譚 煒，張 雷，張咪咪，安 虹

1.安徽省食品藥品檢驗(yàn)研究院，安徽合肥 230051；2.國家農(nóng)副加工食品監(jiān)督檢驗(yàn)中心，安徽合肥 230051

真菌毒素是真菌在生長繁殖過程中產(chǎn)生的一系列次級代謝產(chǎn)物，目前在自然界中已發(fā)現(xiàn)的真菌毒素有400多種[1]。其中大部分真菌毒素具有致畸、致癌、致突變、肝腎毒性、免疫毒性和神經(jīng)毒性等危害，嚴(yán)重危害人類健康[2]。嘔吐毒素（DON）、黃曲霉毒素M1（AFT-M1）、黃曲霉毒素B1（AFT-B1）、赭曲霉毒素A（OTA）、玉米赤霉烯酮(ZON)等，在食品領(lǐng)域報(bào)道較為常見[2-5]。目前，國內(nèi)外對真菌毒素的檢測多采用薄層法、酶聯(lián)免疫法、氣質(zhì)聯(lián)用法、液相法、液質(zhì)聯(lián)用法等[6]。然而，薄層法雖然快捷，但是重復(fù)性差、精度不高；酶聯(lián)免疫法特異性強(qiáng)，但假陽性率高；氣質(zhì)聯(lián)用法前處理繁瑣；液相法穩(wěn)定、靈敏，但無法同時(shí)分析檢測同系物或異構(gòu)體。液質(zhì)聯(lián)用法，選擇性好、靈敏度高、適用性強(qiáng)且能多組分同時(shí)檢測。已被廣泛應(yīng)用于真菌毒素檢測，成為食品檢測領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[7]。

鮮奶中的真菌毒素源自奶牛的飼料，污染飼料的真菌種類繁多，導(dǎo)致牛奶中往往有多種真菌毒素同時(shí)存在[8]。本研究旨在建立一種液相色譜串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜法同時(shí)檢測牛奶中5種黃曲霉毒素的方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器

超高效液相色譜儀LC-30A串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀LCMS-8050，日本島津公司；Reax top渦旋混合器，德國Heidolph集團(tuán)；KDC-160HR高速冷凍離心機(jī)，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；N-EVAP-34型氮吹儀，美國Organomation公司；PURELAB flex 3超純水機(jī)，法國威立雅公司；S300H超聲波清洗器，德國Elma公司。

1.2 分析條件

液相色譜條件：LC-30A系統(tǒng)；Waters ACQUITY BEH C18（1.7 μm，100 mm×2.1 mm)；流動(dòng)相：A相為0.1%甲酸水溶液，B相為甲醇；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣體積：10 μL；柱溫40℃；洗脫方式：梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫時(shí)間程序

質(zhì)譜條件：分析儀器：LCMS-8050，離子源：ESI，正離子掃描，離子源接口電壓：4.5 kV，霧化氣：氮?dú)?.0 L/min，干燥氣：氮?dú)?5 L/min，碰撞氣：氬氣，脫溶劑管溫度：250℃， 加熱模塊溫度：400℃，掃描模式：多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)，駐留時(shí)間：30 ms，延遲時(shí)間：3 ms。MRM參數(shù)見表2。

表2 MRM參數(shù)

1.3 樣品制備標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

取適量單標(biāo)儲(chǔ)備液，用乙腈配制成10 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用水逐級稀釋成濃度為20 ng/mL、10 ng/mL、5 ng/mL、2 ng/mL、1 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.4 樣品前處理

1.4.1 提取取5 g(精密稱定至0.01 g)樣品于20 mL乙腈/水(85/15，v/v)中渦旋2 min，超聲45 min，8 000 r/min離心10 min后，取上清液2 mL于25 mL容量瓶，用1%吐溫-20 PBS稀釋并定容后,取上清液于50 mL量瓶中,以乙腈/水(70/30，v/v)稀釋定容至50 mL，備用。

1.4.2 凈化將提取的液體過免疫親和柱，用10 mL PBS淋洗柱子，吹干，再用5 mL的甲醇洗脫，吹干，收集洗脫液，并用氮?dú)獯蹈桑?.0 mL乙腈/水(20/80，v/v)溶液溶解殘留物，過0.22 pm濾膜并收集濾液，進(jìn)行LCMS/MS分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)樣品的MRM色譜圖

10 ng/mL混合標(biāo)準(zhǔn)樣品的MRM色譜見圖1。

圖1 混合標(biāo)準(zhǔn)樣品的MRM色譜圖

2.2 線性關(guān)系、檢出限及定量限考察

將 濃 度 為1 ng/mL、2 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL的 混 合標(biāo)準(zhǔn)工作液，按分析條件進(jìn)行測定，以濃度比為橫坐標(biāo)，以峰面積比為縱坐標(biāo)，外標(biāo)法制作校準(zhǔn)曲線；通過在不含真菌毒素的鮮奶基質(zhì)中加入相應(yīng)量的真菌毒素混合標(biāo)準(zhǔn)品，配制基質(zhì)匹配的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 μg/L、2 μg/L、5 μg/L、10 μg/L、20 μg/L）， 按分析條件進(jìn)行測定，以濃度比為橫坐標(biāo)，峰面積比為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸分析。方法的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限、定量限見表3。

表3 線性關(guān)系、檢出限及定量限

2.3 回收率和精密度實(shí)驗(yàn)

對1 ng/mL、5 ng/mL和10 ng/mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)進(jìn)行6次進(jìn)樣，3個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)品的回收率范圍在81.0%~115.8%，表明該方法準(zhǔn)確、可靠；相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.5%~8.8%之間，表明方法精密度良好。

2.4 實(shí)際樣品測定

取25批鮮奶樣品，按照分析條件和樣品前處理方法同時(shí)檢測其中的5種真菌毒素含量，在25批樣品中共有3組檢出AFT-M1，含量分別為0.18 μg/kg、0.21 μg/kg、0.25 μg/kg，其 他毒素含量均低于檢出限。表明該方法快捷、有效，適用于鮮乳中5種真菌毒素的高效檢測。

3 結(jié)束語

本研究建立了一種超高效液相色譜串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀的方法能同時(shí)高效測定鮮乳中5種常見的真菌毒素。5種毒素在1~20 ng/mL濃度范圍內(nèi)線性良好；低、中、高3個(gè)濃度加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別在81.0%~115.8%和1.5%~8.8%之 間，具有較高的準(zhǔn)確性和精確度，且無需內(nèi)標(biāo)，前處理操作簡單、快捷。

表4 3個(gè)濃度水平的加標(biāo)回收率和精密度實(shí)驗(yàn)(n=6)

表5 實(shí)際樣品測定結(jié)果