沈方科，王亞萍#，趙雪梅，范曉蘇，李云春，顧明華，韋燕燕，周權(quán)能，何禮新*

（1.廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣西 南寧 530005；2.廣西壯族自治區(qū)土壤肥料工作站，廣西 南寧 530002）

硒是世界衛(wèi)生組織確認(rèn)的人和動(dòng)物必需的14種微量元素之一［1］，被稱為“長(zhǎng)壽元素”。世界上40多種疾病都與缺硒有關(guān)，如克山病、大骨節(jié)病以及一些心腦血管疾病、糖尿病、心臟病、癌癥、高血壓等［2-4］。中國(guó)營(yíng)養(yǎng)學(xué)會(huì)建議中國(guó)居民膳食營(yíng)養(yǎng)中成年人每天對(duì)硒的適宜攝入量為60～250μg，安全攝入量為400μg，而我國(guó)平均每人每日對(duì)硒的攝入量還達(dá)不到40μg［5-6］。硒的生物活性及生理功能不僅取決于硒的總濃度水平，更取決于其存在的化學(xué)形態(tài)［7-9］。一般有機(jī)態(tài)硒的毒性要遠(yuǎn)小于無(wú)機(jī)態(tài)的硒，在生物可利用性以及生物活性上有機(jī)態(tài)硒遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于無(wú)機(jī)態(tài)的硒［10］。硒代氨基酸是人日常膳食中獲取硒的主要來(lái)源，其中硒代蛋氨酸來(lái)自植物體，硒代半胱氨酸來(lái)自動(dòng)物體。

中國(guó)是水稻種植大國(guó)，水稻產(chǎn)量世界排名第一，每年稻谷產(chǎn)量有2×108t，我國(guó)一半以上人口都以大米作為主食［11］，因此大米富硒后可作為日常非常重要的硒元素?cái)z入源。中國(guó)約一半地區(qū)土壤屬于缺硒狀態(tài)，同時(shí)受種植的水稻品種和土壤環(huán)境的影響，產(chǎn)出的大米中硒的含量非常低，難以滿足人們?nèi)粘Ｋ璧奈鴶z入量［12-13］。因此，研究施加外源硒提高稻米硒含量，對(duì)從大米主食途徑提高并滿足人們?nèi)粘Ｎ臄z入量具有重要意義。有大量研究證實(shí)，葉面施加硒肥可以提高大米中硒的含量［14-16］。而有關(guān)葉面噴施氨基酸螯合硒并綜合分析外源硒供給對(duì)水稻硒吸收和稻米硒形態(tài)的影響研究卻鮮見(jiàn)報(bào)道。

本研究以水稻品種百香139為材料，通過(guò)大田試驗(yàn)，以氨基酸螯合硒作為外源硒，采用葉面噴施方式，考察不同的施硒量及在水稻不同的生育期施硒對(duì)水稻硒吸收分配、籽粒硒含量及其形態(tài)的影響，為富硒水稻的安全生產(chǎn)提供參考依據(jù)和指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試水稻品種為百香139，外源硒為實(shí)驗(yàn)室自制的氨基酸螯合硒（氨基酸含量≥100 g/L，含硒≥8 g/L）。試驗(yàn)地點(diǎn)為廣西壯族自治區(qū)南寧市賓陽(yáng)縣古辣鎮(zhèn)聯(lián)泉村朱沙屯。所選稻田地塊的土壤基本性質(zhì)為：pH 5.30；有機(jī)質(zhì)28.41 g/kg；銨態(tài)氮8.19 mg/kg；總硒0.424 mg/kg；有效硒0.018 mg/kg；有效磷20.07 mg/kg；速效鉀40.41 mg/kg。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 葉面噴施不同量的外源氨基酸螯合硒

試驗(yàn)設(shè)置10個(gè)處理，每個(gè)處理小區(qū)面積為74 m2，每個(gè)處理3次重復(fù)，隨機(jī)區(qū)組排列。在水稻破口期葉面噴施氨基酸螯合硒溶液的量分別為0、3.375、6.75、13.5、27.0、54.0、81.0、108.0、135.0、162.0 g/hm2（以硒計(jì)），兌水量675 L/hm2噴施。其他的水稻田間管理措施按當(dāng)?shù)亓?xí)慣生產(chǎn)技術(shù)操作。

1.2.2 不同生育期噴施外源氨基酸硒

采用單因素隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)設(shè)計(jì)，在水稻拔節(jié)孕穗期、始穗期、揚(yáng)花授粉期、灌漿期、蠟熟期5個(gè)時(shí)期葉面噴施氨基酸硒，同時(shí)設(shè)置葉面噴施清水對(duì)照（CK），共6個(gè)處理，每個(gè)處理重復(fù)3次，每個(gè)處理小區(qū)面積為74 m2。在各處理試驗(yàn)區(qū)水稻進(jìn)入相應(yīng)時(shí)期時(shí)葉面噴施外源氨基酸螯合硒1次，用量為13.5 g/hm2（以硒計(jì)）。其他的水稻田間管理措施按當(dāng)?shù)亓?xí)慣生產(chǎn)技術(shù)操作。

1.3 樣品采集與制備

土壤樣品采集與制備：利用土鉆在種植水稻前的試驗(yàn)大田中隨機(jī)選擇15個(gè)采樣點(diǎn)采取其耕作層土壤，將土壤中混有的雜草、根系和石塊等雜物除去，并充分混勻，風(fēng)干，用四分法取適量樣品，將其全部粉碎后過(guò)0.149 mm篩，混勻?qū)⑵涿芊庠诿芊獯?，用于大田試?yàn)供試土壤基礎(chǔ)理化性質(zhì)的測(cè)定。

植株樣品采集與制備：本次試驗(yàn)水稻播種時(shí)間為2018年3月17日，移栽插秧時(shí)間為2018年4月9日，水稻成熟收獲時(shí)間為2018年7月20日。水稻成熟后，用蛇形法采集，用鐮刀將整棵水稻植株地上部分割下，先放至塑料袋中，帶回實(shí)驗(yàn)室后依次用清水、去離子水清洗，將水稻莖、葉、穗分開(kāi)。莖、葉放在烘箱105℃殺青30 min，65℃烘干后磨碎，用于檢測(cè)水稻不同組織中硒含量。穗曬干后，將籽粒剝出，并逐步加工至精米，用于檢測(cè)水稻籽粒中的硒含量和硒形態(tài)。

1.4 樣品測(cè)定

土壤理化性質(zhì)測(cè)定參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定方法，其中土壤有機(jī)質(zhì)含量采用濃硫酸-重鉻酸鉀外加熱法進(jìn)行測(cè)定；土壤全硒含量采用原子熒光光譜法（參照NY/T 1104-2006中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《土壤中全硒的測(cè)定》）進(jìn)行測(cè)定；土壤有效硒含量采用氫化物發(fā)生原子熒光光譜法進(jìn)行測(cè)定，土壤有效硒浸提方法為：稱取土壤樣品1.0 g（精確到0.001 g）于離心管中，準(zhǔn)確加入10 mL 0.25 mol/L KH2PO4浸提液，于30℃、1500 r/min振蕩提取60 min，3000 r/min離心15 min，取上清液5 mL于微波消解罐中，加入HNO37 mL、H2O21 mL，樣品消解完畢后，在趕酸板上160℃左右加熱趕酸至約2 mL，加入5 mL 6 mol/L鹽酸，再趕酸至2 mL以下，轉(zhuǎn)入10 mL容量瓶中，用5%鹽酸溶液定容。

水稻莖、葉和籽粒中全硒含量測(cè)定采用氫化物原子熒光光譜法，參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中硒的測(cè)定》（GB 5009.93-2017）進(jìn)行測(cè)定；水稻籽粒中硒形態(tài)的測(cè)定方法采用高效液相色譜-氫化物發(fā)生原子熒光光譜法進(jìn)行測(cè)定。取一定量的富硒稻米試樣進(jìn)行粉碎、混勻，過(guò)0.850 mm篩，稱取0.4 g（精確至0.0001 g）富硒稻米樣品于250 mL錐形瓶中，稱取40 mg鏈霉蛋白酶E溶于40 mL超純水，渦旋混勻，置于水浴振蕩器中，水溫37℃，2 h超聲提取。待提取結(jié)束后，于10000 r/min離心30 min，吸取上清液37℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮35倍，用1 mL超純水超聲復(fù)溶后于10000 r/min離心15 min，過(guò)0.22 μm的雙層有機(jī)濾膜，然后上機(jī)進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)做樣品空白。實(shí)驗(yàn)以生物成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)-玉米（GBW10012）為參照，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行檢驗(yàn)。采用空白試驗(yàn)、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)分析，校正曲線、平行雙樣方法進(jìn)行質(zhì)量控制。將質(zhì)控樣和樣品一起測(cè)定，并將質(zhì)控樣和被檢測(cè)樣品數(shù)據(jù)進(jìn)行比照，被檢測(cè)樣品的數(shù)據(jù)落在質(zhì)控樣標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)的合理范圍內(nèi)，則數(shù)據(jù)有效。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同施硒量對(duì)水稻各組織器官中硒含量的影響

為了研究不同氨基酸螯合硒施用量對(duì)水稻植株硒吸收的影響，對(duì)成熟期水稻的莖、功能葉及籽粒進(jìn)行硒含量的測(cè)定，如表1所示，在破口期隨葉面噴施氨基酸螯合硒施用量的增加，水稻莖、功能葉和籽粒中硒含量均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。已有研究表明，適量濃度的硒可促進(jìn)植物的生長(zhǎng)，而過(guò)量的硒對(duì)植物有毒害作用［17］，這也可能是在高硒條件下水稻植株硒含量下降的原因。在氨基酸螯合硒用量為135.0 g/hm2時(shí)水稻的功能葉和籽粒硒含量達(dá)到最大，分別為7.984和1.349 mg/kg；水稻莖的硒含量在氨基酸螯合硒用量為81.0 g/hm2時(shí)達(dá)到最大，為2.139 mg/kg。除3.375、13.5 g/hm2施硒量外，在相同的硒施用量時(shí)，水稻功能葉相較于其他器官硒含量最高。

表1 不同外源硒用量水稻籽粒、功能葉及莖中硒含量

籽粒中的硒含量隨氨基酸螯合硒的施用量增加而增加，但當(dāng)外源硒用量過(guò)高時(shí)（162.0 g/hm2）稻米籽粒中硒含量有所下降，這可能是過(guò)量的外源硒對(duì)水稻有毒害作用，在高硒脅迫條件下水稻外源硒吸收轉(zhuǎn)化下降導(dǎo)致籽粒中硒含量下降，雖然與噴施135.0 g/hm2的差異不顯著，但也能夠說(shuō)明硒用量過(guò)高反而抑制水稻籽粒對(duì)硒的吸收。外源硒用量為6.75、13.5、27.0 g/hm2的處理，水稻籽粒的硒含量分別為0.167、0.431、0.439 mg/kg，均達(dá)到廣西富硒農(nóng)產(chǎn)品糧食類地方標(biāo)準(zhǔn)（DB45/T 1061-2014）（硒含量0.15～0.50 mg/kg）。因此，從富硒效果、硒的安全用量和經(jīng)濟(jì)方面綜合考慮，在富硒水稻生產(chǎn)中，氨基酸螯合硒最佳葉面施用量為13.5 g/hm2。

為明確氨基酸螯合硒施用量與水稻地上部各組織器官硒含量的關(guān)系以及各組織器官中硒含量之間的關(guān)系，對(duì)施硒量和水稻各器官含硒量之間進(jìn)行了相關(guān)性分析。相關(guān)性分析表明，氨基酸螯合硒施用量與水稻莖、功能葉、籽粒的相關(guān)系數(shù)（R）分別是0.888、0.919、0.934，水稻地上部各組織器官硒含量與氨基酸螯合硒施用量存在極顯著相關(guān)（P≤0.01）。

2.2 不同施硒量對(duì)水稻籽粒中硒形態(tài)的影響

分析水稻破口期噴施不同用量氨基酸螯合硒后水稻籽粒中硒的形態(tài)（圖1），結(jié)果表明水稻籽粒中有機(jī)硒主要以硒代蛋氨酸的形態(tài)存在，有微量L-硒-甲基硒代半胱氨酸和極少量L-硒代胱氨酸，并有極少量無(wú)機(jī)硒為亞硒酸鈉。隨著施用外源氨基酸螯合硒量的增加，水稻籽粒中硒代蛋氨酸含量有增加的趨勢(shì)，在氨基酸螯合硒用量為135.0 g/hm2時(shí)達(dá)到最大，為1.034 mg/kg；而在氨基酸螯合硒用量大于等于54.0 g/hm2時(shí)，才檢測(cè)出L-硒-甲基硒代半胱氨酸；只在氨基酸螯合硒用量為162.0 g/hm2時(shí)，檢測(cè)出極少量的L-硒代胱氨酸。

通過(guò)對(duì)水稻籽粒中硒代蛋氨酸占總硒含量比例（圖2）分析可知，施用外源硒后水稻籽粒中硒代蛋氨酸含量比例有所下降，這與馬潔等［18］的研究結(jié)果相一致。不施外源硒時(shí)，水稻籽粒中硒代蛋氨酸含量占總硒含量的85.3%，隨著施用外源硒量的增加，不同施硒量水稻籽粒中硒代蛋氨酸含量占總硒的比例為51.3%～69.0%，方差分析表明，3.375、13.5、27.0、108.0、162.0/hm2施硒量處理與對(duì)照相比差異顯著，表明不同施硒量對(duì)水稻籽粒中硒代蛋氨酸含量占比有較大影響。

2.3 不同生育期施用氨基酸螯合硒對(duì)水稻籽粒中硒含量的影響

結(jié)果如圖3所示，相比對(duì)照的水稻籽粒硒含量（0.070 mg/kg），在水稻不同生育期葉面噴施氨基酸螯合硒13.5 g/hm2（以硒計(jì)）均顯著提高了水稻籽粒硒含量（P＜0.05），而灌漿期噴施處理的水稻籽粒硒含量最高（達(dá)到0.320 mg/kg）。不同生育期葉面噴施外源硒后水稻籽粒硒含量不同，水稻不同生育期葉面噴施外源硒籽粒硒含量由大到小依次為：灌漿期＞揚(yáng)花授粉期＞始穗期＞蠟熟期＞拔節(jié)孕穗期。水稻籽粒硒含量均達(dá)到國(guó)家富硒大米的硒含量標(biāo)準(zhǔn)（GB/T 22499-2008）（富硒稻谷，硒含量0.04～0.30 mg/kg）或廣西富硒農(nóng)產(chǎn)品硒含量分類要求的地方標(biāo)準(zhǔn)（DB 45/T 1061-2014）中的富硒大米硒含量的要求（硒含量0.15～0.50 mg/kg）。

圖1 噴施不同用量外源硒水稻籽粒中硒形態(tài)含量

圖2 不同外源硒用量水稻籽粒中硒代蛋氨酸占總硒含量比例

圖3 不同時(shí)期噴施氨基酸螯合硒水稻籽粒硒含量

2.4 不同生育期施用氨基酸螯合硒對(duì)水稻籽粒硒形態(tài)的影響

結(jié)果表明，在水稻不同生育期噴施氨基酸螯合硒13.5 g/hm2（以硒計(jì)），水稻籽粒中硒形態(tài)除了硒代蛋氨酸，其他形態(tài)硒均未檢出。由圖4可知，在5個(gè)不同生育期水稻籽粒中硒代蛋氨酸含量均比對(duì)照高，方差分析表明除蠟熟期外均比對(duì)照有顯著差異。始穗期噴施外源硒水稻籽粒中硒代蛋氨酸含量最高，為0.178 mg/kg。不同時(shí)期噴施外源硒水稻籽粒中硒代蛋氨酸含量由大到小依次為始穗期＞灌漿期＞揚(yáng)花授粉期＞拔節(jié)孕穗期＞蠟熟期＞對(duì)照處理。

圖4 不同時(shí)期噴施氨基酸螯合硒水稻籽粒中硒代蛋氨酸含量

對(duì)水稻籽粒中硒代蛋氨酸占總硒量比例（圖5）的分析發(fā)現(xiàn)，硒代蛋氨酸占比隨著施硒時(shí)間越靠近成熟期占比越低，拔節(jié)孕穗期噴施籽粒硒代蛋氨酸占比最高達(dá)到91%，暗示水稻葉片中硒轉(zhuǎn)化時(shí)間的長(zhǎng)短對(duì)水稻籽粒中硒形態(tài)有顯著影響，不同生育期中越早噴施氨基酸螯合硒，籽粒中硒代蛋氨酸含量比例越高，提早噴施外源硒有利于硒代蛋氨酸有機(jī)態(tài)硒的形成，可提高籽粒中有機(jī)態(tài)硒的比例。

圖5 不同時(shí)期噴施氨基酸螯合硒水稻籽粒中硒代蛋氨酸含量占比

3 討論

3.1 不同用量和不同時(shí)期外源硒處理對(duì)水稻籽粒含硒量的影響

本研究噴施不同濃度的外源硒可提高水稻不同器官中硒的含量，在一定范圍內(nèi)噴施外源硒濃度越高水稻植株硒含量越高。但當(dāng)外源硒用量為162.0 g/hm2時(shí)稻米籽粒中硒含量反而下降，可能與外源硒用量過(guò)高產(chǎn)生毒害作用而影響硒的吸收轉(zhuǎn)化有關(guān)。本研究結(jié)果中硒在莖、葉中比在籽粒中較容易富集，這與文獻(xiàn)［19-22］報(bào)道基本一致，但也與有些文獻(xiàn)報(bào)道葉面噴硒后籽粒硒含量比水稻莖稈高不同［18］。本試驗(yàn)在水稻破口期氨基酸螯合硒施用量分別為6.75、13.5、27.0 g/hm2時(shí)水稻籽粒的硒含量均達(dá)到廣西富硒農(nóng)產(chǎn)品糧食類地方標(biāo)準(zhǔn)（DB45/T 1061-2014）（0.15～0.50 mg/kg）。分別在水稻不同生育期葉面噴施13.5 g/hm2（以硒計(jì)）的氨基酸螯合硒，水稻籽粒硒含量由大到小依次表現(xiàn)為：灌漿期＞揚(yáng)花授粉期＞始穗期＞蠟熟期＞拔節(jié)孕穗期，且均達(dá)到國(guó)家或廣西富硒大米標(biāo)準(zhǔn)硒含量的要求。這說(shuō)明葉面噴施氨基酸螯合硒外源補(bǔ)硒方式對(duì)水稻籽粒富硒具有一定效果，且可以到達(dá)生產(chǎn)富硒水稻的目的。這對(duì)利用葉面噴施氨基酸螯合硒生產(chǎn)富硒水稻的實(shí)踐中，明確最佳的施硒量和時(shí)期以及硒的安全用量具有重要的指導(dǎo)意義。

3.2 不同外源硒處理對(duì)水稻籽粒硒形態(tài)的影響

本研究發(fā)現(xiàn)，外源硒處理水稻籽粒中硒主要以有利于人體吸收的硒代蛋氨酸有機(jī)硒形態(tài)賦存，這與現(xiàn)有文獻(xiàn)［17，23-26］報(bào)道基本一致。水稻籽粒中硒代蛋氨酸和L-硒-甲基硒代半胱氨酸有機(jī)硒含量隨噴施外源氨基酸螯合硒用量的增加而增加。在5個(gè)不同生育期葉面施硒水稻籽粒中硒代蛋氨酸含量均比對(duì)照高，除蠟熟期外均比對(duì)照有顯著效果。硒代蛋氨酸含量占總硒含量的43%～91%，硒代蛋氨酸含量占比隨著施硒量的增加有下降的趨勢(shì)，隨著施硒時(shí)期越靠近水稻成熟期硒代蛋氨酸占比越低，說(shuō)明在水稻生育期越早施硒對(duì)提高硒代蛋氨酸有機(jī)硒的比例越有利。

4 結(jié)論

在水稻破口期葉面噴施不同用量外源氨基酸螯合硒，適量范圍內(nèi)可顯著提高水稻的硒含量，外源氨基酸螯合硒用量過(guò)高會(huì)抑制水稻籽粒對(duì)硒的吸收。水稻籽粒中硒的形態(tài)主要為硒代蛋氨酸有機(jī)態(tài)硒，硒代蛋氨酸含量隨噴施外源硒用量的增加而增加，籽粒中硒代蛋氨酸含量變化與總硒含量的變化規(guī)律相一致。外源氨基酸螯合硒噴施量為6.75、13.5和27.0 g/hm2時(shí)水稻籽粒中硒含量分別為0.167、0.431和0.439 mg/kg，達(dá)到廣西富硒農(nóng)產(chǎn)品糧食類的地方標(biāo)準(zhǔn)（DB45/T 1061-2014）富硒大米硒含量的要求（硒含量0.15～0.50 mg/kg）。水稻籽粒中硒代蛋氨酸含量占總硒含量的比例為51.3%～69.0%，與對(duì)照相比，其占比有所降低。

在水稻5個(gè)不同生育期噴施氨基酸螯合硒量為13.5 g/hm2，水稻籽粒硒含量由大到小依次為：灌漿期＞揚(yáng)花授粉期＞始穗期＞蠟熟期＞拔節(jié)孕穗期，對(duì)應(yīng)的硒含量依次為0.320、0.293、0.250、0.180和0.123 mg/kg，均達(dá)到國(guó)家富硒大米或廣西富硒大米標(biāo)準(zhǔn)硒含量的要求。水稻籽粒中硒形態(tài)主要為硒代蛋氨酸，不同生育期噴施氨基酸螯合硒可提高硒代蛋氨酸含量，硒代蛋氨酸含量占總硒含量的比例為43%～91%，硒代蛋氨酸比例隨著施硒時(shí)期越靠近水稻成熟期越低。

綜上所述，本研究在水稻破口期葉面噴施外源氨基酸螯合硒生產(chǎn)富硒水稻的最佳用量為13.5 g/hm2，在水稻5個(gè)不同生育期噴施13.5 g/hm2外源氨基酸螯合硒均能生產(chǎn)出富硒大米，最佳噴施時(shí)期為水稻的灌漿期，研究獲得了氨基酸螯合硒肥的科學(xué)合理施肥方式，為富硒和低硒地區(qū)生產(chǎn)富硒稻米提供科學(xué)指導(dǎo)。