龐力峰，羅舒壬，周曙光，廖 欣

(廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院，廣西南寧 530022)

簇花清風(fēng)藤(Sabiafasciculata)為清風(fēng)藤科植物，主要分布于云南、廣西、廣東、福建等地。該植物性溫，味甘、微澀，有祛風(fēng)濕、散淤消腫的功效。傳統(tǒng)上主要用于治療風(fēng)濕骨痛、腎炎水腫、跌打損傷等疾病[1]。文獻(xiàn)報(bào)道簇花清風(fēng)藤中含有五環(huán)三萜、黃酮、生物堿、甾體等化合物[2]。慢性腎小球腎炎(Chronic Glomerulonephritis，CGN)是一種以腎小球?yàn)V過(guò)率下降、蛋白尿等為特征的慢性腎病。有研究表明，腎小球上皮細(xì)胞和系膜細(xì)胞氧化及炎癥損傷，在CGN的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用[3,4]。研究顯示，核轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子2 (Nuclear factor-erythroid 2-related factor 2,Nrf2)是體內(nèi)維持氧化還原平衡的重要調(diào)節(jié)因子，參與調(diào)控腎臟疾病中的氧化應(yīng)激和炎癥狀態(tài)[5]。多項(xiàng)研究也證實(shí)，激活Nrf2介導(dǎo)的抗氧化系統(tǒng)具有良好的改善腎病的作用[6,7]。

有報(bào)道稱，簇花清風(fēng)藤醇提取物具有良好的抗炎鎮(zhèn)痛活性[8]，結(jié)合其民間使用經(jīng)驗(yàn)及相關(guān)機(jī)制，推測(cè)其對(duì)慢性腎炎可能具有潛在的藥理作用。本研究以簇花清風(fēng)藤醇提取物為對(duì)象，觀察其對(duì)阿霉素所致慢性腎小球腎炎模型大鼠中腎組織病理變化、氧化應(yīng)激與炎癥損傷的影響，探討簇花清風(fēng)藤醇提取物改善CGN大鼠氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的相關(guān)機(jī)制，為藥物開發(fā)及臨床應(yīng)用提供藥理學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物及飼料

SPF級(jí)雄性SD大鼠，體質(zhì)量180-220 g，購(gòu)自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK桂2014-0002，普通飼料由北京科澳協(xié)力飼料有限公司提供。大鼠飼養(yǎng)室溫保持在20-25℃，濕度55%左右，動(dòng)物自由進(jìn)食、進(jìn)水，按每日12 h進(jìn)行晝夜循環(huán)。

1.1.2 藥材與試劑

簇花清風(fēng)藤枝葉采自廣西壯族自治區(qū)來(lái)賓市金秀瑤族自治縣，經(jīng)廣西中醫(yī)藥研究院中藥資源所胡仁傳老師鑒定為簇花清風(fēng)藤SabiafasciculataLecomte ex L.Chen。腎炎舒片(吉林市鹿王制藥股份有限公司，批號(hào)：202000145)，注射用阿霉素凍干粉(北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：202009123)。尿蛋白定量試劑盒(南京建成生物科技有限公司，批號(hào)：20200807)，尿素(UREA)血生化試劑盒(批號(hào)：141320009)，肌酐(CREA)血生化試劑盒(批號(hào)：141120017)，均購(gòu)自深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司。腫瘤壞死因子α (TNF-α)ELISA試劑盒(批號(hào)：F3056-A)，白介素1β (IL-1β) ELISA試劑盒(批號(hào)：F8655-A)，白介素6 (IL-6) ELISA試劑盒(批號(hào)：F8066-A)，均購(gòu)自上海泛柯實(shí)業(yè)有限公司。BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒，購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；核因子NFE2相關(guān)因子2(Nrf2)單克隆抗體、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)單克隆抗體、β-actin單克隆抗體均購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。辣根過(guò)氧化物標(biāo)記山羊抗兔IgG H+L (HRP)、辣根過(guò)氧化物標(biāo)記山羊抗鼠IgG H+L (HRP)均購(gòu)自艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司。蘇木素伊紅染液，購(gòu)自北京雷根生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 儀器

BS-600血液生化分析儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)；RE100-Pro旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀[大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器(北京)股份公司]；Universal 320R高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Hettich科學(xué)儀器有限公司)；FluorChem R化學(xué)發(fā)光成像儀(美國(guó)ProteinSimple公司)；Multiskan GO酶標(biāo)儀[賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司]；EG1150石蠟包埋機(jī)、RM2255組織切片機(jī)、DM2500光學(xué)顯微鏡均購(gòu)自德國(guó)徠卡儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 受試藥物的制備

簇花清風(fēng)藤枝葉經(jīng)陰涼處干燥后切碎，稱取7 kg藥材，經(jīng)95%乙醇回流提取3次，合并濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至3.5 L，濃度為2 g生藥量/mL，該濃度為簇花清風(fēng)藤醇提取物高劑量給藥濃度；用蒸餾水稀釋1倍，混勻后，即為簇花清風(fēng)藤低劑量給藥濃度。

1.2.2 慢性腎小球腎炎模型建立

70只SD大鼠，經(jīng)適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，一次性尾靜脈注射阿霉素(7 mg/kg)制備慢性腎小球腎炎模型，再選取8只SD大鼠作為空白組，注射等量生理鹽水。動(dòng)物造模后每周末收集尿液，檢測(cè)24 h尿蛋白含量，當(dāng)尿蛋白含量>100 mg/24 h視為造模成功[9]。

1.2.3 分組及給藥

兩周后，取造模成功的大鼠32只，按體質(zhì)量隨機(jī)分為模型組、腎炎舒(SYS，6 g/kg)組、簇花清風(fēng)藤醇提取物(SF-95E)高劑量(SF-95E-20，20 g生藥/kg)組和低劑量(SF-95E-10，10 g生藥/kg)組，每組8只。各給藥組給予相應(yīng)藥物，按10 mL/kg體質(zhì)量灌胃給藥，每日1次，連續(xù)2周，空白組和模型組給予等量的蒸餾水。

1.2.4 尿蛋白含量檢測(cè)

末次給藥1 h后，將大鼠置于代謝籠內(nèi)，收集24 h尿液，按照試劑盒說(shuō)明書測(cè)定尿蛋白含量。

1.2.5 血清UREA和CREA含量的測(cè)定

末次給藥24 h后，大鼠經(jīng)3%異氟烷麻醉，腹主動(dòng)脈取血，4℃、3 500 r/min離心10 min，收集血清，采用全自動(dòng)血液生化分析儀測(cè)定血清UREA和CREA的含量。

1.2.6 腎臟臟器指數(shù)

大鼠斷頸椎處死后，剝離雙側(cè)腎組織，稱取質(zhì)量，計(jì)算臟器指數(shù)。大鼠腎臟臟器指數(shù)=大鼠雙側(cè)腎臟質(zhì)量(mg)/大鼠體質(zhì)量(g)。

1.2.7 腎臟TNF-α、IL-1β和IL-6含量的測(cè)定

取左側(cè)腎臟200 mg，去除血漬后，按1∶9(W∶V)的體積加入冰冷的生理鹽水中進(jìn)行冰浴勻漿，將組織勻漿液于15 000 r/min離心10 min，吸取上清液，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書測(cè)定腎臟組織中TNF-α、IL-1β和IL-6炎癥因子的含量。

1.2.8 腎組織Nrf2、iNOS蛋白表達(dá)水平的測(cè)定

取左側(cè)腎臟200 mg，去除血漬后，在液氮中研磨碎，加入含RIPA的組織蛋白裂解液冰浴裂解組織，15 000 r/min離心10 min，收集上清液即為總蛋白。采用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度，采用SDS-PAGE凝膠電泳，恒壓轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉中封閉2 h，TBST洗膜，以Nrf2、iNOS一抗(1∶1 000)4℃孵育過(guò)夜，PBST洗膜，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶5 000)孵育2 h，PBST洗膜，于化學(xué)發(fā)光成像儀內(nèi)曝光。蛋白條帶采用Quantity one軟件分析灰度值，以β-actin作為內(nèi)參蛋白，以目的蛋白條帶灰度值/β-actin蛋白條帶灰度值作為該目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.9 腎組織病理學(xué)檢查

取右側(cè)腎臟組織，輕輕擦除表面血液，以10%中性福爾馬林溶液固定，70%-80%-95%-100%梯度乙醇脫水，二甲苯透明40 min，浸蠟3 h，包埋，再進(jìn)行石蠟切片。HE染色步驟如下：取切片， 100%-95%-80%-70%梯度乙醇復(fù)水，蘇木素染色液染色5 min，鹽酸酒精分化5 s，氨水返藍(lán)5 s，伊紅染液染色4 min，再于70%-80%-95%-100%梯度乙醇脫水，二甲苯透明5 min，中性樹膠封片。將切片置于顯微鏡下觀察腎臟病理形態(tài)變化。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果與分析

2.1 SF-95E對(duì)CGN大鼠尿蛋白含量的影響

由表1可知，給藥前，與空白組相比，模型組大鼠24 h尿蛋白含量顯著增加(P<0.05)，提示7 mg/kg阿霉素可誘導(dǎo)大鼠出現(xiàn)慢性腎炎，造模大鼠出現(xiàn)腎小球?yàn)V過(guò)功能障礙。經(jīng)過(guò)2周給藥后，與模型組相比，SF-95E-20組、腎炎舒組大鼠24 h尿蛋白含量顯著降低(P<0.05)，而SF-95E-10組尿蛋白含量略降低，但與模型組相比無(wú)顯著性差異(P>0.05)。與給藥前相比，給藥2周后腎炎舒、SF-95E各給藥組尿蛋白水平均出現(xiàn)明顯下調(diào)，而模型組和空白組反而升高。綜上可知，SF-95E-20具有減輕腎炎損傷、改善腎小球?yàn)V過(guò)功能的作用。

表1 SF-95E對(duì)CGN大鼠尿蛋白含量的影響Table 1 Effects of SF-95E on urine protein content in CGN rats

2.2 SF-95E對(duì)CGN大鼠血清UREA和CREA含量的影響

由圖1可知，7 mg/kg阿霉素靜脈注射后可誘導(dǎo)模型組大鼠血清UREA和CREA含量顯著增加，與空白組大鼠相比具有顯著性差異(P<0.05)。與模型組相比，經(jīng)藥物干預(yù)2周后，腎炎舒、SF-95E-20可顯著降低CGN大鼠血清UREA和CREA含量(P<0.05)，說(shuō)明SF-95E-20和腎炎舒均可以減輕阿霉素誘導(dǎo)的大鼠腎損傷。

*P<0.05 compared with blank group;#P<0.05 compared with model group

2.3 SF-95E對(duì)CGN大鼠腎臟TNF-α、IL-1β和IL-6炎性因子水平的影響

如表2所示，與空白組相比，模型組大鼠腎臟組織中TNF-α、IL-1β和IL-6含量均顯著升高(P<0.05)。與模型組相比，藥物干預(yù)2周后，SF-95E-20和腎炎舒均可顯著降低CGN大鼠腎臟組織中TNF-α、IL-1β和IL-6含量，進(jìn)而減輕阿霉素誘導(dǎo)的腎炎癥反應(yīng)(P<0.05)；SF-95E-10可顯著降低大鼠腎臟組織中IL-1β和IL-6含量(P<0.05)，但對(duì)TNF-α的水平不具有顯著影響(P>0.05)。

表2 SF-95E對(duì)CGN大鼠腎臟組織TNF-α、IL-1β和IL-6含量的影響(pg/mgprot)Table 2 Effects of SF-95E on TNF-α、IL-1β and IL-6 content in kidney of CGN rats (pg/mgprot)

2.4 SF-95E對(duì)CGN大鼠腎臟Nrf2、iNOS蛋白表達(dá)水平的影響

如圖2所示，與空白組相比，模型組大鼠抗氧化相關(guān)蛋白Nrf2水平顯著降低，氧化應(yīng)激炎癥相關(guān)蛋白iNOS水平顯著升高(P<0.05)，表明阿霉素通過(guò)Nrf2/iNOS體系進(jìn)一步誘導(dǎo)了腎組織的氧化應(yīng)激損傷。藥物干預(yù)2周后，與模型組相比，腎炎舒組、SF-95E-20組可顯著升高CGN大鼠腎臟組織Nrf2蛋白水平、下調(diào)iNOS蛋白水平(P<0.05)，表明腎炎舒和SF-95E-20可增強(qiáng)腎臟抗氧化應(yīng)激能力，進(jìn)而減輕腎損傷。SF-95E-10組對(duì)腎臟Nrf2、iNOS蛋白表達(dá)無(wú)顯著性影響。

*P<0.05 compared with blank group;#P<0.05 compared with model group

2.5 SF-95E對(duì)CGN大鼠腎臟臟器指數(shù)的影響

由圖3可知，與空白組相比，模型組大鼠腎臟臟器指數(shù)顯著升高(P<0.05)，表明7 mg/kg阿霉素靜脈注射后，大鼠腎臟質(zhì)量減少，進(jìn)一步確認(rèn)了阿霉素對(duì)腎臟的損傷作用。SF-95E各給藥組的腎臟臟器指數(shù)均有不同程度的降低，但與模型組相比，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

*P<0.05 compared with blank group;#P<0.05 compared with model group

2.6 SF-95E對(duì)CGN大鼠腎臟組織病理變化的影響

與空白組相比，模型組大鼠腎臟腎小管變性，管腔擴(kuò)張呈現(xiàn)紡錘狀或橢圓形，管腔內(nèi)上皮細(xì)胞胞質(zhì)核固縮，管腔內(nèi)偶見(jiàn)脫落上皮細(xì)胞和細(xì)胞碎片；腎小球內(nèi)細(xì)胞核固縮，明顯變小，腎小球囊腔變寬。與模型組相比，腎炎舒組和SF-95E-20組大鼠腎臟腎小管擴(kuò)張程度減輕，腎小球囊腔出現(xiàn)不同程度減小的現(xiàn)象，表明SF-95E-20通過(guò)改善腎小球和腎小管功能，進(jìn)而減輕阿霉素致大鼠腎損傷的作用，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 SF-95E對(duì)CGN大鼠腎臟病理變化的影響(200×，n=8)Fig.4 Effects of SF-95E on pathological changes of kidney in CGN rats (200×，n=8)

3 討論

慢性腎小球腎炎又稱為慢性腎炎，是由多種致病因素(如過(guò)度疲勞、細(xì)菌或病毒感染、異常應(yīng)激反應(yīng)、水和電解質(zhì)紊亂以及藥物毒性等)引起的原發(fā)性腎小球疾病[10]，臨床主要表現(xiàn)為蛋白尿、高血壓、水腫等，受腎小球?yàn)V過(guò)率下降的影響，常在患者血液中發(fā)現(xiàn)有高水平CREA和UREA[11]。

阿霉素是一類抗腫瘤藥物，進(jìn)入體內(nèi)后，經(jīng)腎消除可產(chǎn)生活性氧自由基，從而誘發(fā)腎小球上皮細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，破壞腎小球?yàn)V膜結(jié)構(gòu)，提高蛋白濾過(guò)從而形成蛋白尿，目前已被廣泛應(yīng)用于動(dòng)物腎病模型研究[12,13]。本試驗(yàn)通過(guò)給大鼠靜脈注射阿霉素(7 mg/kg)2周后，可形成穩(wěn)定的尿蛋白水平(>100 mg/24 h)，并且誘導(dǎo)大鼠腎臟腎小球病理?yè)p傷以及炎癥反應(yīng)，表現(xiàn)為iNOS、TNF-α、IL-1β和IL-6等蛋白的上調(diào)，以及對(duì)Nrf2介導(dǎo)的抗氧化系統(tǒng)的抑制。多項(xiàng)研究認(rèn)為，Nrf2是治療慢性腎炎、糖尿病腎炎的關(guān)鍵靶點(diǎn)，通過(guò)激活Nrf2可以減輕腎氧化應(yīng)激反應(yīng)，平衡氧化還原體系，可有效減輕糖尿病腎病的足細(xì)胞損傷[14-17]。

簇花清風(fēng)藤為瑤族民間用藥，含有豐富的藥效活性物質(zhì)，如五環(huán)三萜類化合物、黃酮類化合物、生物堿、甾體化合物等。本研究發(fā)現(xiàn)，簇花清風(fēng)藤醇提取物通過(guò)激活Nrf2抗氧化應(yīng)激系統(tǒng)，下調(diào)下游炎癥相關(guān)蛋白iNOS、TNF-α、IL-1β和IL-6的表達(dá)，改善腎損傷血清學(xué)指標(biāo)和腎小球病理變化，進(jìn)而減輕阿霉素引起的腎小球損傷。目前，簇花清風(fēng)藤醇提取物改善腎炎作用的物質(zhì)基礎(chǔ)仍不太明確，需要結(jié)合更多分析技術(shù)手段，如HPLC-MS/MS技術(shù)，進(jìn)一步闡明其具體成分以及藥物在組織中的作用特點(diǎn)及相應(yīng)靶點(diǎn)。由于腎小球腎炎與基底膜、足細(xì)胞、系膜等因素有關(guān)，簇花清風(fēng)藤醇提取物是否通過(guò)Nrf2信號(hào)調(diào)節(jié)系膜細(xì)胞、足細(xì)胞病變等病理過(guò)程，仍需要結(jié)合相關(guān)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探究。

4 結(jié)論

簇花清風(fēng)藤醇提取物可以激活Nrf2信號(hào)通路，平衡氧化還原體系，從抗氧化應(yīng)激和減輕炎癥損傷的角度來(lái)減輕腎小球病理?yè)p傷，改善慢性腎小球腎炎疾病進(jìn)展。但本研究目前仍存在作用成分不明確的不足，下階段將進(jìn)一步探討簇花清風(fēng)藤改善腎小球腎炎疾病的具體藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及其作用機(jī)制，并尋找其中活性較好的藥效組分，為其臨床相關(guān)治療提供理論依據(jù)。