李海濱，孫煦勇，裴永峰**，黃程新，覃音紅，董建輝，楊 錦，王洪良，文 寧，吳基華，廖吉祥，李美思

(1.廣西醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院移植醫(yī)學(xué)中心，廣西器官捐獻(xiàn)與移植研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西移植醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究中心，廣西南寧 530007；2.中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九二三醫(yī)院器官移植科，廣西移植醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究中心，廣西移植醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧 530021)

人類(lèi)白細(xì)胞抗原(Human Leukocyte Antigen,HLA)，又稱(chēng)移植抗原，是目前所知人體最復(fù)雜的多態(tài)系統(tǒng)，在機(jī)體免疫系統(tǒng)與疾病的應(yīng)答時(shí)起關(guān)鍵作用，也是影響機(jī)體免疫耐受和排斥時(shí)非常重要的一個(gè)抗原[1]。截至2021年11月，被世界衛(wèi)生組織HLA系統(tǒng)因子命名委員會(huì)命名的等位基因數(shù)分別為7 114個(gè)(HLA-A)、8 464個(gè)(HLA-B)和3 045個(gè)(HLA-DRB1)，HLA等位基因共有31 675個(gè)[2]。不同地域、民族和疾病人群HLA的等位基因和單倍型頻率等具有各自的特點(diǎn)[3,4]。

研究發(fā)現(xiàn)，中國(guó)人群慢性腎病的患病率約為10.8%，部分患者最終發(fā)展成終末期腎病(End Stage Renal Disease,ESRD)，且ESRD的患者在逐年增加[5]。目前，腎移植被認(rèn)為是ESRD患者最好的治療方法，可明顯提高患者的生活質(zhì)量和生存率[6,7]。研究發(fā)現(xiàn)腎移植時(shí)供體和受體的HLA分型結(jié)果越吻合，受體腎的移植效果越好[8]，尤其是可直接激活受體的HLA-Ⅱ類(lèi)分子，是誘導(dǎo)移植排斥的重要靶抗原[9]。HLA與腎疾病相關(guān)性的研究始于20世紀(jì)，發(fā)現(xiàn)許多HLA等位基因與ESRD的發(fā)生具有關(guān)聯(lián)性，且在不同地域和人種中，其易感或保護(hù)基因具有差異[10-12]。

廣西總?cè)丝诩s5 000萬(wàn)，其中，漢族人口約3 100萬(wàn)(數(shù)據(jù)來(lái)源于廣西第七次全國(guó)人口普查主要數(shù)據(jù))，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于壯族人口。本研究采用聚合酶鏈反應(yīng)-序列特異性寡核苷酸(Polymerase Chain Reaction-Sequence Specific Oligonucleotides,PCR-SSO)技術(shù)，對(duì)本移植醫(yī)學(xué)中心和中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九二三醫(yī)院器官移植科的578例漢族ESRD患者進(jìn)行HLA基因中、高分辨分型，并與中國(guó)造血干細(xì)胞捐獻(xiàn)者資料庫(kù)廣西管理中心的漢族捐獻(xiàn)者相應(yīng)的基因頻率及單倍型頻率等進(jìn)行比較，為深入了解HLA和ESRD患者的發(fā)病機(jī)理及相關(guān)性研究奠定基礎(chǔ)，同時(shí)為器官移植配型篩選等提供數(shù)據(jù)支持和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 一般資料

ESRD組：從本移植醫(yī)學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室和中國(guó)人民解放軍第九二三醫(yī)院器官移植科實(shí)驗(yàn)室做HLA分型檢測(cè)的等待移植患者5 160例(2014年-2021年9月)中，隨機(jī)選取廣西本地漢族終末期腎病患者578例，彼此間無(wú)血緣關(guān)系。其中男性325例，年齡13-77歲，中位年齡41歲；女性253例，年齡12-68歲，中位年齡39歲。對(duì)照組：從中國(guó)造血干細(xì)胞捐獻(xiàn)者資料庫(kù)廣西管理中心約5 000例的捐獻(xiàn)者(2011-2015年)中，隨機(jī)選取廣西本地漢族1 644例，其中男性858名，女性786名，年齡18-50歲[13]。HLA分型檢測(cè)都獲得了實(shí)驗(yàn)組研究者的知情同意書(shū)。

1.2 主要儀器及試劑

DNA提取試劑盒(QIAamp DNA blood mini kit，荷蘭QIAGEN，批號(hào)：51104和51106)；HLA-A、B、DRB1、SSO基因分型檢測(cè)試劑盒(LIFECODES HLA-SSO TYPING KITS，美國(guó)Gen-Probe Transplant Diagnostics，批號(hào)LOT-A：628410，LOT-Ae：628459，LOT-B：628510，LOT-Be：628559，LOT-DRB1：628751，LOT-DRB1 e：628759)；9600型PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)Proflex)；核酸蛋白測(cè)定儀(Multiskan sky，美國(guó)Thermo)；多功能流式點(diǎn)陣儀(Luminex-200，美國(guó)Luminex)，干式恒溫器(H1型，珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司)。

1.3 方法

ESRD組采集2 mL或5 mL乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝靜脈血，嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)提取DNA，DNA濃度調(diào)整為30-100 ng/μL，A260/A280為1.65-1.90。采用LIFECODES HLA-SSO TYPING KITS對(duì)ESRD的靜脈血標(biāo)本進(jìn)行HLA-A、B、DRB1共3個(gè)位點(diǎn)的基因分型，所有的ESRD患者和相應(yīng)的供體在移植前，都進(jìn)行微量淋巴細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)。如果對(duì)ESRD患者的分型結(jié)果有疑問(wèn)，則再次用其靜脈血提取DNA，然后用LIFECODES HLA-SSO試劑復(fù)核。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

ESRD組HLA等位基因的頻率采用直接計(jì)算法，應(yīng)用Arlequin 3.5.2.2軟件對(duì)ESRD組的3個(gè)位點(diǎn)作Ewens-Watterson檢驗(yàn)和Hardy-Weinberg(HWE)檢驗(yàn)，ESRD組的單倍體頻率利用該軟件的最大期望(EM)算法[14]獲得。ESRD組與對(duì)照組等位基因及單倍型頻率的比較，采用SPSS 19.0軟件的χ2檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并計(jì)算優(yōu)勢(shì)比(Odds Ratio,OR)和95%可信區(qū)間(Confidence Interval,CI)。

2 結(jié)果與分析

2.1 Ewens-Watterson檢驗(yàn)

ESRD組和對(duì)照組人群Ewens-Watterson檢驗(yàn)的結(jié)果表明，兩組人群的3個(gè)位點(diǎn)都符合中性選擇(P>0.05)。

2.2 HWE檢驗(yàn)

HWE檢驗(yàn)結(jié)果表明，ESRD組中3個(gè)位點(diǎn)都符合HWE遺傳平衡(P>0.05)，而對(duì)照組中的3個(gè)位點(diǎn)偏離了HWE遺傳平衡(P<0.05)。

2.3 HLA-A等位基因頻率比較

ESRD組檢出29個(gè)HLA-A等位基因，頻率在前5位的基因分別是A*11:01(34.86%)、A*24:02(14.45%)、A*02:03(10.73%)、A*02:07(9.95%)和A*33:03(9.17%)。對(duì)照組基因頻率最高的也是這5個(gè)基因，只是頻率與ESRD組不同。與對(duì)照組相比，ESRD組A*11:01基因和A*02:01基因頻率高于對(duì)照組(P<0.001)，A*11:02基因、A*30:01基因和A*32:01基因頻率低于對(duì)照組(P<0.05)，具體見(jiàn)表1。

表1 ESRD組和對(duì)照組HLA-A等位基因頻率的比較Table 1 Comparison of HLA-A allele frequency between ESRD group and control group

2.4 HLA-B等位基因頻率比較

ESRD組檢出57個(gè)HLA-B等位基因，頻率在前5位的基因分別是B*46:01(13.32%)、B*40:01(12.80%)、B*15:02(11.42%)、B*13:01(10.64%)和B*58:01(8.65%)。對(duì)照組基因頻率最高的也是這5個(gè)基因，但頻率不同。與對(duì)照組相比，ESRD組B*13:01基因頻率高于對(duì)照組(P<0.05)，B*13:02基因和B*07:02基因頻率低于對(duì)照組(P<0.05)，具體見(jiàn)表2。

表2 ESRD組和對(duì)照組HLA-B等位基因頻率的比較Table 2 Comparison of HLA-B allele frequency between ESRD group and control group

續(xù)表Continued table

2.5 HLA-DRB1等位基因頻率比較

ESRD組檢出34個(gè)HLA-DRB1等位基因，頻率在前5位的基因分別是DRB1*15:01(12.02%)、DRB1*12:02(11.25%)、DRB1*16:02(9.52%)、DRB1*09:01(8.82%)和DRB1*04:05(8.39%)。對(duì)照組基因頻率最高的5個(gè)基因有3個(gè)與ESRD組相同。與對(duì)照組相比，ESRD組DRB1*12:02、DRB1*04:05、DRB1*14:54和DRB1*11:01基因頻率高于對(duì)照組(P<0.05)，DRB1*07:01和DRB1*13:02基因頻率低于對(duì)照組(P<0.05)，具體見(jiàn)表3。

表3 ESRD組和對(duì)照組HLA-DRB1等位基因頻率的比較Table 3 Comparison of HLA-DRB1 allele frequency between ESRD group and control group

2.6 三位點(diǎn)單倍型頻率的比較

Arlequin軟件分析顯示，ESRD組總共有489個(gè)三位點(diǎn)單倍型，只有23.45%的單倍型頻率大于1%，最常見(jiàn)的單倍型是A*33:03-B*58:01-DRB1*03:01，這也是對(duì)照組最常見(jiàn)的單倍型。兩組頻率前20位的三位點(diǎn)單倍型頻率相比，A*11:01-B*15:02-DRB1*12:02、A*11:01-B*15:02-DRB1*15:01和A*11:01-B*40:01-DRB1*04:05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，具體見(jiàn)表4。

表4 ESRD組前20位的三位點(diǎn)單倍型頻率與對(duì)照組的比較Table 4 Comparison of three-locus haplotype frequencies at the top 20 sites in the ESRD group with those in the control group

2.7 兩位點(diǎn)單倍型頻率的比較

Arlequin軟件分析顯示，ESRD組分別得到了216，274和188個(gè)兩位點(diǎn)單倍型，其頻率低于1%的分別占總頻率的40.42%、52.81%和39.59%。各頻率前20位的兩位點(diǎn)單倍型見(jiàn)表5，頻率最高的分別是A*11:01-B*15:02(7.72%)、B*58:01-DRB1*03:01(6.39%)和A*11:01-DRB1*12:02(5.46%)。ESRD組和對(duì)照組的兩位點(diǎn)單倍型頻率比較，A*11:01-B*55:02、B*15:02-DRB1*12:02、B*40:01-DRB1*11:01、B*46:01-DRB1*14:01、A*11:01-DRB1*04:05和A*11:01-DRB1*11:01有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表5 ESRD組前20位的兩位點(diǎn)單倍型頻率與對(duì)照組的比較Table 5 Comparison of two-locus haplotype frequencies at the top 20 sites in the ESRD group with those in the control group

續(xù)表Continued table

3 討論

HLA等位基因的多態(tài)性可以體現(xiàn)在地區(qū)和人種的差異上[3,4]，而且HLA部分等位基因和疾病具有遺傳相關(guān)性[1,6]。目前疾病與HLA相關(guān)性的研究，是通過(guò)對(duì)比某種疾病的患者和健康人群一些HLA特定等位基因及單倍型等的頻率，經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)分析，判別該基因與疾病的易感性或保護(hù)性。前期研究發(fā)現(xiàn)，影響ESRD患者的重要分子之一可能是HLA，因?yàn)镠LA部分等位基因與腎臟疾病的移植免疫密切相關(guān)[8,9]。廣西漢族的人口目前仍然位居廣西首位，因此，探究廣西漢族ESRD患者HLA等位基因的分布頻率和特點(diǎn)，并和廣西健康漢族人群作對(duì)比分析，對(duì)ESRD患者的診斷、預(yù)后及治療可能會(huì)有較深的基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用價(jià)值。

本研究首先對(duì)廣西漢族ESRD患者進(jìn)行了HLA-A、B和DRB1位點(diǎn)的Ewens-Watterson檢驗(yàn)和HWE檢驗(yàn)。Ewens-Watterson檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，廣西漢族ESRD患者HLA-A、B和DRB1位點(diǎn)的數(shù)據(jù)均符合中性選擇，反映出ESRD患者HLA的多態(tài)性主要是由基因突變和漂移造成的；HWE檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，廣西漢族ESRD患者的3個(gè)位點(diǎn)都符合HWE遺傳平衡，反映出ESRD患者在自然選擇、自由婚配和沒(méi)有新的突變時(shí)，HLA等位基因的頻率基本沒(méi)有變化[15]，符合遺傳學(xué)的基本規(guī)律。

HLA等位基因和ESRD患者的關(guān)聯(lián)性研究很多，但目前大部分研究是以HLA低分辨方法進(jìn)行。南京醫(yī)科大第一附屬醫(yī)院研究發(fā)現(xiàn)，HLA-A*11:01、A*31:01、B*15:01、B*55:02、B*39:05、DRB1*03:01、DRB1*04:03、DRB1*04:04、DRB1*04:05、DRB1*11:01和DRB1*12:02是江蘇漢族ESRD患者的易感基因，而DRB1*15:01可能是該類(lèi)患者的保護(hù)基因[10]；HLA-A*24和B*35是印度尼西亞人ESRD患者的保護(hù)基因[16]；B*50是巴基斯坦人ESRD患者的易感基因，HLA-B*40、DRB1*13和DRB1*12是該類(lèi)患者的保護(hù)基因[17]；HLA-DRB1*15是重慶地區(qū)慢性腎功能衰竭患者的易感基因[18]；HLA-DRB1*04、DRB1*12和DRB1*14是河北漢族ESRD患者的易感基因,而DRB1*09是該類(lèi)患者的保護(hù)基因[19]；HLA-B*56和DRB1*4可能是廣西壯族慢性腎衰竭患者的易感基因，HLA-A*26、B*62和DRB1*08可能是該類(lèi)患者的保護(hù)基因[20]；廣州南方醫(yī)院移植中心發(fā)現(xiàn)，HLA-A*24、B*54、B*55、B*60和DRB1*04是廣東地區(qū)ESRD患者的易感基因[21]；HLA-B*15和B*18是沙特阿拉伯ESRD患者的易感基因，HLA-A*26、B*39和B*50是該類(lèi)患者的保護(hù)基因[22]。上述結(jié)果并不完全一致，是否與人群及樣本量大小相關(guān)，需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

廣西漢族ESRD患者共發(fā)現(xiàn)HLA-A等位基因29個(gè)，B等位基因57個(gè)和DRB1等位基因34個(gè)。其中A*11:01(34.86%)、A*24:02(14.45%)、A*02:03(10.73%)、B*46:01(13.32%)、B*40:01(12.80%)、B*15:02(11.42%)、B*13:01(10.64%)、DRB1*15:01(12.02%)和DRB1*12:02(11.25%)等9個(gè)基因的頻率都大于10%，且這些高頻率的等位基因?qū)τ趶V西漢族正常人也都屬于高頻率，因此具有這些等位基因的患者更容易找到合適的移植供體。但也發(fā)現(xiàn)，HLA-A*11:01、DRB1*04:05和DRB1*11:01是廣西漢族ESRD患者的3個(gè)易感基因，這與江蘇漢族ESRD患者的易感基因相同[10],同時(shí)，DRB1*04也是廣東人ESRD患者的易感基因[21],DRB1*11也是臺(tái)灣ESRD患者的易感基因[23]；DRB1*12:02是廣西漢族ESRD患者的易感基因之一，而DRB1*12也是大連漢族ESRD患者的易感基因[11]。文獻(xiàn)報(bào)道，HLA-A和HLA-C位點(diǎn)與移植后受者存活率，以及急慢性排斥反應(yīng)的發(fā)生具有相關(guān)性[24]，在廣西漢族ESRD患者中檢出了2個(gè)HLA-A易感基因(A*11:01和A*02:01)和3個(gè)保護(hù)基因(A*11:02、A*30:01和A*32:01)，這5個(gè)基因是否與受者存活率及排斥反應(yīng)相關(guān)，需要更多臨床移植后的數(shù)據(jù)進(jìn)行驗(yàn)證。

許多疾病與HLA的連鎖不平衡也有相關(guān)性[10,25]，目前常用單倍型來(lái)反映HLA的連鎖不平衡。本研究發(fā)現(xiàn)，廣西漢族ESRD患者頻率最高的三位點(diǎn)單倍型是A*33:03-B*58:01-DRB1*03:01(5.09%)，這也是廣西漢族健康人群及廣西壯族健康人群頻率最高的單倍型[4,13]，因此具有該單倍型的患者，在廣西相對(duì)比較容易找到合適的移植供體。與對(duì)照組相比，廣西漢族ESRD患者人群有3條三位點(diǎn)單倍型(A*11:01-B*15:02-DRB1*12:02、A*11:01-B*15:02-DRB1*15:01和A*11:01-B*40:01-DRB1*04:05)和6條兩位點(diǎn)單倍型(A*11:01-B*55:02、B*15:02-DRB1*12:02、B*40:01-DRB1*11:01、B*46:01-DRB1*14:01、A*11:01-DRB1*04:05和A*11:01-DRB1*11:01)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這些單倍型可以認(rèn)為是廣西漢族ESRD患者的易感單倍型，但也就意味著帶有該單倍型的ESRD患者在廣西相對(duì)比較難找到匹配的供體。相對(duì)于HLA位點(diǎn)的錯(cuò)配，受者的長(zhǎng)期存活率受單倍型的錯(cuò)配影響更大，說(shuō)明HLA等位基因也許不是單獨(dú)發(fā)揮作用，推測(cè)是等位基因在單倍型里相互作用后才整體發(fā)揮作用[26,27]，需要后續(xù)進(jìn)一步研究。

本研究的廣西漢族ESRD患者只有部分易感基因與文獻(xiàn)報(bào)道一致，其他易感或保護(hù)基因則與文獻(xiàn)報(bào)道差別較大。分析原因在于，首先，HLA系統(tǒng)的遺傳多態(tài)性及連鎖不平衡，導(dǎo)致其等位基因在地域和民族上區(qū)別較大[3,4]；其次，不同研究標(biāo)本的抽樣誤差和統(tǒng)計(jì)方法對(duì)結(jié)果也有影響[11,28]；再次，目前進(jìn)行的ESRD與HLA相關(guān)性的研究，絕大部分采用HLA低分辨方法，這容易導(dǎo)致HLA抗原和等位基因的漏檢；或者是不同ESRD患者的原發(fā)基礎(chǔ)疾病不同或環(huán)境的誘發(fā)因素導(dǎo)致[11]。HLA與ESRD患者的相關(guān)性機(jī)理，用以前常見(jiàn)的連鎖不平衡學(xué)說(shuō)、受體學(xué)說(shuō)或免疫逃逸等學(xué)說(shuō)[29]來(lái)解釋?zhuān)贾荒軓牟煌膫?cè)面說(shuō)明兩者部分的關(guān)系，并未完全闡明其相關(guān)機(jī)制。目前有學(xué)者認(rèn)為，腎臟疾病可能由淋巴器官或腎臟中HLA的作用引起，腎細(xì)胞或腎單核吞噬細(xì)胞表達(dá)的不同HLA同種異體，可能在機(jī)制上與腎臟疾病有關(guān)[30]，需要后續(xù)進(jìn)一步研究。

本移植中心的HLA實(shí)驗(yàn)室從2019年4月至2021年12月已經(jīng)完成HLA分型檢測(cè)的標(biāo)本約2 000份，其中90%以上是ESRD患者標(biāo)本。在有大量的臨床標(biāo)本來(lái)源的前提下，需要對(duì)ESRD患者的病因進(jìn)行詳細(xì)分類(lèi)，并進(jìn)行下一步研究。隨著HLA二代測(cè)序方法在各個(gè)移植實(shí)驗(yàn)室的應(yīng)用逐漸開(kāi)展[31]，以及全基因組關(guān)聯(lián)分析(Genome-wide Association Study,GWAS)方法在疾病易感相關(guān)性研究方面的應(yīng)用[32,33]，是否可以將這2種方法應(yīng)用于廣西漢族ESRD患者與HLA多態(tài)性的關(guān)聯(lián)性分析，需要更多大樣本數(shù)據(jù)的收集、病因分類(lèi)等進(jìn)一步綜合研究。

4 結(jié)論

本研究首次對(duì)HLA高分辨等位基因多態(tài)性及單倍體與廣西漢族終末期腎病易感性的相關(guān)性進(jìn)行了探討，發(fā)現(xiàn)廣西漢族ESRD患者HLA-A、B和DRB1高頻率的等位基因和單倍型與廣西漢族健康人基本相同，其中HLA-A*11:01、A*02:01、B*13:01、DRB1*12:02、DRB1*04:05、DRB1*14:54和DRB1*11:01可能與廣西漢族ESRD高發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)；HLA-A*11:02、A*30:01、A*32:01、B*13:02、B*07:02、DRB1*07:01和DRB1*13:02可能與廣西漢族ESRD低發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。研究結(jié)果為廣西漢族ESRD患者尋找臨床移植供體時(shí)提供了HLA等位基因的數(shù)據(jù)參考，同時(shí)為后續(xù)HLA與ESRD患者發(fā)病的機(jī)理研究提供了參考，也為臨床ESRD患者的早期基因診斷和防治研究提供了有益的探索。