周 潔,周子瓊,潘 虎,,盧向陽,張一帆,田 云

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學 生物科學技術(shù)學院，長沙 410128；2.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學院 農(nóng)業(yè)質(zhì)量標準與檢測研究所，拉薩 850032；3.西藏農(nóng)牧學院 食品科學學院，林芝 860000)

青稞(HordeumvulgareL.var.nudum Hook.f.)作為禾本科大麥屬的農(nóng)作物，是青藏高原第一大農(nóng)作物。西藏高寒、低溫、缺氧等極端環(huán)境造成土壤微生物活性較低，導致青藏高原土壤較為貧瘠[1-2]。根瘤菌包括共生固氮細菌和非共生固氮細菌等，是土壤生態(tài)系統(tǒng)中氮素轉(zhuǎn)換和循環(huán)的主要動力，在整個土壤生態(tài)系統(tǒng)中起著不可替代的作用[3-4]。根瘤菌對青稞的生長和發(fā)育起著重要作用，同時青藏高原的獨特氣候條件也造就了獨特的根瘤菌種群。但目前有關(guān)青稞農(nóng)田土壤中根瘤菌的研究較少，特別是低溫環(huán)境下可培養(yǎng)根瘤菌的研究尚屬空白[5-6]。本文采用低溫純培養(yǎng)技術(shù)從西藏昌都市青稞種植農(nóng)田土壤中分離得到兩株根瘤菌疑似新種，針對上述菌株開展了部分生理生化和多基因的初步鑒定，為豐富高寒地區(qū)根瘤菌種質(zhì)資源提供研究基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

2018年4月7日于西藏昌都市邊壩縣拉孜鄉(xiāng)珠村(30°55′48.9″N,94°58′13.4″ E,海拔高度:4011m)按照五點取樣法采集青稞農(nóng)田土壤樣品，土壤樣品混勻后用無菌塑封袋封裝，-18℃保存?zhèn)溆谩培養(yǎng)基：蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g，麥芽糖提取物5.0g，酪蛋白氨基酸5.0g，牛肉提取物2.0g，甘油2.0g，吐溫-8050.0mg，MgSO4·7H2O1.0g，瓊脂18.0g，蒸餾水1000mL，pH7.2～7.6。M5培養(yǎng)基：酵母膏4.0g，可溶性淀粉15.0g，K2HPO41.0g，F(xiàn)eSO4·7H2O0.01g，瓊脂18.0g，蒸餾水1000mL，pH7.2～7.6(含25μg/mL萘啶酸和100μg/mL制霉菌素)。LB固體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，瓊脂18.0g，蒸餾水1000mL，pH7.0。

1.2 方法

1.2.1菌株的分離與純化

將土壤樣品混勻后取約5g置于含50mL 滅菌蒸餾水的三角瓶中，25℃、180r/min 振蕩搖勻10min，靜置30s后取1mL 菌液梯度稀釋至10-3、10-4和10-5，均勻涂布于R和M5分離培養(yǎng)基上，接種量為0.05mL，每組處理設(shè)3個重復(fù)。4℃培養(yǎng)60d后挑取明顯菌落于LB固體培養(yǎng)基上反復(fù)劃線至純培養(yǎng)物。

1.2.2菌株的形態(tài)學觀察和生理生化鑒定

供試菌株形態(tài)學觀察和生理生化鑒定參考文獻[7]。最適生長溫度、起始pH值、鹽度等培養(yǎng)條件參考凌娟等[8]。

1.2.3菌株基因組DNA的提取及16S rRNA序列的測定

采用TIANGEN公司細菌基因組DNA提取試劑盒(DP302)提取菌株總DNA，具體步驟按說明書操作，所提取總DNA于-20℃保藏備用。用提取的總DNA為模板，采用PCR法擴增16S rRNA基因序列片段，PCR反應(yīng)體系和擴增程序參考Heng等[9]，擴增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送至南京金唯智生物科技有限公司進行測序。

1.2.4菌株6對管家基因的序列測定

采用ATP操縱子(atpD)、重組蛋白A(recA)、RNA聚合酶β亞基(rpoB)、蘇氨酸合酶(thrC)和谷氨酰胺合成酶(glnII和glnA)共6對管家基因進行菌株的多基因初步鑒定[10]，擴增引物見表1，多基因PCR反應(yīng)體系和擴增程序參考1.2.3進行。

表1 6對管家基因擴增引物Table 1 The amplification primers of 6 pairs housekeeping gene

1.2.5 基因序列分析與系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

采用NCBI、EzBioCloud等數(shù)據(jù)庫開展Blast比對分析，采用CLUSTAL X軟件進行多基因列比對，利用MEGA 7.0中的最大似然估計法(Maximum-likelihood)建立供試菌株序列系統(tǒng)發(fā)育樹[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株T786和T808的形態(tài)學和生理生化特征

經(jīng)過60 d的低溫培養(yǎng)，從R和M5培養(yǎng)基上分別純化得到23株和20株細菌，經(jīng)過篩選從R和M5培養(yǎng)基上分別挑選1株細菌(編號為T786和T808)進行后續(xù)研究。常溫下，菌株T786和T808在LB培養(yǎng)基上2～3 d可形成1 mm左右的菌落，革蘭氏陰性菌、短桿狀、菌落圓形、乳白色、光滑、有光澤、中間凸起、邊緣整齊、表面濕潤不透明(圖1)。菌株T786和菌株T808的主要生理生化特征及碳氮利用情況見表2。

表2 菌株T786和T808的主要生理生化特征及碳氮源利用情況Table 2 The main physiological,biochemical characteristics and utilization of carbon and nitrogen sources of strains T786 and T808

圖1 菌株T786和T808在LB平板上的形態(tài)特征Figure 1 The morphological characteristics of strains T786 and T808 on LB plate

2.2 菌株T786和T808的16S rRNA鑒定

菌株T786和T808的16S rRNA基因測序結(jié)果經(jīng)EzBioCloud數(shù)據(jù)庫比對分析顯示：菌株T786與標準菌株NeorhizobiumvignaeCCBAU 05176T、NeorhizobiumalkalisoliCCBAU01393T、NeorhizobiumtomejilenseT17_20T、NeorhizobiumhuautlenseS02T、NeorhizobiumgalegaeATCC43677T和“Neorhizobiumlilium24NRT”的相似度分別為98.70%、98.47%、98.24%、98.16%、97.79% 和 96.55%。菌株T808與標準菌株P(guān)ararhizobiumherbaeCCBAU83011T、PararhizobiumpolonicumF5.1T、PararhizobiumgiardiniiH152T、PararhizobiumantarcticumNAQVI 59T、PararhizobiumsphaerophysaeCCNWGS0238T、PararhizobiumcapsulatumIFAM 1004T、PararhizobiumhaloflavumXC0140T的相似度分別為98.79%、98.65%、98.50%、98.69%、98.36%、97.05%和95.58%。菌株T808的16S rRNA基因Clustal X比對發(fā)現(xiàn)，該菌株較Pararhizobium屬菌株在16S rRNA基因的V1～V2區(qū)存在40 bp左右的堿基插入，但該菌株與Uncultured bacterium clone barrow_FF_26 (JX668750.1)、Rhizobiumsp.Ia8 (KF444807) 和Rhizobiaceae bacterium strain FW305-C-27(MN067584)等3株未培養(yǎng)微生物卻不存在上述差異，表明菌株T808與Pararhizobium屬現(xiàn)存的7個微生物種類差異較大(圖2)。

圖2 菌株T808的16S rRNA基因V1～V2區(qū)Clustal X分析結(jié)果Figure 2 The Clustal X analysis of V1-V2 region of 16S rRNA gene in strain T808

通過菌株T786和T808的16S rRNA基因序列及EzBioCloud數(shù)據(jù)庫中與其相近標準菌株所建立的系統(tǒng)進化樹(圖3)，結(jié)果顯示菌株T786和T808處于單獨的進化分支，且與其相近參考標準菌株存在明顯進化分歧，故推測上述菌株為潛在的根瘤菌新種，將其分別命名為Neorhizobiumsp.T786和Pararhizobiumsp.T808。

圖3 菌株T786和T808及其相關(guān)菌株的16S rRNA序列系統(tǒng)進化聚類圖Figure 3 Phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequences of T786,T808 and related species

2.3 菌株T786和T808的6對管家基因的鑒定

菌株T786和T808的6對管家基因相似度和多基因平均核酸一致性(average nucleotide dentity，ANI)值均遠小于根瘤菌新種閾值(95%～96%)[12]，菌株T786和T808為潛在的根瘤菌新種(表3和表4)。

表3 菌株T786與相似標準菌株的6對管家基因相似度Table 3 The similarity of 6 pairshousekeeping genes between T786 and similar standard strains

表4 菌株T808與相似標準菌株的6對管家基因相似度Table 4 The similarity of 6 pairshousekeeping genes between T808 and similar standard strains

3 討論與結(jié)論

根瘤菌是一類革蘭氏陰性細菌，主要歸屬于原核生物細菌域、變形桿菌門下的α-變形桿菌綱和β-變形桿菌綱，共17屬[4]，它能夠侵染豆科作物、牧草、樹種植物的根部或莖部形成共生體根瘤(或莖瘤)，并在其中將空氣中的游離態(tài)的氮氣轉(zhuǎn)化成植物可以利用的化合態(tài)氮，為宿主植物的生長提供必需的氮素營養(yǎng)[13]，但近年來越來越多的缺失固氮和結(jié)瘤功能的根瘤菌被發(fā)現(xiàn)[14-16]。研究表明16S rRNA 基因相似性為98.65%是細菌種水平分類的重要閾值[17]，但16S rRNA基因作為細菌分類鑒定的重要手段具有一定的局限性，同時由于根瘤菌系統(tǒng)進化的保守性等原因，即便16S rRNA相似度高達99.0%的根瘤菌，仍然可能是不同的物種。atpD、recA、rpoB、thrC、glnII和glnA等管家基因具有較高的穩(wěn)定性、普遍性和分辨率,適合作為種系分類的分子標記，管家基因相似性為95%～96%作為不同細菌物種分類的閾值具有較高的可靠性[18-19]，其作為16S rRNA 基因初步分類的重要補充得到廣泛應(yīng)用。本文對西藏昌都市青稞種植農(nóng)田土壤分離菌株T786和T808的atpD、recA、rpoB、thrC、glnII和glnA等6對管家基因序列分析顯示，菌株Neorhizobiumsp.T786和Pararhizobiumsp.T808的6對管家基因相似度和多基因ANI值均遠小于根瘤菌新種95%～96%的閾值，菌株T786和T808為潛在的根瘤菌新種，Pararhizobium和Neorhizobium是近年來由Mousavi等[10,20]提出的根瘤菌新屬，菌株T786和T808的發(fā)現(xiàn)對豐富Pararhizobium和Neorhizobium屬新物種和青藏高原地區(qū)根瘤菌種質(zhì)資源具有重要的意義，為西藏本土農(nóng)業(yè)微生物資源的開發(fā)與利用提供重要材料。