郭 紅王少瑋謝文靜周 俊蔣書云劉金成楊 劍金 屏

(空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院心血管外科,西安 710032)

阿霉素(doxorubicin,Dox)是一種有效的蒽環(huán)類抗生素,可用于治療白血病、淋巴瘤和多種實(shí)體腫瘤[1],但其劑量依賴性的心臟毒副作用限制了Dox的臨床應(yīng)用[2]。 Dox 引起的心臟毒性是一種復(fù)雜的包括線粒體氧化應(yīng)激在內(nèi)的多因素過(guò)程,主要表現(xiàn)為線粒體功能被抑制,進(jìn)而導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷[3]。

線粒體約占心肌細(xì)胞體積30%以上,以滿足心臟持續(xù)的能量需求[4]。 線粒體質(zhì)量控制是調(diào)控線粒體大小、形態(tài)及生物活性等的重要調(diào)控機(jī)制[5-6],當(dāng)受損的線粒體不能恢復(fù)到健康狀態(tài)時(shí),線粒體自噬(mitophagy)便成為細(xì)胞凋亡和壞死之前移除受損的線粒體并維持細(xì)胞活力的最后保障[7]。 其中絲氨酸/蘇氨酸激酶1(Pink1)及E3 連接酶Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬在Dox 誘導(dǎo)心肌毒性線粒體功能障礙的消除中起關(guān)鍵作用[8],然而其機(jī)制尚待進(jìn)一步闡明。

槲皮素(Quercetin, Que)屬于一種黃酮類化合物,存在于多種蔬菜食品包括蘋果、紅茶、綠茶、洋蔥、紅酒、紅葡萄、柑橘類水果、櫻桃、不同漿果如覆盆子、越橘和蔓越莓、花椰菜和其他多葉綠色蔬菜中[9]。 在植物中由苯丙氨酸經(jīng)苯丙烷途徑產(chǎn)生,具有抗癌、抗糖尿病、抗炎和抗氧化(清除自由基)等多種生物學(xué)功能[10-11]。 有研究證實(shí),Que 可通過(guò)酸水解法及酶轉(zhuǎn)化法等方法進(jìn)行分離提純,并通過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)溶液曲線,以紫外分光光度計(jì)法進(jìn)行濃度測(cè)定[12]。 此外,Que 對(duì)于心血管疾病具有重要的預(yù)防和治療效果[13],如Que 對(duì)Dox 誘導(dǎo)的心臟毒性的保護(hù)作用[14],然而其對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用是否通過(guò)Pink1/Parkin 依賴的線粒體自噬未見報(bào)道。

本研究擬建立Dox 誘導(dǎo)的小鼠及nmCMs 細(xì)胞毒性模型[15],驗(yàn)證Pink1/Parkin 依賴的線粒體自噬在Que 緩解Dox 心肌毒性中的具體作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

所有的實(shí)驗(yàn)方案均經(jīng)第四(空軍)軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心福利與倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)(20200445),并按照美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用指南實(shí)施。 本研究中使用SPF 級(jí),8 周齡,體重為20~22 g 的雄性C57BL/6J 小鼠,共計(jì)40只;1~3 d(1.5~2 g)大小的C57BL/6J 乳鼠(SPF級(jí)),共計(jì)50 只。 均由空軍軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)并提供[SCXK(陜)2019-001][SYXK(陜)2019-001],在研究中均遵循3R 原則。

1.2 主要試劑與儀器

Que 標(biāo)準(zhǔn)品(貨號(hào):SQ8030) 及Que(貨號(hào):Q8010)均購(gòu)買自Solarbio 公司(中國(guó));CCK-8 細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所(貨號(hào):G021-1);DOX 購(gòu)自Tocris 公司(Bristol,英國(guó),貨號(hào):2252);辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔(貨號(hào):ZB2301)、山羊抗鼠(貨號(hào):ZB-2305)二抗購(gòu)自北京中山金橋生物技術(shù)有限公司;胎牛血清(貨號(hào):16010159)、雙抗(貨號(hào):15140163)、DMEM 培養(yǎng)基(貨號(hào):11965092) (美國(guó))、GAPDH 抗體(貨號(hào):51332)、Pink1(貨號(hào):46421)、Parkin(貨號(hào):4211)、P62(貨號(hào):23214)、LC3(貨號(hào):4108)及Beclin1(貨號(hào):3495)購(gòu)自CST 公司(美國(guó));線粒體自噬激動(dòng)劑SB-203580(貨號(hào):HY-10256)及線粒體自噬抑制劑3-Methyladenine (3 MA) (貨號(hào):HY-19312) 購(gòu)自MedChemExpress (MCE,美國(guó));Pierce 原代心肌細(xì)胞分離試劑盒(thermo fisher scientific,美國(guó));線粒體分離試劑盒(abcam,美國(guó));蛋白酶抑制劑(南京建成,中國(guó));Bradford 試劑盒(Pierce Biotechnology,美國(guó))。 Olympus 熒光顯微鏡(Olympus,日本);Image Lab(Bio-Rad 公司,美國(guó));SpectraMax M5 分光光度計(jì)(美國(guó))。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 小鼠在體實(shí)驗(yàn)與原代心肌模型建立及實(shí)驗(yàn)分組

將Dox 以磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline, PBS)溶解后制成10 mmol/L 儲(chǔ)備液。 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為如下4 組:(1)對(duì)照組(Con):實(shí)驗(yàn)小鼠以正常飲食喂養(yǎng)。 (2)槲皮素處理組(Que):小鼠以50 mg/kg Que 灌胃處理1 周[16]。 (3)阿霉素組(Dox):小鼠隔天以3 mg/kg 劑量腹腔注射Dox,持續(xù)2 周。 (4)阿霉素-槲皮素組(Dox-Que):小鼠以50 mg/kg Que 灌胃處理1 周,隨后隔天以3 mg/kg劑量腹腔注射Dox,持續(xù)2 周。 所有藥物處理結(jié)束后飼養(yǎng)4 周。 離體實(shí)驗(yàn)將分離的乳鼠心肌原代細(xì)胞(nmCMs)細(xì)胞以隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)組,藥物處理情況如下:(1)對(duì)照組(Vehicle):nmCMs 細(xì)胞未作任何處理。 (2)槲皮素組(Que):nmCMs 細(xì)胞分別以10 μmol/L 或20 μmol/L Que 預(yù)處理22 h。 (3)阿霉素組(Dox):nmCMs 細(xì)胞以10 μmol/L Dox 及DMSO 稀釋液共同處理24 h[17]。 (4)阿霉素-槲皮素組(Dox-Que):nmCMs 細(xì)胞以20 μmol/L Que 預(yù)處理22 h[18],再以10 μmol/L Dox 及DMSO 稀釋液共同處理24 h。 (5)阿霉素-槲皮素-線粒體自噬激動(dòng)劑組(Dox-Que-SB):nmCMs 細(xì)胞以20 μmol/L Que 預(yù)處理22 h,再以10 μmol/L Dox 及10 μmol/L SB 共同處理24 h。 (6)阿霉素-線粒體自噬激動(dòng)劑組(Dox-SB):nmCMs 細(xì)胞以10 μmol/L Dox 及10 μmol/L SB 共同處理24 h。 (7)阿霉素+3-甲基腺嘌呤組(Dox-3 MA),nmCMs 細(xì)胞以10 μmol/L Dox 處理16 h 隨后以5 mmol/L 3 MA 共同處理8 h[19]。(8)線粒體自噬激動(dòng)劑組(SB):nmCMs 細(xì)胞以10 μmol/L SB 處理24 h。

1.3.2 乳鼠心肌原代細(xì)胞分離培養(yǎng)

采用Pierce 原代心肌細(xì)胞分離試劑盒分離1~3 d 大小的C57BL/6J 小鼠心肌原代細(xì)胞[20]。 新生小鼠心臟解剖后,立即與心肌細(xì)胞分離酶1 和酶2在37℃孵育30~35 min,Hanks 平衡鹽溶液洗滌兩次,然后轉(zhuǎn)移至DMEM 高糖培養(yǎng)基中。 將分離的乳鼠心肌細(xì)胞置于培養(yǎng)皿中,37℃,5% CO2孵育,剩余的組織以相同的方法處理,直到?jīng)]有殘留。 混合細(xì)胞懸液,收集非貼壁細(xì)胞并計(jì)數(shù),隨后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、青霉素(100 U/mL)和鏈霉素(100 μg/mL)的DMEM 中。以進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 成鼠心肌組織及nmCMs 細(xì)胞線粒體分離

使用線粒體分離試劑盒分離成年小鼠心肌組織及nmCMs 線粒體。 所有程序都按照操作說(shuō)明進(jìn)行。 剪碎心肌組織,nmCMs 用預(yù)冷的PBS 緩沖液清洗。 在3000 r/min 的轉(zhuǎn)速下,將上清液轉(zhuǎn)移到新管中。 在12377 r/min 的轉(zhuǎn)速下再次離心,收集含有胞漿蛋白的上清液。 然后將含有線粒體的顆粒在添加蛋白酶抑制劑混合物的分離緩沖液中清洗,并在12377 r/min 的轉(zhuǎn)速下收集以供進(jìn)一步使用。

1.3.4 線粒體膜電位(mitochondrial membrane petential,MMP)檢測(cè)

利用陽(yáng)離子熒光染料JC-1 對(duì)線粒體膜電位進(jìn)行檢測(cè)。 用藥物處理后,將細(xì)胞與JC-1 工作液在37℃,避光孵育30 min,隨后以PBS 清洗3 次,再以SpectraMax M5(美國(guó))分光光度計(jì)讀取數(shù)值。 數(shù)據(jù)以藥物處理組與對(duì)照組的比值表示。

1.3.5 Western blot 檢測(cè)

使用預(yù)冷的RIPA 裂解緩沖液處理nmCMs 細(xì)胞。 采用Bradford assay 試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)含量。將處理后的細(xì)胞分別收集提取細(xì)胞總蛋白,以SDSPAGE 凝膠電泳分離蛋白樣本,隨后轉(zhuǎn)移至PVDF膜,之后以5 g/100 mL 脫脂牛奶在室溫下孵育2 h,再加入相應(yīng)的一抗抗體于4℃孵育過(guò)夜。 TBST 清洗3 次,每次10 min,與兔二抗孵育2 h。 再次清洗后用化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè),蛋白定量分析使用Image Lab 軟件(Bio-Rad)。

1.3.6 ATP 水平檢測(cè)

按照操作說(shuō)明分離nmCMs 細(xì)胞線粒體后,隨后以ATP 檢測(cè)試劑盒檢測(cè)線粒體內(nèi)ATP 含量。

1.3.7 細(xì)胞活力檢測(cè)

將分離的nmCMs 接種于96 孔板,接種濃度為5×103個(gè)/孔,以前述方法分別進(jìn)行處理后,避光向各孔中加入10 μL CCK-8 溶液,37℃孵育90 min 后在450 nm 波長(zhǎng)下測(cè)量OD 值。 細(xì)胞活力以藥物組細(xì)胞OD 與Con 組細(xì)胞OD 分別減去空白OD 值后的比值表示。

1.3.8 組織病理學(xué)分析

小鼠麻醉后,去除心臟并以PBS 沖洗,隨后將心臟組織于4%多聚甲醛中固定3 d,再以石蠟包埋后切 成 3 μmol/L 切 片, 蘇 木 精 伊 紅 染 色(hematoxylin and eosin,HE),并以Masson’s 三色染色法評(píng)估心肌纖維化程度。 染色結(jié)果以Image J 軟件定量后分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有值均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤差(±sˉx)表示。實(shí)驗(yàn)組之間的差異是通過(guò)單向或雙向ANOVA 分析確定,然后進(jìn)行Tukey post hoc 檢驗(yàn)。t檢驗(yàn)用于組間單因素比較。P<0.05 認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Que 對(duì)Dox 處理后心肌形態(tài)學(xué)改變及對(duì)ROS生成、MMP 及線粒體ATP 含量的影響

心臟組織的組織病理學(xué)檢查顯示,Con 組和Que 治療組小鼠的心肌形態(tài)和肌原纖維正常(圖1A、1B)。 在Dox 處理的心臟切片中觀察到肌原纖維變性和破壞。 Que 處理顯著改善了Dox 誘導(dǎo)的這些損傷。 Masson’s 三色染色的進(jìn)一步研究顯示,與正常對(duì)照組相比,Dox 處理顯著誘導(dǎo)心肌纖維化,而用Que 治療的心肌纖維化在Dox 處理的心臟組織中被顯著抑制(圖1A~1C)。 心肌纖維化定量分析顯示Que 能顯著降低Dox 誘導(dǎo)的心肌纖維化(P<0.05)。 如圖1D,相對(duì)于Con 組,Dox 可顯著增加心肌組織的ROS 生成,Que 預(yù)處理可降低ROS 生成量(P<0.05),而Que 單獨(dú)處理未見對(duì)ROS 生成有顯著改變。 對(duì)不同處理?xiàng)l件的小鼠心肌組織檢測(cè)發(fā)現(xiàn),Dox 處理相對(duì)于Con 組,可顯著降低MMP 含量及線粒體ATP 生成量(P<0.05),這種降低的趨勢(shì)可被Que 預(yù)處理逆轉(zhuǎn)(P<0.05)(圖1E~1F)。

2.2 Que 對(duì)線粒體自噬關(guān)鍵蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)作用

對(duì)不同處理組線粒體自噬標(biāo)志蛋白的檢測(cè)發(fā)現(xiàn),如圖2 所示,Dox 處理相對(duì)于Con 組,可顯著增加Pink1/Parkin 依賴的線粒體自噬及標(biāo)志蛋白Beclin1 及LC3II 的表達(dá)而降低P62 蛋白表達(dá)量(P<0.05),以促進(jìn)線粒體自噬的激活,Que 可通過(guò)抑制Pink1/Parkin 依賴的線粒體自噬的激活Pink1/Parkin 依賴的線粒體自噬(P<0.05),保護(hù)小鼠心肌組織抵抗Dox 引起的細(xì)胞毒性。

2.3 Que/SB 對(duì)nmCMs 細(xì)胞活力及LDH 活性的影響

如圖3A 所示,10 μmol/L Dox 處理6 h 可見細(xì)胞活力較未加入Dox 或Que 組顯著降低,加入20 μmol/L 預(yù)處理后,可顯著增加細(xì)胞活力以逆轉(zhuǎn)Dox引起的細(xì)胞毒性損傷(P<0.05),而Que 單獨(dú)處理未見對(duì)nmCMs 細(xì)胞有顯著影響。 通過(guò)對(duì)不同處理組細(xì)胞培養(yǎng)上清液的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)(圖3B),Dox 可引起LDH 濃度的顯著增加,加入20 μmol/L Que 后LDH濃度較單獨(dú)加入Dox 后顯著降低(P<0.05),但這種降低趨勢(shì)并未隨Que 濃度增加而改變。 此外,SB 單獨(dú)處理并未改變nmCMs 細(xì)胞活力(圖3C)。

注:A:Que 對(duì)Dox 誘導(dǎo)的心肌組織形態(tài)及纖維化的影響。 上側(cè)表示HE 染色,下側(cè)表示Masson 染色;B:心肌細(xì)胞橫截面積;C:心臟纖維化區(qū)域;D:ROS 水平;E:線粒體膜電位;F:ATP 含量。 與對(duì)照組相比, ?P<0.05;與槲皮素組相比, #P<0.05。圖1 Que 可顯著減輕Dox 引起的心肌纖維化,降低ROS 生成與上調(diào)MMP、ATP 含量(n=5)Note.A, Effects of Que on cardiac morphology and fibrosis in Dox-induced cardiomyopathy.The upper panel represents images with HE staining, the lower panel indicates cardiac fibrosis with Masson’s trichrome staining.B, Cardiomyocyte cross-sectional area.C, Cardiac fibrosis area.D, ROS level.E, MMP production.F, ATP content.Compared with Con group, ? P<0.05.Compared with Dox group, # P<0.05.Figure 1 Que treatment significantly attenuates Dox-induced cardiotoxicity, reducing ROS level and increasing MMP and ATP content

注:A:用Western blot 對(duì)不同組的代表性蛋白圖像進(jìn)行分析;B~F:Beclin1、Pink1、Parkin、P62 和LC3 的表達(dá)。 與對(duì)照組相比, ?P<0.05;與槲皮素組相比, #P<0.05。圖2 Que 對(duì)心肌組織中線粒體自噬標(biāo)志蛋白表達(dá)的影響(n=3~5)Note.A, Representative protein images by Western blot from different groups.B~F, Expression of Beclin1, Pink1, Parkin, P62 and LC3.Compared with Con group,? P<0.05.Compared with Dox group, # P<0.05.Figure 2 Que alleviates mitophagy marker protein expression in myocardial

注:A:Dox 和Que 對(duì)細(xì)胞活力的影響;B:Dox 和Que 對(duì)LDH 活性的影響;C:SB(SB-203580)對(duì)細(xì)胞活力的影響。 與對(duì)照組相比, ?P<0.05;與槲皮素組相比, #P<0.05。圖3 Dox、Que 及SB 對(duì)細(xì)胞活力與LDH 的影響(n=3~5)Note.A, The effective of Dox and Que on cell viability.B, The effective of Dox and Que on LDH activity.C, The effective of SB on cell viability.Compared with Vechile group,?P<0.05.Compared with Dox group, # P<0.05.Figure 3 Effect of Que, Dox and SB on cell viability and LDH activity

2.4 Que/SB 對(duì)Dox 誘導(dǎo)下nmCMs 細(xì)胞ROS 生成、MMP 及線粒體ATP 生成量的影響

如圖4A 所示,相對(duì)于Dox 組,Que 預(yù)處理可顯著降低LDH 含量(P<0.05),而SB 加入則部分抵消了Que 對(duì)LDH 活性的抑制作用(P<0.05)。 如圖4B 所示,與Dox 組相比較,Que 預(yù)處理可顯著降低線粒體ROS 生成,而SB 則降低了Que 對(duì)ROS 生成的抑制作用(P<0.05),單獨(dú)加入SB 未見對(duì)Dox 處理細(xì)胞線粒體ROS 生成有顯著改變。

此外(圖4C、4D),對(duì)不同條件下細(xì)胞MMP 及ATP 含量的檢測(cè)發(fā)現(xiàn),Que 預(yù)處理可顯著增加nmCMs 細(xì)胞MMP 及ATP 生成(P<0.05),而SB 可部分抵消Que 對(duì)MMP 及ATP 生成的促進(jìn)作用(P<0.05)。 SB 對(duì)Dox 處理的nmCMs 細(xì)胞MMP 及ATP生成則未見改變。

2.5 Pink1/Parkin 依賴的線粒體自噬對(duì)Dox 引起的心肌細(xì)胞毒性具有重要的調(diào)節(jié)作用

如圖5 所示,nmCMs 細(xì)胞分別以Dox、Que 或SB 處理后,對(duì)線粒體自噬相關(guān)蛋白的檢測(cè)發(fā)現(xiàn),Dox可通過(guò)激活Pink1/Parkin 介導(dǎo)的線粒體自噬,誘導(dǎo)細(xì)胞損傷,以Que 預(yù)處理則可部分抵消Dox 誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性,這種保護(hù)作用是通過(guò)抑制線粒體自噬的激活而實(shí)現(xiàn)的。 而SB 則通過(guò)促進(jìn)Pink1/Parkin 的激活,進(jìn)而顯著逆轉(zhuǎn)Que 對(duì)Dox 誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性的保護(hù)作用。 此外,通過(guò)線粒體自噬抑制劑3 MA 處理nmCMs 細(xì)胞后發(fā)現(xiàn),Que 及3 MA 均可顯著抑制Dox 誘導(dǎo)的線粒體自噬,降低心肌細(xì)胞損傷(圖6)。提示Que 抵抗Dox 誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性是通過(guò)Pink1/Parkin 依賴的線粒體自噬實(shí)現(xiàn)的。

注:A:乳酸脫氫酶活性;B:ROS 水平;C:線粒體膜電位產(chǎn)生;D:ATP 含量。 與阿霉素組相比, ?P<0.05;與阿霉素-槲皮素組相比, #P<0.05。圖4 Que 通過(guò)調(diào)節(jié)LDH、ROS、MMP 及ATP 含量抵抗Dox 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷(n=3~5)Note.A, LDH activities.B, ROS level.C, MMP production.D, ATP content.Compared with Dox group,? P<0.05.Compared with Dox-Que group, # P<0.05.Figure 4 Que protected nmCMs against Dox-induced cardiomyocytes injury via regulating LDH level, ROS level, MMP and ATP content

注:A:用Western blot 對(duì)不同組的代表性蛋白圖像進(jìn)行分析;B~F:Beclin1、Pink1、Parkin、P62 和LC3 的表達(dá)。 與阿霉素組相比, ?P<0.05;與阿霉素-槲皮素組相比, #P<0.05。圖5 Que 通過(guò)抑制Pink1/Parkin 介導(dǎo)的線粒體自噬,緩解Dox 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷(n=3~5)Note.A, Representative protein images by Western blot from different groups.B~F, Expression of Beclin1, Pink1, Parkin, P62 and LC3.Compared with Dox group, ?P<0.05.Compared with Dox-Que group, # P<0.05.Figure 5 Que protects mitochondrial hemostasis by inhibiting Pink1/Parkin-dependent mitophagy against Dox-induced cardiotoxicity

注:A:用Western blot 對(duì)不同組的代表性蛋白圖像進(jìn)行分析;B~F:Beclin1、Pink1、Parkin、P62 和LC3 的表達(dá)。 與阿霉素組相比,?P<0.05。圖6 Que 及3 MA 均可顯著抑制Pink1/Parkin 介導(dǎo)的線粒體自噬,緩解Dox 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷(n=3~5)Note.A, Representative protein images by Western blot from different groups.B ~ F, Expression of Beclin1, Pink1, Parkin, P62 and LC3.Compared with Dox group,? P<0.05.Figure 6 Que and 3 MA significantly inhibited Pink1/Parkin-dependent mitophagy against Dox-induced cardiotoxicity

3 討論

本研究通過(guò)對(duì)小鼠及分離的nmCMs 細(xì)胞建立Dox 損傷模型后發(fā)現(xiàn),Que 可保護(hù)小鼠心肌組織nmCMs 細(xì)胞并降低Dox 對(duì)細(xì)胞的毒性作用,降低纖維化,其作用機(jī)制主要是通過(guò)抑制Pink1/Parkin 介導(dǎo)的線粒體自噬與降低線粒體ROS 產(chǎn)生,及促進(jìn)ATP 合成量的增加來(lái)實(shí)現(xiàn)的。 我們的研究結(jié)果證實(shí),Pink1/Parkin 介導(dǎo)的線粒體自噬有助于Que 保護(hù)小鼠心臟功能并抵抗Dox 誘導(dǎo)的心肌毒性,從而為臨床用藥提供部分理論參考。

Dox 誘導(dǎo)的心肌毒性主要機(jī)制之一便與線粒體功能障礙有關(guān),導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS 增加和氧化應(yīng)激。線粒體是細(xì)胞暴露于Dox 后受損最嚴(yán)重的細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器,其內(nèi)膜中Dox 積累的重要因素之一是與心磷脂的高親和力結(jié)合有關(guān),后者已知可維持線粒體的結(jié)構(gòu)、功能、能量代謝和細(xì)胞存活[21]。 我們的研究證實(shí),Dox 誘導(dǎo)可顯著降低心肌組織/細(xì)胞ATP 含量及增加線粒體ROS 生成,而Que 預(yù)處理可通過(guò)增加線粒體ATP 生成及降低ROS 生成抵抗Dox 誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性,降低心肌纖維化程度。

線粒體自噬是一個(gè)進(jìn)化上保守的細(xì)胞進(jìn)程,能去除功能失調(diào)或多余的線粒體,以維持線粒體功能穩(wěn)態(tài)[22]。 Pink1 是2001 年發(fā)現(xiàn)的一種絲氨酸/蘇氨酸激酶,在其N 端含有一個(gè)線粒體靶向序列(mitochondrial targeting sequence, MTS),在跨膜結(jié)構(gòu)域(transmembrane domain, TMD)旁邊還存在一個(gè)外部線粒體定位信號(hào)( outer mitochondrial localization signal, OMS)。 Parkin 是1998 年發(fā)現(xiàn)的一種E3 泛素化連接酶,細(xì)胞功能正常時(shí),由于線粒體內(nèi)吞、蛋白酶切割和蛋白酶體降解,Pink1 持續(xù)維持在低水平,在細(xì)胞損傷時(shí)Pink1 則積累于線粒體外膜并從胞漿中招募Parkin 于線粒體,從而激活線粒體自噬[23]。 Pink1 依賴的線粒體自噬在細(xì)胞重編程過(guò)程中防止線粒體蓄積起關(guān)鍵作用[24]。 且線粒體質(zhì)量控制對(duì)于心臟功能調(diào)節(jié)及防止疾病損傷和發(fā)展至關(guān)重要。 如在心肌梗死后,Parkin 介導(dǎo)的線粒體自噬對(duì)心臟具有保護(hù)作用,缺乏Parkin 的小鼠對(duì)心肌梗死更敏感,并且心臟中線粒體功能異常。另一項(xiàng)研究表明,Pink1/Parkin 途徑的激活可調(diào)節(jié)線粒體自噬,抵抗膿毒癥導(dǎo)致的心功能損傷[24]。 此外,Pink/Parkin 介導(dǎo)的線粒體自噬異常與Dox 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞毒性顯著相關(guān)[8]。 因此,線粒體自噬的調(diào)節(jié)對(duì)心臟功能的維持具有重要作用。 我們的研究證實(shí),Dox 誘導(dǎo)可顯著激活線粒體自噬,即上調(diào)線粒體自噬標(biāo)志蛋白Pink1、Parkin、及LC3II 的表達(dá)而抑制P62 蛋白活性,Que 預(yù)處理則顯著降低Pink1、Parkin、及LC3II 的表達(dá)與增加P62 的蛋白表達(dá)量,提示Pink1/Parkin 介導(dǎo)的線粒體自噬在Que 抵抗Dox 誘導(dǎo)的線粒體損傷中有非常重要的作用。

Que 是一種天然的多酚化合物,在飲食中含量豐富。 Que 已被證明對(duì)人體具有許多有益的作用,包括在心血管系統(tǒng)如心臟的缺血再灌注(ischemic reperfusion, I/R)損傷中具有重要的保護(hù)作用[16,25]。Que 對(duì)蒽環(huán)類藥物誘導(dǎo)的心臟毒性或其他類型的心臟疾病的保護(hù)作用主要通過(guò)其抗氧化、抗炎作用實(shí)現(xiàn)的[26]。 且已被眾多的研究證實(shí),在對(duì)嚙齒動(dòng)物的研究中發(fā)現(xiàn),在給與Dox 前5~7 d 口服Que,可顯著緩解前者引起的心肌毒性進(jìn)而預(yù)防心功能損傷[9]。在對(duì)SD 大鼠接受為期2 周的Dox 治療中發(fā)現(xiàn),在化療前15 d 并在化療期間同時(shí)每日給予高劑量Que,可顯著降低血清肌酸激酶同工酶(CK-MB)和乳酸脫氫酶(LDH)水平以,以改善Dox 引起的心功能損傷[14]。 我們的研究表明,Que 預(yù)處理可以降低Dox 誘導(dǎo)的ROS 生成增加及促進(jìn)線粒體ATP 生成。此外,Que 的心肌保護(hù)作用被證實(shí)與緩解線粒體功能損傷具有重要相關(guān)性[18]。 我們?cè)谘芯恐邪l(fā)現(xiàn),Dox 可誘導(dǎo)心肌組織/細(xì)胞線粒體自噬相關(guān)蛋白Pink1、Parkin 及LC3 的激活與P62 活性降低,Que預(yù)處理后可部分緩解Dox 損傷狀態(tài)下,Pink1/Parkin依賴的線粒體自噬的激活,保護(hù)線粒體功能免受Dox 誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性損傷,而這種保護(hù)作用可被線粒體自噬激活劑SB 而抵消。

我們的研究結(jié)果證實(shí),Que 對(duì)Dox 誘導(dǎo)的心肌毒性具有保護(hù)作用。 其潛在的保護(hù)作用機(jī)制是通過(guò)抑制Pink1/Parkin 依賴的線粒體自噬實(shí)現(xiàn)的。SB 處理可部分抵消Que 的保護(hù)作用。 且3 MA 與Que 處理均可顯著降低心肌細(xì)胞線粒體自噬。 因此,Pink1/Parkin 介導(dǎo)的線粒體自噬可能為Dox 誘導(dǎo)的心肌毒性的潛在治療靶點(diǎn)。 此外,由于Que 來(lái)源廣泛且易于獲得,對(duì)Que 的心肌保護(hù)作用進(jìn)行深入研究,有望成為減輕抗癌藥物Dox 引起的心肌毒性的重要治療策略。