楊敬天，黎 華，趙 歡，龍 蕓，張詠祀，劉小紅*

過路黃MYB轉(zhuǎn)錄因子家族成員的挖掘及鑒定

楊敬天1，黎 華3，趙 歡2，龍 蕓2，張詠祀2，劉小紅2*

1. 綿陽師范學院生態(tài)安全與保護四川省重點實驗室，四川 綿陽 621000 2. 西華師范大學生命科學院，四川 南充 637009 3. 北川羌族自治縣國有林場，四川 綿陽 622761

分析過路黃MYB轉(zhuǎn)錄因子家族相關(guān)成員的結(jié)構(gòu)和功能，挖掘與黃酮類物質(zhì)生物合成相關(guān)的基因信息?；谶^路黃全長轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，利用ProtParam、GenStript、MEME、WebLogo、SOPMA、Swiss-Model等在線網(wǎng)站分析過路黃MYB轉(zhuǎn)錄因子家族蛋白的理化性質(zhì)、亞細胞定位、保守基序和結(jié)構(gòu)域、蛋白高級結(jié)構(gòu)等。利用MEGA軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，分析過路黃MYB轉(zhuǎn)錄因子家族（LcMYB）與擬南芥MYB蛋白的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。挖掘到51個LcMYB基因，預(yù)測51條具有MYB轉(zhuǎn)錄因子保守結(jié)構(gòu)域的蛋白序列；根據(jù)結(jié)構(gòu)域可分為R1-LcMYB、R2R3-LcMYB和R3-LcMYB 3個亞類，且所有LcMYB基序中都含有3個保守的色氨酸；過路黃MYB家族蛋白均為親水性蛋白，熱穩(wěn)定性較高且富含堿性氨基酸，大部分蛋白以無規(guī)則卷曲為主，其中R2R3-LcMYB39、R2R3-LcMYB47、R2R3-LcMYB48與R2R3-LcMYB50蛋白是以α-螺旋為主；與擬南芥MYB轉(zhuǎn)錄因子家族共同構(gòu)建的進化樹發(fā)現(xiàn)，過路黃MYB家族在進化上包括3個大類。在過路黃物種中獲得了51個MYB轉(zhuǎn)錄因子家族成員的基因的結(jié)構(gòu)和功能信息，其中有2個成員與黃酮類物質(zhì)的生物合成有關(guān)，該研究結(jié)果為后續(xù)克隆利用黃酮類物質(zhì)生物合成相關(guān)基因提供了分子基礎(chǔ)。

過路黃；MYB；生物信息學；黃酮類；轉(zhuǎn)錄因子

過路黃Hance為報春花科（Primulaceae）珍珠菜屬L.植物，其新鮮或干燥全草又名金錢草，在我國分布較為廣泛，主要產(chǎn)于四川、云南、貴州、陜西、河南、湖北、湖南、浙江等省區(qū)[1-2]。中醫(yī)認為過路黃味酸、苦、微寒，其歸肝、膽、腎、膀胱經(jīng)，具有利濕退黃、利尿通淋及解毒消腫等功效，主要用于治療濕熱黃疸、石淋、熱淋、癰腫疔瘡、小便澀痛、肝膽結(jié)石和尿路結(jié)石等癥狀[3-4]。過路黃的化學成分有黃酮類、酚類、多糖類、三萜皂苷類、揮發(fā)油、醌類等，其中以黃酮類化合物槲皮素和山柰素為主要有效成分[5-6]。藥理學研究表明，這些化學成分具有抗腫瘤、抗氧化、保肝、保護內(nèi)皮、治療痛風等多種藥理活性[7-9]。因此，研究過路黃黃酮生物合成途徑具有重要價值。

植物中黃酮類化合物主要通過苯丙烷代謝途徑合成。苯丙氨酸依次由苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonialyase，PAL）、肉桂酸4-羥化酶（cinnamate 4-hydroxylase，C4H）和4-香豆酸CoA連接酶（4-coumarate:CoA ligase，4CL）催化形成4-香豆酰CoA（4-counmarinyl-CoA）[10]。再以1分子的4-香豆酰CoA和3分子丙二酰CoA為底物，經(jīng)黃酮類化合物合成途徑的查耳酮合成酶（chalconesynthetase，CHS）、查耳酮異構(gòu)酶（chalcone isomerase，CHI）和黃烷酮3-羥化酶（flavanone 3-hydroxylase，F(xiàn)3H）等多種酶共同催化完成[11-12]。植物中發(fā)現(xiàn)很多轉(zhuǎn)錄因子家族（如MYB、bHLH、bZIP、MADS-box、WRKY和WDR等）參與調(diào)控黃酮類化合物的合成[12-13]。已有研究表明擬南芥L. MYB可以增加黃酮等次級代謝產(chǎn)物的含量，從而提高對蟲害、干旱和高鹽脅迫的抵御能力[14-15]。其中MYB轉(zhuǎn)錄因子是植物最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，其DNA結(jié)合域中含有4個不完全重復(fù)的R1、R2、R3和R4序列[16]。每個MYB結(jié)構(gòu)域(R)由51～53個氨基酸組成，編碼3個α-螺旋，其第2和第3個螺旋通過3個色氨酸殘基組成螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋（HTH）的結(jié)構(gòu)，參與結(jié)合DNA大溝，從而提高或抑制下游基因的轉(zhuǎn)錄[17]。根據(jù)R的重復(fù)數(shù)目，可將MYB家族分為4類：R1-MYB型（含MYB-related）、R2R3-MYB型、3R-MYB型和4R-MYB型，其中，R2R3-MYB型MYB因子在植物MYB家族中所占比例最大[18-19]。

目前，對過路黃的研究主要集中于化學成分、藥理活性等方面，有關(guān)過路黃分子生物學方面的研究鮮有報道。課題組前期對過路黃全長轉(zhuǎn)錄組進行了測序，在此基礎(chǔ)上，本實驗進一步利用生物信息學對過路黃MYB轉(zhuǎn)錄因子蛋白（LcMYB）的分類、理化性質(zhì)、亞細胞定位、保守基序、結(jié)構(gòu)域、系統(tǒng)發(fā)育樹、氨基酸高級結(jié)構(gòu)及生物學功能注釋等進行分析，以期為過路黃MYB家族參與調(diào)控黃酮類化合物的作用機制研究、高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)過路黃育種和種植提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 序列來源

采集田間自然生長于西華師范大學校園內(nèi)的過路黃幼嫩植株（30°49′25″N, 106°03′43″E），液氮速凍后，分別提取根、莖和葉的總RNA，等質(zhì)量混勻后，由派森諾生物科技有限公司進行mRNA純化、反轉(zhuǎn)錄構(gòu)建全長cDNA文庫，再作三代高通量轉(zhuǎn)錄組測序，對測序結(jié)果去除接頭和低質(zhì)量的reads后獲得clean reads?；谵D(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，在PFAM、GO、NR、Swiss-Prot、eggNOG和KEGG 6個等數(shù)據(jù)庫初步注釋7個MYB轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)基因，將這些基因編碼蛋白逐個進行NCBI Blast和SMART預(yù)測，去除冗余序列后，最后得到51條具有完整MYB保守結(jié)構(gòu)域的序列。從TAIR數(shù)據(jù)庫中下載已知并鑒定功能的擬南芥AtMYB家族的編碼序列（CDS）和氨基酸序列，使用在線軟件Expasy中的Translate對LcMYB家族各成員的全長cDNA序列進行分析，從而得到其對應(yīng)的編碼蛋白的氨基酸序列。利用SMART檢測候選蛋白質(zhì)序列，選擇具有MYB結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，剔除不含MYB基序的蛋白序列和冗余序列，最后得到過路黃MYB蛋白的氨基酸序列。

1.2 LcMYB理化性質(zhì)分析

采用網(wǎng)絡(luò)在線分析軟件Expasy中的Protparam對過路黃MYB蛋白的氨基酸數(shù)目、相對分子質(zhì)量、等電點（pI）、脂肪族氨基酸數(shù)和蛋白質(zhì)疏水性等理化性質(zhì)進行分析。采用在線GenStript軟件預(yù)測LcMYB蛋白的亞細胞定位。

1.3 LcMYB保守結(jié)構(gòu)域分析

采用MEME軟件預(yù)測LcMYB蛋白的保守基序（Motif），基序的查找數(shù)量設(shè)為10，其他參數(shù)為默認值。采用ClustalW軟件分別對過路黃MYB序列中3個SANT序列進行比對，再用WebLogo在線軟件繪制LcMYB蛋白保守結(jié)構(gòu)域可視化圖。

1.4 LcMYB空間結(jié)構(gòu)和生物學功能分析

采用SOPMA在線軟件預(yù)測LcMYB蛋白二級結(jié)構(gòu)，并采用Swiss-Model在線軟件預(yù)測LcMYB蛋白的三級結(jié)構(gòu)。采用Blast2GO軟件注釋LcMYB蛋白的生物學功能。

1.5 聚類分析

利用在線軟件Clustalw對51條過路黃MYB轉(zhuǎn)錄因子蛋白和與其結(jié)構(gòu)相似的65條擬南芥MYB轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸序列進行比對。然后利用MEGA7.0軟件以鄰接法（neighbor-joining method）繪制進化樹，參數(shù)選擇P-distance、pairwise deletion和Bootstrap method為1000，其他參數(shù)選擇默認值。

2 結(jié)果與分析

2.1 過路黃MYB基因挖掘以及蛋白序列分析

從過路黃全長轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中篩選出54條LcMYB核苷酸序列，經(jīng)與網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫進行同源比對，最后獲得51條具有完整MYB保守結(jié)構(gòu)域的序列，分別命名為LcMYB1～LcMYB51，其中屬于R1-MYB類轉(zhuǎn)錄因子的序列有19條，長度分布在420～2125 bp；屬于R2R3-MYB類序列有31條，長度分布在650～5340 bp；屬于R3-MYB類序列僅1條，長度為2114 bp。

2.2 過路黃MYB轉(zhuǎn)錄因子家族蛋白理化性質(zhì)及亞細胞定位

采用ProtParam在線軟件分析過路黃LcMYB轉(zhuǎn)錄因子家族蛋白的理化性質(zhì)（表1），結(jié)果表明，預(yù)測的51個LcMYB蛋白在氨基酸數(shù)目、蛋白相對分子質(zhì)量、pI、脂肪系數(shù)、不穩(wěn)定系數(shù)和總平均親水性等方面均存在顯著差異。LcMYB蛋白的氨基酸殘基（aa）長度變化范圍為57～989 aa，平均長度為299.1 aa。其中，R1型LcMYB蛋白的aa長度為57～632 aa，平均長度為259.79 aa；R2R3型LcMYB蛋白的長度為120～989 aa，平均長度為321.03 aa；而R3型LcMYB蛋白的長度為367 aa。LcMYB蛋白理論相對分子質(zhì)量（W）范圍為6 588.31～111 684.07，平均值為33 185.75。其中，R1型LcMYB蛋白的W為6 588.31～70 486.65，平均為29 100.87；R2R3型LcMYB蛋白的W為14 320.34～111 684.07，平均值為35 430.66；而3R型LcMYB蛋白的MW為41 206.18。在上述2種理化性質(zhì)中，氨基酸殘基序列長度最短和MW最小的是LcMYB4，氨基酸序列最長和MW最大的是LcMYB47（表1）。

另外，LcMYB蛋白家族的理論pI范圍在5.05（LcMYB1）～10.44（LcMYB33），平均值為7.98，其中35個LcMYB蛋白的pI值大于7，其余16個LcMYB蛋白的pI值小于7，表明大多數(shù)過路黃LcMYBs蛋白為偏堿性。所有LcMYB家族蛋白的總平均親水性為負值，說明其均為親水性蛋白。R1型LcMYB蛋白中僅LcMYB 4（不穩(wěn)定性指數(shù)為33.93）、LcMYB 14（37.11）和LcMYB 19（28.77）3種蛋白的不穩(wěn)定性指數(shù)小于40，為穩(wěn)定蛋白，其余R1型蛋白均為不穩(wěn)定蛋白；所有R2R3型和R3型LcMYB蛋白的不穩(wěn)定性指數(shù)均大于40，為不穩(wěn)定蛋白（表1）。

利用ProtComp在線網(wǎng)站分析LcMYB蛋白的亞細胞定位，結(jié)果顯示，39種LcMYB蛋白定位于細胞核，8種LcMYB蛋白定位于葉綠體，剩余的4種LcMYB蛋白定位于過氧化物酶體，說明LcMYB家族成員功能可能有所差異或具有多種功能（表1）。

2.3 過路黃MYB轉(zhuǎn)錄因子家族蛋白保守序列分析

采用HEME在線軟件分析過路黃MYB轉(zhuǎn)錄因子蛋白家族的氨基酸序列，結(jié)果表明，共鑒定出10個保守序列，長度為8～50 aa，且不同LcMYB蛋白含有的序列數(shù)不盡相同。其中，LcMYB21、LcMYB26、LcMYB29、LcMYB32、LcMYB35、LcMYB36、LcMYB38和LcMYB42 8個MYB蛋白的氨基酸序列中所含的保守序列數(shù)目最多，為6個；而LcMYB1、LcMYB2、LcMYB5、LcMYB6、LcMYB18和LcMYB49 6個MYB蛋白的保守序列數(shù)最少，僅為1個；其余37個MYB轉(zhuǎn)錄因子所含的序列數(shù)為2～5個。

表1 過路黃MYB轉(zhuǎn)錄因子的理化性質(zhì)及亞細胞定位

Table 1 Physicochemical property and subcellular localization of MYB in L.christinae

編號類型長度/aa相對分子質(zhì)量pI脂肪系數(shù)總平均親水性不穩(wěn)定系數(shù)亞細胞定位 LcMYB1R1360 40 682.60 5.0572.33?0.67657.56葉綠體 LcMYB2R1210 23 882.87 5.1972.43?0.64354.59葉綠體 LcMYB3R1 59 6 982.95 6.5779.32?0.82770.85細胞核 LcMYB4R1 57 6 588.31 9.2253.16?1.40033.93細胞核 LcMYB5R1437 48 857.19 9.30 75.01?0.68750.09過氧化物酶體 LcMYB6R1464 53 380.90 9.7674.03?0.74950.97過氧化物酶體 LcMYB7R1282 30 947.95 9.0871.56?0.54152.32細胞核 LcMYB8R1301 33 072.95 9.5876.38?0.52641.76細胞核 LcMYB9R1289 31 860.98 9.1168.48?0.58453.10細胞核 LcMYB10R1330 36 103.28 6.8760.33?0.67356.45過氧化物酶體 LcMYB11R1258 28 665.7710.0871.20 ?0.720 60.62細胞核 LcMYB12R1333 36 032.08 6.4658.02?0.66458.02過氧化物酶體 LcMYB13R1280 30 982.54 7.9965.39 ?0.66759.10葉綠體 LcMYB14R1249 27 949.35 6.0867.71?0.63037.11細胞核 LcMYB15R1 71 8 408.39 8.0861.83?1.04969.91細胞核 LcMYB16R1 81 9 135.14 8.0760.25?0.86964.61細胞核 LcMYB17R1 84 10 287.76 9.4652.26?1.07995.27細胞核 LcMYB18R1632 70 486.65 9.3573.42?0.65253.59細胞核 LcMYB19R1159 18 608.88 6.3466.73?1.13428.77葉綠體 LcMYB20R2R3466 52 434.97 5.6775.13?0.67465.80葉綠體 LcMYB21R2R3227 26 091.71 8.3275.20?0.63057.65細胞核 LcMYB22R2R3308 3 474.81 7.7670.91?0.69548.93葉綠體 LcMYB23R2R3286 31 397.48 8.8054.62?0.65152.83細胞核 LcMYB24R2R3220 25 714.90 8.6360.73?0.81946.15細胞核 LcMYB25R2R3286 32 539.37 7.7862.03?0.770 54.51細胞核 LcMYB26R2R3336 37 598.27 5.7879.55?0.49047.19細胞核 LcMYB27R2R3184 20 540.25 9.9365.27?0.78943.20細胞核 LcMYB28R2R3320 35 755.94 6.6667.34?0.72250.73細胞核 LcMYB29R2R3258 29 388.75 9.7185.78?0.52041.10細胞核 LcMYB30R2R3307 34 691.71 6.6065.80 ?0.75555.91細胞核 LcMYB31R2R3303 33 390.08 7.6274.59?0.43857.26細胞核 LcMYB32R2R3271 30 417.42 8.8972.36?0.60449.84細胞核 LcMYB33R2R3126 14 843.2310.4469.68?0.96455.97細胞核 LcMYB34R2R3306 35 342.34 5.7370.39?0.74460.65細胞核 LcMYB35R2R3260 29 553.18 5.5073.54?0.73750.45細胞核 LcMYB36R2R3304 34 338.21 7.1763.52?0.92249.43細胞核 LcMYB37R2R3315 35 737.58 5.4464.06?0.72145.26細胞核 LcMYB38R2R3221 25 245.80 8.9776.38?0.71848.58細胞核 LcMYB39R2R3120 14 320.34 9.00 67.42?0.96266.73細胞核 LcMYB40R2R3237 27 632.28 9.1568.35?0.83456.06細胞核 LcMYB41R2R3150 16 983.46 9.5170.93?0.71562.72細胞核 LcMYB42R2R3249 28 573.26 8.6070.88?0.79251.04細胞核 LcMYB43R2R3165 19 181.92 9.80 73.33?1.00943.26細胞核 LcMYB44R2R3247 28 229.65 8.4265.95?0.85751.51細胞核 LcMYB45R2R3174 20 331.91 9.3457.76?1.04561.31細胞核 LcMYB46R2R3176 20 148.16 9.7290.34?0.72644.06細胞核 LcMYB47R2R3989111 684.07 5.2178.00?0.82548.32細胞核 LcMYB48R2R3924104 152.62 5.4473.48?0.880 47.76細胞核 LcMYB49R2R3579 65 384.06 9.1468.55?0.69444.57葉綠體 LcMYB50R2R3638 73 232.63 8.6565.82?1.00355.67葉綠體 LcMYB51R3367 41 206.18 8.0963.81?0.78957.86細胞核

進一步分析發(fā)現(xiàn)，在預(yù)測的10個保守序列中，51種LcMYB蛋白至少含有motif1、motif2、motif3中的一個，推測這3個氨基酸序列是MYB保守結(jié)構(gòu)域的主要部分。其中，R1型LcMYB蛋白含有motif2、motif3、motif4、motif6、motif7、motif8和motif9；R2R3型LcMYB蛋白含10種保守序列且均含有motif3；R3型LcMYB蛋白含有motif1、motif2、motif3和motif6（圖1）。

A-LcMYB轉(zhuǎn)錄因子的基序分布 B-LcMYB轉(zhuǎn)錄因子的各基序的氨基酸排列

2.4 過路黃MYB轉(zhuǎn)錄因子家族蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析

利用WebLogo網(wǎng)站對51個LcMYB蛋白的保守結(jié)構(gòu)域進行分析。結(jié)果表明，LcMYB蛋白每個重復(fù)的結(jié)構(gòu)域（R）均為51 aa，序列含有3個色氨酸（W），分別位于序列的第5、25、45位，且兩相鄰色氨酸的間距相同，為19 aa。進一步分析發(fā)現(xiàn)，在R1、R2和R3結(jié)構(gòu)域的色氨酸均以第25位最為保守，R1結(jié)構(gòu)域中的第5個氨基酸W存在甲硫氨酸（M）取代情況，而第45個氨基酸的W位由酪氨酸（Y）、丙氨酸（A）和W共同組成；R2結(jié)構(gòu)域中的第5個氨基酸W部位高度保守，但第3個W也存在Y取代的情況；而R3結(jié)構(gòu)域中的第1個W部位由苯丙氨酸（F）、異亮氨酸（I）和W共同組成，第45位的W也存在Y取代的現(xiàn)象。此外，MYB結(jié)構(gòu)域中還包括其它較為保守的氨基酸殘基，如第9位的谷氨酸（E）、第21位的甘氨酸（G）和第36位精氨酸（R）（圖2）。

R1、R2和R3分別表示R1-MYB、R2R3-MYB和3R-MYB

2.5 過路黃MYB轉(zhuǎn)錄因子家族進化樹分析

采用MEGA7.0軟件繪制過路黃和擬南芥MYB蛋白家族系統(tǒng)進化樹（圖3），結(jié)果顯示，來源過路黃的MYB轉(zhuǎn)錄因子分為3類，分別聚在系統(tǒng)進化樹的3個不同分支下（Group I、Group II、GroupIII），其中R1-MYB類轉(zhuǎn)錄因子主要是分布在I、II類，占過路黃總R1-MYB類轉(zhuǎn)錄因子的37.25%，R2R3-MYB類轉(zhuǎn)錄因子主要被聚在第III類中，占過路黃總R2R3-MYB類轉(zhuǎn)錄因子的60.78%。R2R3-MYB類轉(zhuǎn)錄因子，結(jié)構(gòu)多樣導致其在進化樹上分布范圍最廣。第III大類被分為2個亞類，R1-LcMYB5最先被分化，其中R1-LcMYB5與AT1G77450、AT1G32450聚在一起。

從過路黃和擬南芥MYB轉(zhuǎn)錄因子家族系統(tǒng)進化樹（圖3）中可以看出大部分過路黃MYB轉(zhuǎn)錄因子可與擬南芥聚在一起，說明過路黃MYB轉(zhuǎn)錄因子和擬南芥MYB轉(zhuǎn)錄因子可以相互匹配，如LcMYB19與AT1G15720、LcMYB13與AT1G70000、LcMYB23與AT5G04760、LcMYB16與AT2G21650、LcMYB24與AT3G11280、LcMYB50與AT5G45420、LcMYB17與AT2G46410、LcMYB51與AT3G09370、LcMYB22與AT1G17950、LcMYB2與AT3G23250、LcMYB3與AT3G46130、LcMYB41與AT5G57620、LcMYB39與AT1G63910、LcMYB43與AT1G22640、LcMYB26與AT1G34670、LcMYB29與AT4G28110、LcMYB45與AT1G16490和LcMYB33與AT5G49330分別聚在一起，根據(jù)系統(tǒng)進化的序列相似性，表明其進化關(guān)系較近，說明其與擬南芥的親緣關(guān)系比較接近，在蛋白結(jié)構(gòu)和序列上更為相似，可以根據(jù)此來預(yù)測LcMYB的生物學功能。在該進化樹中存在著不同結(jié)構(gòu)域但同源性較高的情況，如R2R3-LcMYB20與R1-LcMYB1相鄰；同時存在著相同結(jié)構(gòu)域同源性高的情況，如R2R3-LcMYB21與R2R3-LcMYB38、R2R3- LcMYB28與R2R3-LcMYB30分別相鄰?？傮w表明，MYB家族蛋白與擬南芥MYB家族蛋白同源性高，在相鄰或較近進化關(guān)系上的蛋白有可能具有相似的功能。

2.6 過路黃MYB轉(zhuǎn)錄因子家族蛋白高級結(jié)構(gòu)分析

利用SOPMA預(yù)測過路黃MYB蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示，除LcMYB15蛋白不含延伸鏈外，其余50個LcMYB蛋白均具有α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)卷曲和延伸鏈4種構(gòu)型。其中部分R1-LcMYB蛋白（LcMYB6、LcMYB17）及部分R2R3-LcMYB蛋白（LcMYB39、LcMYB47、LcMYB48、LcMYB50）是以α-螺旋為主，β-轉(zhuǎn)角、延伸鏈以及無規(guī)則卷曲分布在蛋白序列中；而其余44種LcMYB蛋白則都以無規(guī)則卷曲為主，α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、延伸鏈散布于整個蛋白序列（表2）。

蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)與其功能密切相關(guān)，使用Swiss-Model對過路黃的氨基酸序列進行三級結(jié)構(gòu)同源建模（圖4），結(jié)果表明，過路黃MYB家族蛋白均具有α-螺旋、無規(guī)則卷曲、β-折疊和β-轉(zhuǎn)角，這與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測相符合。R2R3-LcMYB亞族蛋白三級結(jié)構(gòu)相似性較高，R2、R3結(jié)構(gòu)分別有3個α-螺旋，能明顯看到HTH結(jié)構(gòu)，主要是無規(guī)則卷曲長度有所不同。對于R1-LcMYB亞族蛋白，主要在α-螺旋數(shù)量上存在差異。

圖3 過路黃MYB轉(zhuǎn)錄因子家族進化樹

表2 過路黃MYB轉(zhuǎn)錄因子家族蛋白的二級結(jié)構(gòu)

Table 2 Secondary structure of MYB proteins in L.christinae

編號α-螺旋/%β-轉(zhuǎn)角/%無規(guī)則卷曲/%延伸鏈/%編號α-螺旋/%β-轉(zhuǎn)角/%無規(guī)則卷曲/%延伸鏈/% LcMYB138.892.2251.39 7.50LcMYB2741.30 4.3545.65 8.70 LcMYB229.056.6754.2910.00LcMYB2831.56 1.8860.00 6.56 LcMYB335.598.4740.6815.25LcMYB2934.50 8.5343.4113.57 LcMYB421.057.0261.4010.53LcMYB3028.99 2.6161.89 6.51 LcMYB540.051.3753.09 5.49LcMYB3127.72 3.6360.73 7.92 LcMYB653.454.0933.62 8.84LcMYB3225.09 5.9057.2011.81 LcMYB727.304.2661.70 6.74LcMYB3334.1311.9043.6510.32 LcMYB844.523.3242.52 9.63LcMYB3434.64 2.6158.17 4.58 LcMYB927.686.2357.89 9.00LcMYB3536.54 3.8553.85 5.77 LcMYB1016.062.7369.3911.82LcMYB3624.67 5.9261.51 7.89 LcMYB1134.113.4952.3310.08LcMYB3738.10 4.7651.43 5.71 LcMYB1216.223.6066.6713.51LcMYB3831.67 5.8852.49 9.95 LcMYB1317.144.2961.0717.50LcMYB3948.33 5.8339.17 6.67 LcMYB1429.726.0254.2210.04LcMYB4026.58 5.0664.56 3.80 LcMYB1556.345.6338.030LcMYB4136.67 8.6747.33 7.33 LcMYB1649.382.4746.91 1.23LcMYB4227.31 5.6256.2210.84 LcMYB1754.763.5733.33 8.33LcMYB4343.03 9.0944.24 3.64 LcMYB1819.303.0164.8712.82 LcMYB4428.74 6.8858.70 5.67 LcMYB1928.932.5259.75 8.81LcMYB4544.25 9.2043.10 3.45 LcMYB2034.984.0853.22 7.73LcMYB4632.39 6.8247.1613.64 LcMYB2128.635.2956.83 5.29LcMYB4753.69 2.2240.24 3.84 LcMYB2232.146.2847.7313.31LcMYB4854.55 2.9237.12 5.41 LcMYB2321.332.8065.3810.49LcMYB4945.42 3.9740.93 9.67 LcMYB2426.825.4550.9116.82LcMYB5063.17 4.2328.06 4.55 LcMYB2521.333.1559.4416.08LcMYB5128.07 5.4561.04 5.45 LcMYB2641.963.5752.68 1.79

圖4 過路黃MYB蛋白的三級結(jié)構(gòu)

2.7 過路黃MYB轉(zhuǎn)錄因子蛋白的功能注釋

Blast2GO軟件處理結(jié)果表明，51條LcMYB序列被注釋到分子功能、生物過程和細胞組成3個GO類別的24小組。分子功能注釋均為binding，LcMYB序列數(shù)量為36條，表明所篩選的MYB轉(zhuǎn)錄因子通過與目的基因的啟動子區(qū)結(jié)合，調(diào)控生物體的生長發(fā)育。生物過程中注釋的生物過程和細胞過程豐度最高，均為16條；其次是代謝過程、大分子代謝過程、細胞內(nèi)代謝過程、初級代謝過程、細胞內(nèi)大分子代謝過程和有機物代謝過程，豐度均為13條；生物調(diào)節(jié)、細胞過程調(diào)節(jié)和生物過程調(diào)節(jié)豐度也較高，為8條，其他基因均較小。值得注意的是，參與芳香族化合物生物合成的有8條，分別為LcMYB10、LcMYB12、LcMYB21、LcMYB23、LcMYB24、LcMYB25、LcMYB7和LcMYB9。細胞組成中注釋最多的為細胞組分、細胞器及內(nèi)腔（圖5）。

圖5 過路黃MYB轉(zhuǎn)錄因子家族蛋白的GO注釋 (A)和富集分析(B)

3 討論

3.1 LcMYB的理化性質(zhì)及細胞定位

本實驗首次從過路黃全長轉(zhuǎn)錄組中分別鑒定出19個R1型LcMYB、31個R2R3型LcMYB和1個R3型LcMYB基因，相較于擬南芥、大豆(Linn.) Merr.、水稻L.、柑橘Blanco、葡萄樹L.、毛果楊Torr. & Gray等基因組中相應(yīng)的3種類型基因均偏少，但比細葉百合的23個MYB家族成員多，這可能與各植物基因組倍數(shù)以及基因的復(fù)制相關(guān)[20]。此外，過路黃中R2R3型LcMYB基因所占比例最大，與上述物種中R2R3-MYB基因在MYB家族中的分布比例相同[17]。在少數(shù)物種中還發(fā)現(xiàn)了R4型MYB蛋白，但在過路黃全長轉(zhuǎn)錄組中尚未發(fā)現(xiàn)。

3.2 LcMYB的保守結(jié)構(gòu)域

通過對其翻譯的氨基酸序列中保守結(jié)構(gòu)域基序分析，表明R2R3-LcMYB結(jié)構(gòu)域比R1-LcMYB結(jié)構(gòu)域保守。其中，R2-LcMYB與R3-LcMYB基序中都含有3個保守的色氨酸，色氨酸之間的間隔氨基酸數(shù)目分別為20、20與20、19。R3-LcMYB基序第1個和第3個色氨酸處還包括疏水氨基酸苯丙氨酸，這與黑果枸杞L. R3-MYB基序一致[21]，表明MYB基因家族N端在不同植物間高度保守，對于維持HTH構(gòu)型有著重要的作用[22]；其中R2-LcMYB基序中2個色氨酸之間的間隔與杜海描述大豆植物R2R3-MYB一致[23]，說明過路黃R2-LcMYB基序的色氨酸非常保守；而R3-LcMYB基序中色氨酸比大豆中少1個氨基酸殘基，表明過路黃R2R3-LcMYB類轉(zhuǎn)錄因子中的R3-LcMYB基序發(fā)生氨基酸缺失，該區(qū)域可能是其植物進化和功能分化的熱點區(qū)；而R1-LcMYB基序只有2個保守的色氨酸且間隔19個氨基酸，第3個色氨酸被組氨酸（H）、賴氨酸（K）以及精氨酸（R）取代。

3.3 LcMYB高級結(jié)構(gòu)分析

分別對R1-LcMYB和R2R3-LcMYB蛋白進行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，分析表明所有蛋白都具有α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、β-折疊及無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)，且大部分以無規(guī)則卷曲為主，只有R2R3-LcMYB3、R2R3-LcMYB4與R1-LcMYB15蛋白是以α-螺旋為主；從2個亞族中選取具有代表性的序列R2R3-LcMYB9、R2R3-LcMYB4、R1-LcMYB2、R1- LcMYB15進行三級結(jié)構(gòu)同源建模，發(fā)現(xiàn)R2R3-LcMYB亞族中的蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)相似性較高，在無規(guī)則卷曲長度上略有不同；而R1-LcMYB亞族蛋白，主要是在α-螺旋數(shù)量上差異較大。通過對過路黃MYB轉(zhuǎn)錄因子的保守結(jié)構(gòu)域基序分析以及氨基酸高級結(jié)構(gòu)的預(yù)測，為研究過路黃屬及報春花科其他植物的MYB轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)和功能進化奠定基礎(chǔ)。

3.4 聚類分析

過路黃與擬南芥MYB蛋白的聚類分析結(jié)果表明，大部分LcMYB都與擬南芥處于同一分支，表明過路黃和擬南芥MYB成員具有相近的進化起源，但一些分支中缺少擬南芥或過路黃MYB成員，證明這2個物種的R2R3-MYB基因可能存在多樣性。R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子被認為具有相同或相似功能[21]；本研究用所得47條過路黃MYB類轉(zhuǎn)錄因子蛋白與22條擬南芥MYB蛋白作系統(tǒng)進化樹，結(jié)果顯示過路黃和擬南芥MYB基因被聚為3個大類，其中R2R3-MYB分布廣泛，在II類中占過路黃總R2R3-MYB類轉(zhuǎn)錄因子的60.9%，R1-MYB主要被聚在第I類中，占過路黃總R1-MYB類轉(zhuǎn)錄因子的37.3%；在該進化樹中存在著不同結(jié)構(gòu)域與相同結(jié)構(gòu)域相鄰的情況?？傮w表明，過路黃MYB家族蛋白與擬南芥MYB家族蛋白同源性高。其中，R2R3-LcMYB28與R2R3-LcMYB30相鄰；R2R3-LcMYB40與R2R3-LcMYB44相鄰且在R2R3-LcMYB34基礎(chǔ)上進化而來。研究表明擬南芥中黃酮類物質(zhì)主要受AtMYB11、AtMYB12和AtMYB111以及AtMYB75/PAP1、AtMYB90、AtMYB114調(diào)控[24-25]。因此可以推測R2R3-LcMYB33及R2R3-LcMYB36可能具有相似的功能，參與過路黃中黃酮類次生代謝物的生物合成，這將為過路黃MYB轉(zhuǎn)錄因子的功能研究提供參考，進而為過路黃MYB基因調(diào)控黃酮類化合物合成的功能鑒定與作用機制研究、高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)過路黃育種和種植提供科學依據(jù)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 中國藥典 [S]. 一部. 2020: 229.

[2] 萬德光，彭成，趙軍寧. 四川道地中藥材志 [M]. 成都: 四川科學技術(shù)出版社, 2005: 367-375.

[3] 莫劉基, 鄧家泰, 張金梅, 等. 幾種中藥對輸尿管結(jié)石排石機理的研究(摘要) [J]. 新中醫(yī), 1985, 17(6): 53-54.

[4] 金麗鑫. 金錢草對照藥材標定技術(shù)標準的研究 [D]. 成都: 成都中醫(yī)藥大學, 2012.

[5] 王佰靈, 羅倫, 戈振凱, 等. 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學和分子對接探討金錢草治療痛風的作用機制 [J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā), 2021, 33(5): 859-867.

[6] 王宇杰, 孫啟時. 金錢草的化學成分研究 [J]. 中國藥物化學雜志, 2005, 15(6): 357-359.

[7] Kim H A, Lee D S, Lee H,.Hance as an anticancer agent against breast cancer cells [J]., 2020, 8(10): 5717-5728.

[8] Wu N H, Ke Z Q, Wu S,. Evaluation of the antioxidant and endothelial protective effects ofHance (Jin Qian Cao) extract fractions [J]., 2018, 18(1): 128.

[9] Wang J M, Zhang Y Y, Zhang Y S,. Protective effect ofagainst acute alcohol-induced liver injury in mice [J]., 2012, 6(2): 89-97.

[10] 伍小方, 高國應(yīng), 左倩, 等. FtMYB1轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控苦蕎毛狀根黃酮醇合成的機理研究 [J]. 植物遺傳資源學報, 2020, 21(5): 1270-1278.

[11] 趙瑩, 楊欣宇, 趙曉丹, 等. 植物類黃酮化合物生物合成調(diào)控研究進展 [J]. 食品工業(yè)科技, 2021, 42(21): 454-463.

[12] Falcone Ferreyra M L, Rius S P, Casati P. Flavonoids: biosynthesis, biological functions, and biotechnological applications [J]., 2012, 3: 222.

[13] Kocábek T, Mishra A K, Matou?ek J,. The R2R3 transcription factor HlMYB8 and its role in flavonoid biosynthesis in hop (L.) [J]., 2018, 269: 32-46.

[14] Onkokesung N, Reichelt M, van Doorn A,. Modulation of flavonoid metabolites inthrough overexpression of the MYB75 transcription factor: Role of kaempferol-3, 7-dirhamnoside in resistance to the specialist insect herbivore[J]., 2014, 65(8): 2203-2217.

[15] Nakabayashi R, Yonekura-Sakakibara K, Urano K,. Enhancement of oxidative and drought tolerance inby overaccumulation of antioxidant flavonoids [J]., 2014, 77(3): 367-379.

[16] Ogata K, Kanei-Ishii C, Sasaki M,. The cavity in the hydrophobic core of Myb DNA-binding domain is reserved for DNA recognition and trans-activation [J]., 1996, 3(2): 178-187.

[17] Liu J Y, Osbourn A, Ma P D. MYB transcription factors as regulators of phenylpropanoid metabolism in plants [J]., 2015, 8(5): 689-708.

[18] Du H, Zhang L, Liu L,. Biochemical and molecular characterization of plant MYB transcription factor family [J].(), 2009, 74(1): 1-11.

[19] Dubos C, Stracke R, Grotewold E,. MYB transcription factors in[J]., 2010, 15(10): 573-581.

[20] 王靜文, 譚萌萌, 孫紹營, 等. 基于轉(zhuǎn)錄組信息的細葉百合MYB轉(zhuǎn)錄因子家族分析 [J]. 分子植物育種, 2021, https://kns.cnki.net/kcms/detail/46.1068.S.2021 1213. 1536.009.html

[21] 嚴莉, 王翠平, 陳建偉, 等. 基于轉(zhuǎn)錄組信息的黑果枸杞MYB轉(zhuǎn)錄因子家族分析 [J]. 中國農(nóng)業(yè)科學, 2017, 50(20): 3991-4002.

[22] Jin H, Martin C. Multifunctionality and diversity within the plant-gene family [J]., 1999, 41(5): 577-585.

[23] 杜海. 植物MYB轉(zhuǎn)錄因子家族的分子進化機制及調(diào)控類黃酮生物合成MYB基因的鑒定 [D]. 雅安: 四川農(nóng)業(yè)大學, 2013.

[24] Qi X W, Fang H L, Chen Z Q,. Ectopic expression of a R2R3-transcription factor gene LjaMYB12 fromincreases flavonoid accumulation in[J]., 2019, 20(18): 4494.

[25] Wang X C, Wu J, Guan M L,.MYB4 plays dual roles in flavonoid biosynthesis [J]., 2020, 101(3): 637-652.

Excavation and identification of members of MYB transcription factor family in

YANG Jing-tian1, LI Hua3, ZHAO Huan2, LONG Yun2, ZHANG Yong-si2, LIU Xiao-hong2

1. Sichuan Key Laboratory of Ecological Security and Protection, Mianyang Normal University, Mianyang 621000, China 2. College of Life Science, China West Normal University, Nanchong 637009, China 3. State-owned Forest Farm of Beichuan Qiang Minority Autonomous County, Mianyang 622761, China

To analyze the structure and function of the members of MYB transcription factor family in, and excavate some information of the genes related to flavonoid biosynthesis.Based on transcriptome database of, the physicochemical properties, subcellular localization, conserved motifs and domains and protein structures of the LcMYB were analyzed by online websites, including ProtParam, GenStript, MEME, WebLogo, SOPMA, Swiss-Model, etc. The MYB phylogenetic tree was constructed by MEGA to analyze the phylogenetic relationship betweenand.A total of 51 LcMYB genes were identified, 51 MYB protein sequences with conserved domain were predicted. LcMYB can be divided into three classes (R1-LcMYB, R2R3-LcMYB and R3-LcMYB) according to the conserved domain, and all the LcMYB motifs contained three conserved tryptophan. All the MYB proteins ofwere hydrophilic and rich in basic amino acids, with high thermal stability. Most of the proteins were mainly in random curl, among them, R2R3-LCMYB39, R2R3-LCMYB47, R2R3-LCMYB48 and R2R3-LCMYB50 were mainly in α-helix. MYB family ofcould be divided into three groups on the basis of evolutionary tree with the MYB family of.The structure and function information of 51 genes associated with MYB transcription factor family members was obtained in, thereinto, two genes were involved in the biosynthesis of flavonoids, which provided molecular basis for the subsequent cloning of genes related to the biosynthesis of flavonoids.

Hance; MYB; bioinformatics; flavonoids; transcription factor

R282.12

A

0253 - 2670(2022)16 - 5149 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.16.024

2022-02-03

西華師范大學?；究蒲袠I(yè)務(wù)費（19B033）；青海民族大學校級理工科項目（2019XJY02）；綿陽師范學院科研啟動項目（QD2019A13）

楊敬天（1983—），男，四川綿陽人，博士，講師，主要從事植物系統(tǒng)進化與藥用植物學研究。Tel: 13699629310 E-mail: yjtdc83@163 com

劉小紅（1975—），男，重慶彭水人，博士，教授，主要從事植物分子遺傳學研究。Tel: 13330761109 E-mail: 350783409@qq.com

[責任編輯 時圣明]