dá)量。圖中不同字母(a、b、c和d)代表不同組間差異顯著(P<0.05)；相同字母代表差異不顯著(P>0.05)。圖1 LPS感染雞巨噬細(xì)胞HD11后TLR4、IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β、IL-8和IFN-α 基因的表達(dá)量變化Figure 1 Changes in gene expression of TLR4,IL-1β,IL-6,TNF-α,TGF-β,IL-8 and IFN-α in chicken HD11 cells infected by LPS

2.2 siRNA干擾TLR4基因

siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，熒光顯微鏡觀察，轉(zhuǎn)染效率為86.28%±1.08%(圖2)；存在熒光標(biāo)記，表明siRNA已成功轉(zhuǎn)染至雞巨噬細(xì)胞HD11[圖2(c)]。不同干擾載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，結(jié)果顯示基因TLR4mRNA表達(dá)量在TLR4-siRNA-2和空白對(duì)照組之間存在顯著性差異(P<0.05)；在TLR4-siRNA-3和空白對(duì)照組之間存在極顯著性差異(P<0.01)。TLR4-siRNA-2和TLR4-siRNA-3均能對(duì)TLR4基因產(chǎn)生不同程度的沉默，干擾效率分別為62%和76%[圖3(a)]，TLR4-siRNA-3沉默效果最為顯著。同時(shí)，進(jìn)一步檢測(cè)到TLR4-siRNA-3組TLR4蛋白表達(dá)量顯著性降低[圖3(b)和(c)]。因此，TLR4-siRNA-3沉默基因TLR4表達(dá)的效果最佳，最終確定TLR4-siRNA-3用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

(a)普通燈下細(xì)胞狀態(tài)；(b)熒光燈下細(xì)胞狀態(tài)；(c)為(a)和(b)的合并圖像。圖2 熒光siRNA轉(zhuǎn)染24 h后的細(xì)胞狀況(標(biāo)尺100 μm)Figure 2 The morphology of cells after fluorescent siRNA transfection 24 h (scale 100 μm)

(a)不同處理組轉(zhuǎn)染雞HD11細(xì)胞后TLR4 mRNA的表達(dá)水平；(b)TLR4-siRNA-3轉(zhuǎn)染雞HD11細(xì)胞后Western Blot檢測(cè)TLR4蛋白的表達(dá)；(c)Western Blot評(píng)估TLR4-siRNA-3轉(zhuǎn)染的雞HD11細(xì)胞和兩個(gè)對(duì)照細(xì)胞中TLR4蛋白表達(dá)的水平。圖中不同字母(a、b、c和d)代表不同組間差異顯著(P<0.05);相同字母代表差異不顯著(P>0.05)。圖3 siRNA敲低TLR4后在雞HD11細(xì)胞中的表達(dá)Figure 3 The expression of TLR4 in chicken HD11 cells after siRNA knockdown

2.3 LPS感染時(shí)干擾TLR4對(duì)細(xì)胞免疫炎性基因表達(dá)的影響

以GAPDH為內(nèi)參基因，qRT-PCR檢測(cè) LPS感染siRNA干擾TLR4基因的雞HD11細(xì)胞免疫和炎性相關(guān)基因表達(dá)量的影響。由圖4可知，與對(duì)照組相比，基因IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的表達(dá)量在TLR4-siRNA-3轉(zhuǎn)染的雞HD11細(xì)胞中顯著性下降，其表達(dá)模式與基因TLR4一致(P<0.05)；而基因TGF-β和IFN-α相對(duì)表達(dá)量下降不顯著(P>0.05)，見圖4。LPS感染時(shí)，TLR4-siRNA-3組中TLR4表達(dá)量顯著性低于對(duì)照組；IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的表達(dá)趨勢(shì)與TLR4一致；而TGF-β和IFN-α的相對(duì)表達(dá)量差異不顯著。

圖中不同字母(a、b、c和d)代表不同組間差異顯著(P<0.05)；相同字母代表差異不顯著(P>0.05)。圖4 LPS(1 μg/mL)感染8 h后，TLR4-siRNA-3轉(zhuǎn)染的雞HD11細(xì)胞中TLR4、IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、TGF-β和IFN-α基因表達(dá)量變化Figure 4 The expression level of TLR4,IL-1β,IL-6,IL-8,TNF-α,TGF-β and IFN-α in chicken HD11 macrophages transfected with TLR4-siRNA-3 after 8 h of LPS (1 μg/mL) infection

2.4 干擾TLR4基因抑制LPS感染的雞HD11細(xì)胞凋亡

(a)對(duì)照組細(xì)胞凋亡分布；(b) LPS感染組細(xì)胞凋亡分布；(c)干擾TLR4基因的LPS感染組細(xì)胞凋亡分布；(d) 對(duì)照組、LPS感染組和干擾TLR4的LPS感染組細(xì)胞凋亡率。圖中不同字母(a、b和c)代表不同組間差異顯著(P<0.05)；相同字母代表差異不顯著(P>0.05)。圖5 干擾TLR4基因?qū)PS感染的雞HD11細(xì)胞凋亡的影響Figure 5 Effect of interference with TLR4 gene on apoptosis of chicken HD11 macrophage after LPS infection

利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)LPS感染前后干擾TLR4后細(xì)胞凋亡率。相比對(duì)照組(91.56%)，LPS感染組活細(xì)胞數(shù)量(71.12%)顯著下降，而干擾基因TLR4后活細(xì)胞數(shù)量(83.16%)有所增加(圖5)。LPS感染組總細(xì)胞凋亡率為27.49%，相比對(duì)照組的6.96%差異顯著(P<0.05)；而干擾TLR4后感染LPS，總細(xì)胞凋亡率降為15.15%，與LPS感染組和對(duì)照組均差異顯著(P<0.05)。

3 討論與結(jié)論

LPS是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁外壁的組成成分，作為內(nèi)毒素可作用于人或動(dòng)物的各種細(xì)胞，激活免疫反應(yīng)。Zhang等[21]發(fā)現(xiàn)0.5 μg/mL大腸桿菌O55：B5衍生的LPS可顯著激活肉雞免疫反應(yīng)；而Van Goor等[22]的研究顯示0.2 μg/mL腸炎沙門氏桿菌衍生的LPS誘導(dǎo)雞巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞產(chǎn)生免疫反應(yīng)的效果最佳；Michailidis等[23]證實(shí)1 μg/mL大腸桿菌O111：B4衍生的LPS對(duì)雞睪丸支持細(xì)胞的感染效果最優(yōu)。這些研究表明不同來(lái)源的LPS以及不同劑量的LPS對(duì)細(xì)胞免疫反應(yīng)激活程度不同。研究通過(guò)劑量梯度試驗(yàn)證明1 μg/mL鼠傷寒沙門氏桿菌衍生的LPS能最有效激活TLR4信號(hào)通路并促進(jìn)炎癥細(xì)胞因子基因表達(dá)。同時(shí)，前期已證實(shí)雞巨噬細(xì)胞HD11在感染禽致病性大腸桿菌6 h后開始大量凋亡[24]。Sipos 等[25]研究發(fā)現(xiàn)LPS感染細(xì)胞6、12和24 h后，可激活TLR4信號(hào)傳導(dǎo)。研究通過(guò)時(shí)間梯度試驗(yàn)證明1 μg/mL 鼠傷寒沙門氏桿菌衍生的LPS在感染8 h 后TLR4及其相關(guān)的免疫炎癥基因表達(dá)水平變化極顯著且達(dá)到峰值。

目前，研究已證明敲除TLR4基因的小鼠會(huì)降低免疫反應(yīng)，改善同種異體移植排斥反應(yīng)[7]。同時(shí)發(fā)現(xiàn)干擾TLR4可調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞的增殖和凋亡[8]，表明TLR4可能是肝癌治療的潛在靶標(biāo)。在傷口修復(fù)中發(fā)現(xiàn)，小鼠中敲除TLR4基因可顯著性降低TNF、IL6和IL10基因的表達(dá)水平[19]，有利于傷口愈合。在LPS感染的小鼠中發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)TLR4可以加劇肺臟炎癥的損傷[26]。上述研究結(jié)果表明，TLR4對(duì)炎癥反應(yīng)的緩解以及其TLR4/MyD88通路對(duì)宿主免疫的調(diào)節(jié)都發(fā)揮著關(guān)鍵作用，且能調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和凋亡。因此，本研究成功干擾TLR4基因后，發(fā)現(xiàn)LPS感染雞巨噬細(xì)胞HD11時(shí)促炎因子基因IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α表達(dá)量顯著性降低，且有效抑制雞HD11細(xì)胞的凋亡。這些結(jié)果表明雞TLR4基因?qū)Υ傺仔砸蜃踊虻谋磉_(dá)有正向調(diào)節(jié)作用；干擾TLR4基因可以積極緩解雞HD11細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。此結(jié)果與前期研究結(jié)果一致，即雞TLR4基因只能依賴TLR4/MyD88信號(hào)傳導(dǎo)通路參與免疫，進(jìn)而激活NF-κB信號(hào)通路，產(chǎn)生免疫炎性因子IL-8、IL-6、IL-1β和TNF[27-28]。TLR4作為L(zhǎng)PS的受體之一，干擾TLR4基因可能降低了內(nèi)毒素LPS結(jié)合受體的能力，減少了感染概率，從而降低了免疫反應(yīng)和炎性因子基因的表達(dá)。具體雞TLR4基因以何種方式發(fā)揮調(diào)控功能，仍需進(jìn)一步研究。

盡管前期已有報(bào)道證明在各種疾病中TLR4與TGF-β或IFN-α基因之間存在聯(lián)系。例如：在膀胱移行細(xì)胞癌T24中存在TLR4與TGF-β的相互作用[29]；TLR4可通過(guò)TGF-β介導(dǎo)前列腺增生[30]；TLR4可增強(qiáng)IFN-α的抗病毒效益[31]；在LPS感染小鼠時(shí)TLR4信號(hào)通路可產(chǎn)生IFN-α細(xì)胞因子參與免疫反應(yīng)[32]。然而，本研究發(fā)現(xiàn)LPS感染干擾TLR4基因的雞巨噬細(xì)胞HD11時(shí)，抗炎因子基因TGF-β和IFN-α的表達(dá)水平均不受影響，其趨勢(shì)與TLR4不同。此結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證雞TLR4只能通過(guò)TLR4/MyD88信號(hào)通路發(fā)揮作用，且與鼠TLR4作用機(jī)制不同，不能調(diào)控IFN-α基因的表達(dá)；同時(shí)，從側(cè)面證明雞TLR4基因可能是通過(guò)調(diào)節(jié)促炎性因子基因的表達(dá)，而非抗炎性因子基因的表達(dá)，來(lái)緩解過(guò)度炎癥反應(yīng)。

總之，干擾雞TLR4基因能夠負(fù)向調(diào)節(jié)雞巨噬細(xì)胞HD11中促炎因子基因表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡；但不調(diào)節(jié)抗炎性因子基因表達(dá)。研究結(jié)果同時(shí)表明雞TLR4基因的表達(dá)水平是內(nèi)毒素LPS引起細(xì)胞炎癥反應(yīng)的一個(gè)限制性因素。調(diào)節(jié)TLR4基因的表達(dá)可直接影響細(xì)胞對(duì)內(nèi)毒素LPS的炎癥反應(yīng)。小分子化合物局部抑制TLR4基因的表達(dá)可能為控制過(guò)度炎癥反應(yīng)提供新思路和干預(yù)靶點(diǎn)，對(duì)緩解應(yīng)激性病理?yè)p傷和提高家禽健康具有實(shí)踐意義。