陳 婷，李 宏，王 丹，唐燕瓊，唐鴻倩，馬 香，劉 柱

(海南大學(xué) 生命科學(xué)與藥學(xué)院 熱帶生物資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，?？?570228)

DNA甲基化是一種常見(jiàn)的遺傳修飾現(xiàn)象，在生物有機(jī)體中普遍存在，已被證實(shí)參與調(diào)控多種生命活動(dòng)途徑[1]。在真核生物中，胞嘧啶甲基化調(diào)節(jié)發(fā)育基因的表達(dá)，DNA甲基化異常會(huì)導(dǎo)致包括癌癥在內(nèi)的多種疾病[2-3]；在原核生物中，DNA甲基化參與多個(gè)細(xì)胞過(guò)程，包括防止外來(lái)DNA入侵、細(xì)胞周期調(diào)控、DNA錯(cuò)配修復(fù)和基因表達(dá)調(diào)控[4]。在細(xì)菌基因組中存在3種不同形式的DNA甲基化：N6-甲基腺嘌呤(6mA)[5]、N4-甲基胞嘧啶(4mC)[6]和5-甲基胞嘧啶(5mC)[7]，其中6mA是原核生物中最普遍存在的一種甲基化形式。

DNA甲基化的發(fā)生機(jī)制是通過(guò)位點(diǎn)特異性的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(MTase)，將S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine，SAM)中的甲基基團(tuán)添加到腺嘌呤或者胞嘧啶[8]。MTase一般在限制修飾(RM)系統(tǒng)中與同源限制性內(nèi)切酶一起形成蛋白復(fù)合物，該復(fù)合物在進(jìn)入細(xì)胞后會(huì)切割外來(lái)DNA，同時(shí)在宿主DNA的相同識(shí)別位點(diǎn)處進(jìn)行甲基化，以保護(hù)宿主染色體免于被裂解[9-11]。I型RM系統(tǒng)由限制性內(nèi)切酶(HsdR)、修飾性MTase(HsdM)和特異性亞基(HsdS)組成，該限制修飾系統(tǒng)中MTase催化甲基從SAM轉(zhuǎn)移到腺嘌呤的環(huán)外氨基，形成6mA修飾[12]。研究表明，限制修飾系統(tǒng)介導(dǎo)的DNA甲基化在轉(zhuǎn)錄水平上直接或間接地調(diào)節(jié)參與細(xì)菌黏附、定殖的毒力基因表達(dá)[13]。還有一類MTase沒(méi)有同源的限制性內(nèi)切酶，作為孤兒甲基轉(zhuǎn)移酶獨(dú)立發(fā)揮作用[14]。細(xì)菌中研究最多的兩個(gè)孤兒MTase是大腸桿菌DNA腺苷甲基轉(zhuǎn)移酶(Dam)，以及新月形桿菌參與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)的甲基轉(zhuǎn)移酶(CcrM)[15-16]。研究表明，Dam和CcrM催化的位點(diǎn)特異性DNA甲基化參與DNA錯(cuò)配修復(fù)[17]，細(xì)胞周期進(jìn)程控制[18]，染色體復(fù)制起始時(shí)間調(diào)節(jié)和基因表達(dá)調(diào)控[19-20]。鞭毛運(yùn)動(dòng)使得細(xì)菌能夠從不利的環(huán)境向營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)更豐富、更有利于細(xì)菌生存的環(huán)境移動(dòng)，增加細(xì)菌的競(jìng)爭(zhēng)能力[21-23]，是細(xì)菌定殖宿主進(jìn)行致病的關(guān)鍵因素[24]。最新研究表明，MTase參與細(xì)菌毒力和運(yùn)動(dòng)性的調(diào)節(jié)[25-26]。

維氏氣單胞菌(Aeromonasveronii)隸屬于弧菌科氣單胞菌屬，運(yùn)動(dòng)型嗜溫氣單胞菌類[27-28]，是一種革蘭氏陰性兼性厭氧菌，具有較強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)能力，廣泛存在于湖泊、河口、海洋等水生環(huán)境中，在液體和半固體條件下都有較強(qiáng)的運(yùn)動(dòng)能力和定殖能力。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外越來(lái)越多的報(bào)道表明：維氏氣單胞菌已經(jīng)成為一種重要的人、魚(yú)共患致病病原菌，不僅能感染魚(yú)類，給水產(chǎn)養(yǎng)殖造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，也可以感染包括人在內(nèi)的哺乳動(dòng)物，對(duì)人類健康造成嚴(yán)重威脅[29]。通過(guò)對(duì)維氏氣單胞菌C4基因組的分析，發(fā)現(xiàn)一個(gè)I型RM系統(tǒng)甲基轉(zhuǎn)移酶基因hsdM，為探究該基因介導(dǎo)的6mA甲基化對(duì)維氏氣單胞菌C4運(yùn)動(dòng)性的影響，研究構(gòu)建敲除hsdM基因的維氏氣單胞菌C4突變株，并通過(guò)細(xì)菌生長(zhǎng)曲線、運(yùn)動(dòng)能力測(cè)定和相對(duì)差異表達(dá)基因檢測(cè)，初步揭示DNA甲基轉(zhuǎn)移酶調(diào)節(jié)細(xì)菌運(yùn)動(dòng)性的分子機(jī)制，為進(jìn)一步探究維氏氣單胞菌毒力和致病性的調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒、菌株及引物

自殺質(zhì)粒pRE112、大腸桿菌WM3064菌株(Escherichiacoli，WM3064)、維氏氣單胞菌C4(Aeromonasveronii，C4)均由本實(shí)驗(yàn)室保存。研究用于PCR擴(kuò)增及陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子驗(yàn)證的引物及其序列信息如表1所示，引物合成及測(cè)序均由上海生工生物工程股份有限公司完成。

表1 實(shí)驗(yàn)使用的引物Table 1 Primers used in the present study

1.1.2 試劑盒、酶及藥品

細(xì)菌總RNA快速抽提試劑盒購(gòu)自上海生工生物工程有限公司；2×PCR Mix、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、DNA/膠純化試劑盒、無(wú)縫克隆連接酶2×ClonExpress Mix及HiScript II Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)試劑盒均購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司；KpnⅠ-HF、SacⅠ-HF限制性內(nèi)切酶購(gòu)自北京NEB公司；氨芐青霉素(Ampicillin,Amp)、氯霉素(Chloramphenicol,Chl)、二氨基庚二酸(2,6-Diaminopimelic Acid,Dap)及瓊脂粉購(gòu)自索萊寶科技有限公司；蛋白胨、酵母提取物及氯化鈉均購(gòu)自西隴科學(xué)股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 敲除菌株ΔhsdM構(gòu)建

敲除菌株基于同源重組雙交換的原理進(jìn)行構(gòu)建，過(guò)程如圖1所示，概括如下：設(shè)計(jì)特異引物(表1)用于通過(guò)PCR擴(kuò)增hsdM基因的上、下游同源片段；用限制性內(nèi)切酶KpnⅠ-HF、SacⅠ-HF雙酶切pRE112質(zhì)粒得到線性化載體；利用無(wú)縫克隆連接酶2×ClonExpress Mix將上下游同源片段連接到線性化載體上，得到hsdM基因敲除重組質(zhì)粒pRE112-hsdM；通過(guò)電激轉(zhuǎn)化法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌WM3064感受態(tài)細(xì)胞；采用雙親結(jié)合法，使得重組質(zhì)粒從大腸桿菌WM3064穿梭到野生型維氏氣單胞菌C4中；最后，在20%蔗糖板上篩選得到敲除菌株ΔhsdM。

圖1 維氏氣單胞菌中基因hsdM敲除設(shè)計(jì)示意圖Figure 1 Design diagram of hsdM gene deletion in A. veronii

1.2.2 生長(zhǎng)曲線測(cè)定

從平板上挑取維氏氣單胞菌C4野生型和ΔhsdM菌株的單菌落，將其分別接種到添加50 μg/mL氨芐青霉素(Amp)的LB液體培養(yǎng)基中，在30 ℃條件下150 r/min振蕩過(guò)夜培養(yǎng)；次日將菌液以0.02 OD600/mL為終濃度轉(zhuǎn)接到含50 μg/mL Amp的新鮮LB液體培養(yǎng)基中，在30 ℃條件下150 r/min振蕩培養(yǎng)，之后每隔2 h取樣，分別測(cè)定培養(yǎng)物的OD600數(shù)值，并繪制野生型和ΔhsdM菌株的生長(zhǎng)曲線。

1.2.3 細(xì)菌運(yùn)動(dòng)性實(shí)驗(yàn)

挑取維氏氣單胞菌C4野生型和ΔhsdM菌株的單菌落，分別接種于含有50 μg/mL Amp的LB液體培養(yǎng)基中，于30 ℃以 150 r/min振蕩培養(yǎng)12 h；將菌液以0.02 OD600/mL為終濃度轉(zhuǎn)接到含50 μg/mL Amp的LB液體培養(yǎng)基中，于30 ℃以150 r/min振蕩培養(yǎng)20 h，測(cè)定OD600值。取1 mL菌液，用PBS(10 mmol/L，pH 7.4)洗滌一遍后，用PBS 稀釋100倍，將1 μL稀釋后的菌液接種于含有0.3%瓊脂的LB固體培養(yǎng)基上，將平板室溫放置20 min后，置于30 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h，觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

將維氏氣單胞菌C4野生型和ΔhsdM菌株培養(yǎng)至穩(wěn)定期后，收集菌體，使用細(xì)菌總RNA快速抽提試劑盒(Bacteria Total RNA Isolation Kit B518625)提取細(xì)菌總RNA。使用HiScript II Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)試劑盒去除殘留的基因組DNA污染，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。用羅氏 LightCycler 96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行RT-qPCR實(shí)驗(yàn)。反應(yīng)結(jié)束，采取2-ΔΔCt法分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并用Graphpad Prism 8繪制柱狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 敲除菌株ΔhsdM構(gòu)建

使用pRE112載體驗(yàn)證引物，對(duì)轉(zhuǎn)化hsdM基因上下游同源臂片段與pRE112質(zhì)粒連接產(chǎn)物的大腸桿菌WM3064轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增驗(yàn)證，結(jié)果如圖2所示：空載pRE112質(zhì)粒為模板，獲得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度約為500 bp；所篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子為模板，獲得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物約1 700 bp，證明hsdM基因上下游同源臂與載體連接，重組質(zhì)粒pRE112-ΔhsdM構(gòu)建成功。

M：DL5000 DNA Marker；1～14：pRE112-ΔhsdM基因敲除重組質(zhì)粒菌落PCR產(chǎn)物；15：陽(yáng)性對(duì)照；16：陰性對(duì)照 。圖2 菌落PCR驗(yàn)證hsdM基因敲除重組質(zhì)粒pRE112-ΔhsdMFigure 2 Identification of recombinant plasmid pRE112-ΔhsdM using colony PCR

通過(guò)雙親接合將重組載體pRE112-ΔhsdM從大腸桿菌WM3064轉(zhuǎn)移至野生型維氏氣單胞菌C4，并在含20%蔗糖的Amp抗性LB固體培養(yǎng)基上篩選突變菌株。使用hsdM敲除驗(yàn)證引物對(duì)隨機(jī)挑選的單菌落進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖3所示：以野生型維氏氣單胞菌C4基因組為模板的PCR產(chǎn)物約2 400 bp，而陽(yáng)性突變株的菌落PCR擴(kuò)增產(chǎn)物約1 600 bp，表明目標(biāo)基因已經(jīng)從基因組敲除。挑選3個(gè)陽(yáng)性突變株的PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收并送測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示ΔhsdM菌株構(gòu)建成功。

M：DL5000 DNA Marker；1～19：hsdM敲除株菌落PCR產(chǎn)物；20：陽(yáng)性對(duì)照；21：陰性對(duì)照。圖3 菌落PCR驗(yàn)證維氏氣單胞菌hsdM敲除株Figure 3 Identification of A.veroniis train with hsdM deletion using colony PCR

2.2 野生型和ΔhsdM生長(zhǎng)曲線檢測(cè)

為探究hsdM基因敲除對(duì)維氏氣單胞菌生長(zhǎng)的影響，檢測(cè)LB培養(yǎng)基條件下維氏氣單胞菌C4野生型和ΔhsdM的生長(zhǎng)曲線。結(jié)果顯示(圖4)：生長(zhǎng)期的前6 h，敲除株與野生型的生長(zhǎng)速率基本一致；從8 h開(kāi)始，敲除株生長(zhǎng)速率略低于野生型，配對(duì)樣品t檢驗(yàn)顯示二者生長(zhǎng)能力存在顯著差異(P<0.01)；16 h后，野生型生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期，敲除株還在緩慢生長(zhǎng)，直至與野生型生長(zhǎng)水平趨于一致。

2.3 野生型和ΔhsdM的運(yùn)動(dòng)性檢測(cè)

通過(guò)平板運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)探究hsdM基因敲除對(duì)維氏氣單胞菌運(yùn)動(dòng)能力的影響，結(jié)果如圖4所示：野生型和ΔhsdM菌株在平板上形成的菌落形態(tài)差異明顯，野生型向四周發(fā)生顯著遷移，且還有繼續(xù)移動(dòng)的趨勢(shì)；而ΔhsdM菌株遷移距離明顯較小[圖5(a)]。根據(jù)兩株菌的遷移距離繪制柱狀圖，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)二者間具有極顯著差異[圖5(b)]。結(jié)果表明，hsdM基因敲除極顯著限制了維氏氣單胞菌的運(yùn)動(dòng)能力。

采用配對(duì)樣品t檢驗(yàn)確定各時(shí)間點(diǎn)組間生長(zhǎng)差異；n=3。圖4 維氏氣單胞菌C4野生型和hsdM敲除株生長(zhǎng)曲線測(cè)定Figure 4 Growth curves of WT and ΔhsdM

采用配對(duì)樣品t檢驗(yàn)確定組間遷移距離的差異；***P<0.001；n=3。圖5 hsdM敲除對(duì)維氏氣單胞菌C4運(yùn)動(dòng)能力的影響Figure 5 Effects of hsdM deletion on motility

2.4 野生型和ΔhsdM鞭毛基因表達(dá)差異檢測(cè)

細(xì)菌運(yùn)動(dòng)性與鞭毛功能密切相關(guān)。通過(guò)RT-qPCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了一系列鞭毛生物合成基因在維氏氣單胞菌野生型和hsdM敲除株中的相對(duì)表達(dá)水平。檢測(cè)結(jié)果如圖6所示：與野生型相比，ΔhsdM菌株中flgE、flgK、fliH、fliI、fliM和flhH等6個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著下調(diào)。結(jié)果表明，HsdM甲基轉(zhuǎn)移酶可以調(diào)控維氏氣單胞菌C4鞭毛合成基因的表達(dá)。

采用配對(duì)樣品t檢驗(yàn)確定組間鞭毛基因相對(duì)表達(dá)量的差異;* P<0.05；n=3。圖6 維氏氣單胞菌hsdM敲除株中鞭毛基因相對(duì)表達(dá)量變化Figure 6 Changes in relative expressions of flagellum genes caused by hsdM deletion in A. veronii

3 結(jié)論

研究初步確定I型RM系統(tǒng)甲基轉(zhuǎn)移酶(MTase)基因hsdM缺失對(duì)維氏氣單胞菌生長(zhǎng)和運(yùn)動(dòng)能力的影響。與維氏氣單胞菌野生型相比，ΔhsdM菌株的生長(zhǎng)速率有微弱降低；運(yùn)動(dòng)能力極顯著下降；同時(shí)，大部分鞭毛合成關(guān)鍵基因的表達(dá)水平下調(diào)?，F(xiàn)有研究報(bào)道甲基轉(zhuǎn)移酶是介導(dǎo)6mA甲基化的主要機(jī)制[13]，甲基轉(zhuǎn)移酶參與調(diào)節(jié)大腸桿菌的運(yùn)動(dòng)性和定殖[25]，而且與結(jié)核桿菌毒力機(jī)制相關(guān)[26]。研究結(jié)果與上述報(bào)道一致，表明維氏氣單胞菌中的HsdM甲基轉(zhuǎn)移酶可能通過(guò)介導(dǎo)6mA甲基化而調(diào)控維氏氣單胞菌C4鞭毛合成基因的表達(dá)，進(jìn)而影響細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)能力，甚至毒力機(jī)制。后續(xù)結(jié)合單分子實(shí)時(shí)測(cè)序(Single-molecule real-time sequencing，SMRT)技術(shù)繪制維氏氣單胞菌的甲基化組[30]，再通過(guò)甲基化分析和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析hsdM參與調(diào)控細(xì)菌運(yùn)動(dòng)性的信號(hào)傳導(dǎo)通路，有望進(jìn)一步探明hsdM基因介導(dǎo)的6mA甲基化機(jī)制，及其對(duì)細(xì)菌運(yùn)動(dòng)性和毒力的調(diào)控機(jī)理。