曾建剛 ,郭琦 ,沈中華 ,陳杰 ,劉莉?

(1.德清縣農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心,浙江 德清 313200;2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 水生生物研究所,浙江 杭州 310021)

蝦血細(xì)胞虹彩病毒 (Shrimp hemocyte iridescent virus,SHIV) 又稱十足目虹彩病毒1(Decapod iridescent virus 1,DIV1),是雙鏈線性DNA 病毒,基因組大小約為166 kb,其病毒粒子呈二十面體,大小約為150 nm[1-3]。SHIV 最早于2014 年在浙江某凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖場(chǎng)中被發(fā)現(xiàn),并鑒定和命名[1]。目前已經(jīng)證實(shí),SHIV 可以感染凡納濱對(duì)蝦、中國(guó)明對(duì)蝦、脊尾白蝦、羅氏沼蝦、克氏原螯蝦和日本沼蝦,感染SHIV 的凡納濱對(duì)蝦會(huì)出現(xiàn)厭食、胃腸道清空、肝胰腺顏色變淺和死亡的臨床癥狀[2-5]。

日本沼蝦 (Macrobrachiumnipponense) 俗稱河蝦或青蝦,是重要的淡水養(yǎng)殖品種,在眾多淡水養(yǎng)殖蝦種類中占有重要地位。德清被譽(yù)為 “青蝦之鄉(xiāng)”,日本沼蝦是其重要的特色養(yǎng)殖品種,是農(nóng)民養(yǎng)殖增收的主要途徑[6]。近年在日本沼蝦的養(yǎng)殖中出現(xiàn)較為普遍的產(chǎn)量不如預(yù)期甚至育苗過程也不順利的現(xiàn)象,其中原因尚無報(bào)道。SHIV 在多種蝦中被檢測(cè)到,而對(duì)日本沼蝦養(yǎng)殖的危害未見相關(guān)研究。鑒于此,本研究對(duì)德清縣日本沼蝦養(yǎng)殖塘中SHIV 的流行情況進(jìn)行監(jiān)測(cè),分析了蝦虹彩病毒感染青蝦的病理特征,相關(guān)結(jié)果為后續(xù)探討SHIV 對(duì)日本沼蝦養(yǎng)殖的影響奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2020 年在德清縣設(shè)2 個(gè)采樣點(diǎn),分別位于下渚湖街道和鐘管鎮(zhèn),于7—10 月共采樣4 次,每次采集30 只以上青蝦。2021 年在德清縣設(shè)12 個(gè)采樣點(diǎn),分別位于下渚湖、鐘管、新市、雷甸、新安和洛舍6 個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)或街道,于6、7 月分別進(jìn)行采樣,每次各點(diǎn)采集30 只以上青蝦。

1.2 主要試劑和儀器

DNA 提取試劑盒QIAamp DNA Mini Kit (德國(guó)QIAGEN 公 司);PCR 反應(yīng)試劑 (New England Biolabs 北京有限公司);引物由北京擎科生物科技有限公司合成。多樣品組織研磨儀 (上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司);PCR 儀 (北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司)。

1.3 樣品處理與DNA 提取

每個(gè)養(yǎng)殖戶取20 只以上的活蝦,解剖取每只蝦的肝胰腺至獨(dú)立的離心管中研磨成組織勻漿,或根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要混合解剖所得的肝胰腺,再研磨成組織勻漿,置于-40 ℃下保存。每個(gè)樣品取25 mg,利用基因組DNA 提取試劑盒提取DNA,提取方法參照試劑盒操作手冊(cè)。同時(shí)取樣用于單只檢測(cè)的蝦肝胰腺,采用4%多聚甲醛和2.5%戊二醛固定,用于染色和電鏡觀察。

1.4 PCR 檢測(cè)

以1.3 中提取的DNA 為模板,以SHIV-F1(5′-GGGCGGGAGATGGTGTTAGAT-3′) 和SHIV-R1(5′-TCGTTTCGGTACGAAGATGTA-3′) 進(jìn)行巢式PCR 第一步擴(kuò)增,反應(yīng)體系為 2 × Master Mix 12.5 μL,10 μmol·L-1引物各0.5 μL,模板DNA 2.5 μL,ddH2O 9 μL。PCR 反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性3 min→95 ℃變性30 s→59 ℃復(fù)性30 s→72 ℃延伸30 s,共35 個(gè)循環(huán),最后72 ℃延伸2 min。以第一步 PCR 的產(chǎn)物為模板,以SHIV-F2 (5′-CGGGAAACGATTCGTATTGGG-3′) 和SHIV-R2(5′-TTGCTTGATCGGCATCCTTGA-3′) 進(jìn)行巢式PCR 第二步的擴(kuò)增,反應(yīng)體系為2×Master Mix 12.5 μL,10 μM 引物各0.5 μL,模板DNA 1 μL,ddH2O 10.5 μL。PCR 反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性3 min→95 ℃變性30 s→59 ℃復(fù)性30 s→72 ℃延伸20 s,共35 個(gè)循環(huán),最后72 ℃延伸2 min,反應(yīng)完畢后進(jìn)行瓊脂糖電泳分析。

1.5 肝胰腺的石蠟切片制作及HE 染色

將肝胰腺切割成1 mm 見方的組織塊,在4%多聚甲醛中進(jìn)行固定,使用不同濃度的乙醇和二甲苯對(duì)固定好的組織依次進(jìn)行脫水和透明,浸蠟包埋后進(jìn)行切片,將石蠟切片展平烘干后使用二甲苯脫蠟,并用不同濃度的乙醇逐級(jí)復(fù)水。分別用蘇木素(Hematoxylin) 和伊紅 (Eosin) 進(jìn)行染色,隨后將切片依次放入無水乙醇和二甲苯中進(jìn)行脫水及透明,用中性樹膠封片,通過光學(xué)顯微鏡觀察,并采集圖像進(jìn)行分析。

1.6 透射電鏡觀察

將肝胰腺切割成1 mm 見方的組織塊,在2.5%戊二醛固定液中于4 ℃固定過夜;棄去戊二醛固定液,加入足量磷酸緩沖液漂洗3 次,加入0.1 mol·L-1四氧化鋨溶液固定2 h;棄去鋨酸固定液,加入足量磷酸緩沖液漂洗3 次后,樣品依次在50%、70%、80%、90%、95%的乙醇中進(jìn)行梯度脫水,用無水乙醇脫水處理3 次,再在丙酮中脫水3 次。樣品在丙酮與包埋劑1∶1 配置液中滲透1 h,在丙酮與包埋劑1∶3 配置液中滲透3 h,最后在純包埋劑中滲透過夜。將樣品加入純包埋劑中,于70 ℃烘箱中加熱聚合48 h。取出聚合完成的樣品切片,用銅網(wǎng)吸附后置于透射電鏡下觀察,并采集圖像。

2 結(jié)果與分析

2.1 日本沼蝦中SHIV 的PCR 檢測(cè)結(jié)果

2020 年在德清縣2 個(gè)日本沼蝦養(yǎng)殖戶進(jìn)行為期4 個(gè)月的病原跟蹤監(jiān)測(cè),結(jié)果表明,日本沼蝦中存在感染SHIV 的情況。表1 顯示,在SHIV DNA的巢式PCR 檢測(cè)中,7 和10 月養(yǎng)殖戶A 和B 的日本沼蝦樣品的SHIV 檢測(cè)結(jié)果均呈陽性;8 和9 月分別在養(yǎng)殖戶A 和B 的日本沼蝦樣品中檢測(cè)到SHIV 的特異性核酸片段。2021 年在對(duì)德清地區(qū)6個(gè)行政村12 個(gè)養(yǎng)殖戶的日本沼蝦的檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)(表2),有6 個(gè)養(yǎng)殖戶的日本沼蝦的SHIV 呈陽性。進(jìn)一步選取其中3 個(gè)養(yǎng)殖戶再次采樣,分別提取單只蝦的DNA 進(jìn)行巢式PCR 檢測(cè),結(jié)果顯示,日本沼蝦SHIV 的感染率在10%～20%。

表1 不同采樣時(shí)間下日本沼蝦中SHIV 的PCR 檢測(cè)結(jié)果

表2 不同養(yǎng)殖戶的日本沼蝦中的SHIV 的PCR 檢測(cè)結(jié)果

2.2 SHIV 對(duì)日本沼蝦肝胰腺組織結(jié)構(gòu)的影響

肝胰腺的HE 染色結(jié)果顯示,SHIV 檢測(cè)為陰性的日本沼蝦肝胰腺的細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常,分布較為均勻;SHIV 檢測(cè)為陽性的日本沼蝦肝胰腺中分泌細(xì)胞和內(nèi)部轉(zhuǎn)運(yùn)泡數(shù)量增加,儲(chǔ)存細(xì)胞數(shù)量有所減少,管腔體積變大,存在核固縮現(xiàn)象 (圖1)。

圖1 感染SHIV 對(duì)日本沼蝦肝胰腺顯微結(jié)構(gòu)的影響

2.3 日本沼蝦肝胰腺組織中SHIV 的電鏡觀察

分別取SHIV 的巢式PCR 結(jié)果為陰性和陽性的日本沼蝦肝胰腺包埋并切片后,在透射電鏡下進(jìn)行觀察。SHIV 為陰性的肝胰腺細(xì)胞中未觀察到病毒粒子 (圖2 中A、B)。在SHIV 檢測(cè)為陽性的日本沼蝦肝胰腺中,觀察到直徑約為150 nm 類似病毒粒子的結(jié)構(gòu),顯示SHIV 能夠感染日本沼蝦的肝胰腺,并進(jìn)入其細(xì)胞質(zhì) (圖2 中C～F)。

圖2 日本沼蝦肝胰腺肝小管上皮細(xì)胞內(nèi)SHIV 的病毒粒子

3 討論

蝦血細(xì)胞虹彩病毒發(fā)現(xiàn)至今未滿10 a,由全國(guó)的SHIV 監(jiān)測(cè)結(jié)果可知,目前已在浙江、廣東、河北、江蘇等省市及沿海地區(qū)的對(duì)蝦養(yǎng)殖場(chǎng)中檢測(cè)到SHIV[1,7]。浙江德清縣被譽(yù)為 “青蝦之鄉(xiāng)”,日本沼蝦是該地區(qū)主要的養(yǎng)殖品種。2020 和2021 年的調(diào)查結(jié)果顯示,SHIV 在德清地區(qū)的日本沼蝦中普遍存在。其中,2020 年的養(yǎng)殖戶A 和2021 年的養(yǎng)殖戶1 為同一家,其SHIV 的檢測(cè)結(jié)果在跟蹤調(diào)查中均為陽性,顯示SHIV 可以一直存在于養(yǎng)殖塘中,可能對(duì)日本沼蝦的養(yǎng)殖產(chǎn)生威脅。德清縣的青蝦養(yǎng)殖一般采用人工培育幼蝦的方式,在5 月初選擇懷卵量大且較為健壯的親蝦至繁殖池塘中,待幼蝦孵出20 d 后,再捕出放養(yǎng),在之后的1 a 內(nèi)捕大留小,產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)利潤(rùn)較為可觀[8]。然而這種模式缺乏對(duì)親蝦的病原篩查,養(yǎng)殖時(shí)間較長(zhǎng),容易造成病毒傳播。本研究在2021 年5—6 月及2020 年7—10 月的病原監(jiān)測(cè)中均檢測(cè)到SHIV 的存在,提示該模式可能存在使病毒擴(kuò)散的風(fēng)險(xiǎn)。

目前對(duì)SHIV 的研究主要集中在凡納濱對(duì)蝦上,在患病蝦組織切片中可以普遍觀察得到嗜酸性包涵體和核固縮現(xiàn)象。透射電鏡觀察顯示,患病蝦的肝胰腺、造血組織、肌肉、步足和游泳足中均存在SHIV 病毒粒子,其大小約為150 nm,呈典型的二十面體形狀[1]。通過投喂和反向灌腸SHIV,可使凡納濱對(duì)蝦累積死亡率高達(dá)100%[1];通過注射感染可使脊尾白蝦的累積死亡率達(dá)到76%,通過投喂感染的死亡率也可達(dá)到50%[5],因此,SHIV已成為我國(guó)對(duì)蝦養(yǎng)殖的重大威脅之一。本研究在通過巢式PCR 檢測(cè)到SHIV 的日本沼蝦肝胰腺組織切片中觀察到核固縮現(xiàn)象,透射電鏡觀察顯示,SHIV 陽性蝦的肝胰腺中存在類似SHIV 病毒粒子的結(jié)構(gòu),大小約為150 nm,主要存在于細(xì)胞質(zhì)中。有研究表明,日本沼蝦感染SHIV 后的病毒載量顯著低于羅氏沼蝦和凡納濱對(duì)蝦,這可能是SHIV 對(duì)日本沼蝦的影響較為有限的原因[4]。本研究?jī)H對(duì)采樣的蝦進(jìn)行HE 染色和透射電鏡觀察,初步探討了SHIV 對(duì)日本沼蝦的影響,要明確SHIV 與日本沼蝦患病的關(guān)系,還需進(jìn)行更深入的研究。

日本沼蝦中常見的病害主要有固著類纖毛蟲病、霉菌病、絲狀細(xì)菌病、紅體病、黑鰓病等[9]。感染SHIV 的日本沼蝦的肝胰腺存在一定程度的病變,可能會(huì)影響其正常代謝功能,從而引起感染SHIV 的日本沼蝦對(duì)其他病原的抵抗力降低,導(dǎo)致更易受寄生蟲或細(xì)菌性病害的影響。蝦類病害的發(fā)生與養(yǎng)殖環(huán)境和氣溫變化有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn),水質(zhì)中的總氮和水溫對(duì)SHIV 在凡納濱對(duì)蝦中的發(fā)病情況具有較大的影響[10]。因此,注意日本沼蝦的親蝦育種過程中的病害監(jiān)測(cè)工作,加強(qiáng)青蝦養(yǎng)殖過程中的水質(zhì)條件管理,重視對(duì)病害的預(yù)防,能有效降低SHIV 對(duì)日本沼蝦養(yǎng)殖的影響。