李 鑫 楊 磊 葉 進(jìn) 叢 佳 魏立強(qiáng) 姚 娜 楊 晶 崔雪瑩 王景文

黏膜相關(guān)淋巴組織邊緣區(qū)淋巴瘤(marginal zone mucosa-associated lymphoid tissue lymphoma， MALT)是發(fā)生于B淋巴細(xì)胞的一類惰性淋巴瘤，好發(fā)于結(jié)外，包括胃腸道、眼附屬器、肺等組織器官的黏膜相關(guān)淋巴組織[1]。原發(fā)眼附屬器MALT淋巴瘤(ocular adnexal MALT，OAML)定義為原發(fā)于眼附屬器的MALT淋巴瘤，多數(shù)表現(xiàn)為眼附屬器局灶性病變，包括眼眶、結(jié)膜、眼瞼、淚腺等部位，僅少數(shù)發(fā)生全身多部位受累[1，2]。但因?yàn)椴≡铍[匿，往往被患者忽視，延誤病情，影響疾病的預(yù)后。

調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell，Treg)是抑制性T細(xì)胞的一種功能亞群，約占外周血CD4+T細(xì)胞數(shù)的1%～10%，F(xiàn)oxp3是Treg細(xì)胞的標(biāo)志[3，4]。Treg細(xì)胞具有免疫調(diào)節(jié)和免疫抑制兩大功能，在實(shí)體瘤的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，因此，對(duì)腫瘤的臨床進(jìn)程、預(yù)后具有一定的預(yù)測(cè)作用[5，6]。然而，Treg細(xì)胞在血液系統(tǒng)腫瘤中的預(yù)測(cè)作用仍存在爭(zhēng)議。目前，國(guó)內(nèi)外研究認(rèn)為彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤等侵襲性淋巴瘤患者外周血中Treg細(xì)胞數(shù)量明顯高于正常人[7～11]。但是，關(guān)于MALT淋巴瘤患者外周血Treg細(xì)胞的研究較少，尚無OAML的相關(guān)研究。本研究應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)OAML患者外周血Treg細(xì)胞計(jì)數(shù)，并分析其比例與臨床分期、預(yù)后等因素的相關(guān)性，擬為原發(fā)于眼附屬器MALT淋巴瘤患者的病情監(jiān)測(cè)、預(yù)后評(píng)估等提供新的血清學(xué)指標(biāo)。

對(duì)象與方法

1.研究對(duì)象：連續(xù)性收錄2015年12月～2020年10月在首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院診斷的OAML患者44例。入組標(biāo)準(zhǔn)：所有患者原發(fā)病灶均為眼附屬器，臨床上經(jīng)病理明確診斷為MALT淋巴瘤，伴或不伴眼附屬器以外部位累及。排除標(biāo)準(zhǔn)：①既往曾進(jìn)行針對(duì)MALT淋巴瘤的治療(除手術(shù)以外)；②確診前曾診斷其他惡性腫瘤；③確診前曾診斷自身免疫性疾病。所有病例經(jīng)眼部腫物切除或者活檢送檢病理，符合2016年WHO淋巴造血組織腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)。收集入組患者的全身體格檢查、血液生化指標(biāo)、影像學(xué)檢查等臨床資料，臨床分期采用Ann Arbor分期和眼附屬器淋巴瘤美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)(American Joint Committee on Cancer，AJCC)TNM分期，預(yù)后評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)采用淋巴瘤國(guó)際預(yù)后指標(biāo)(international prognostic index，IPI)評(píng)分和MALT 淋巴瘤國(guó)際預(yù)后指標(biāo)(MALT lymphoma international prognostic index，MALT-IPI)評(píng)分[12]。選取20名常規(guī)體檢未見異常的健康志愿者作為正常對(duì)照。本研究經(jīng)筆者醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理審批號(hào):TRECKY 2015-016)，所有入組患者均已簽署知情同意書。

2.主要試劑及儀器：?jiǎn)慰寺】贵w試劑盒:抗人CD4-FITC流式抗體、抗人CD25-PE-CyTM流式抗體、抗人Foxp3-APC流式抗體均為美國(guó)BD公司產(chǎn)品。裂解液、緩沖液和Foxp3破膜劑為美國(guó)Beckman Coulter公司產(chǎn)品。本研究使用的流式細(xì)胞儀為美國(guó)Beckman Coulter公司制造的FC500型流式細(xì)胞儀。

3.實(shí)驗(yàn)方法：抽取研究對(duì)象EDTA抗凝外周血2ml充分混勻備用。取10μl CD4-FITC及5μl CD25-PE-CyTM抗體加入100μl抗凝外周血中，渦旋振蕩混勻，避光孵育20min；加入Foxp3破膜劑A液1ml，渦旋振蕩混勻后避光20min，再加入Foxp3破膜劑B液1ml，300×g離心5min，棄上清，加入100μl Foxp3破膜劑B液重懸細(xì)胞；加入10μl Foxp3-APC，避光孵育30min，300×g離心5min洗滌1次，棄上清；加入緩沖液500μl，上機(jī)分析，記錄CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞占全部淋巴細(xì)胞的比例。

4.治療方案：根據(jù)眼部腫物部位及浸潤(rùn)程度，選擇腫物完全切除或者部分切除，一部分患者經(jīng)眼科手術(shù)完全切除腫物無殘留病灶，另一部分眼科術(shù)后仍有殘留病灶。存在殘留病灶患者根據(jù)病變累及狀況、治療意愿等因素選擇等待觀察或進(jìn)行治療，治療方案包括局部治療(單純放療)和系統(tǒng)性治療(單純化療、免疫化療、化療±放療、免疫化療±放療)。

5.療效評(píng)價(jià)：按照Lugano緩解標(biāo)準(zhǔn)分為完全緩解(complete remission，CR)、部分緩解(partial remission，PR)、病情進(jìn)展(progress disease，PD)和復(fù)發(fā)。在治療結(jié)束1個(gè)月及此后的每6個(gè)月進(jìn)行療效評(píng)價(jià)，包括全身體格檢查、血液相關(guān)指標(biāo)及MRI、PET/CT等影像學(xué)評(píng)估。

6.隨訪：采取門診檢查、住院復(fù)查或電話方式進(jìn)行隨訪。總生存(overall survival，OS)定義為確診時(shí)間至死亡時(shí)間或隨訪終點(diǎn)，無進(jìn)展生存(progression-free survival，PFS)定義為確診時(shí)間至病情進(jìn)展或復(fù)發(fā)時(shí)間。本研究隨訪終點(diǎn)為死亡或2022年3月,隨訪時(shí)間為17～75個(gè)月，中位隨訪時(shí)間為43個(gè)月。

結(jié) 果

1.臨床特征：入組44例患者，其中男性28例，女性16例，男女性別比為1.75，中位發(fā)病年齡為60(20～79)歲。所有病例中僅2例伴L(zhǎng)DH升高，3例伴B組癥狀。常見癥狀包括眼部異物感、眼瞼腫脹、無痛性腫塊、眼球突出、視力下降等，癥狀持續(xù)時(shí)間為1～120個(gè)月，中位時(shí)間為10個(gè)月。IPI評(píng)分和MALT-IPI評(píng)分低危、中危的患者分別為59.1%和52.3%、40.9%和38.6%，無IPI評(píng)分高危患者，MALT-IPI評(píng)分高?；颊哒?.1%。OAML患者中單眼受累29例(65.9%)，34.1%雙眼受累。眼部病變部位以眼眶(T2)最常見，共17例(38.6%)；單純累及結(jié)膜(T1)患者5例，占11.4%；9例T4患者中5例累及視神經(jīng)，2例累及局部皮膚或皮下軟組織，1例累及副鼻竇，1例累及鼻腔。13例患者發(fā)生眼外組織受累，累及部位包括淋巴結(jié)(n=8)、骨髓(n=4)、肺組織(n=3)、皮下軟組織(n=3)、胸壁(n=2)，詳見表1。

表1 44例OAML患者的臨床特征

2.OAML患者與正常對(duì)照之間外周血Treg細(xì)胞比例的比較：入組44例OAML患者外周血Treg細(xì)胞比例為7.63%±3.77%，20例正常對(duì)照外周血Treg細(xì)胞比例為6.09%±1.02%，兩者比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.015)。

3.不同累及部位OAML患者外周血Treg細(xì)胞比例的比較：44例患者根據(jù)病變累及部位進(jìn)行分組，各組患者外周血Treg細(xì)胞比例詳見表2。雙眼受累患者外周血Treg細(xì)胞比例為9.22%±5.23%，高于單眼受累患者(6.80%±2.47%)，但兩者比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.108)。病變局限于眼附屬器的OAML患者外周血Treg細(xì)胞水平為6.56%±2.42%，低于伴有眼外組織受累患者(10.16%±5.13%)，兩者比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.030)。骨髓受累患者外周血Treg細(xì)胞比例為15.43%±3.98%，明顯高于無骨髓受累患者(6.85%±2.75%)，兩者比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001),詳見表2。

表2 不同累及部位患者外周血Treg細(xì)胞比例的比較

4.外周血Treg細(xì)胞比例與臨床參數(shù)的相關(guān)性分析：44例OAML患者外周血Treg細(xì)胞比例與血清LDH水平、IPI評(píng)分、MALT-IPI評(píng)分均無相關(guān)性(rLDH=-0.149，P=0.334；rIPI=0.120，P=0.437；rMALT-IPI=0.048，P=0.756)。

5.外周血Treg細(xì)胞比例與預(yù)后的關(guān)系：截至2022年3月，44例患者中PD或復(fù)發(fā)8例，3年OS率、PFS率分別為100.0%、63.0%。取所有入組患者外周血Treg細(xì)胞比例的平均值7.63%為臨界值，將患者分為低Treg細(xì)胞組(28例)和高Treg細(xì)胞組(16例)，兩組患者的一般臨床資料匹配。低Treg細(xì)胞組中PD或復(fù)發(fā)3例，3年OS率、PFS率分別為100.0%、92.9%；高Treg細(xì)胞組中PD或復(fù)發(fā)3例，3年OS率、PFS率分別為100.0%、66.8%，兩者比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.155)，詳見圖1。

圖1 低Treg細(xì)胞組和高Treg細(xì)胞組PFS的比較

討 論

MALT淋巴瘤是一種來源于B淋巴細(xì)胞的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，以異質(zhì)性浸潤(rùn)為主要特征。臨床上常表現(xiàn)為隱匿性淋巴結(jié)外無痛性腫物，病程緩慢，疾病初期不容易被發(fā)現(xiàn)，往往因影響周圍組織或器官功能才就診[13]。原發(fā)于眼附屬器的MALT淋巴瘤患者早期多無明顯癥狀，隨著腫物逐漸增大而出現(xiàn)相應(yīng)癥狀，甚至影響眼部器官功能。眼部癥狀包括眼球突出、視力下降、頭痛等，病史可長(zhǎng)達(dá)數(shù)年。本研究中入組患者就診前眼部癥狀持續(xù)時(shí)間最長(zhǎng)可達(dá)10年。

CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞是一種特殊的CD4+T細(xì)胞亞群，它們通過抑制其他T細(xì)胞亞群的激活或增值，在調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，從而維持免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)[14]。Treg細(xì)胞不僅在自身免疫性疾病的發(fā)展中發(fā)揮重要作用，同時(shí)也抑制機(jī)體的細(xì)胞免疫功能，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體的抗腫瘤作用[15，16]。大量研究表明，在實(shí)體瘤和血液系統(tǒng)腫瘤中，外周血Treg細(xì)胞比例均明顯升高[17～19]。Rollison等[20]在一項(xiàng)關(guān)于皮膚鱗狀細(xì)胞癌的前瞻性研究中發(fā)現(xiàn)，外周血中Treg細(xì)胞的比例與腫瘤發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)正相關(guān)，外周血中Treg細(xì)胞高表達(dá)患者發(fā)生皮膚鱗狀細(xì)胞癌的可能性是表達(dá)較低患者的4倍。Chen等[8]研究了77例彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma，DLBCL)患者，發(fā)現(xiàn)其外周血Treg細(xì)胞比例明顯高于正常對(duì)照，因此推斷外周血中較高的Treg比例可能反映了機(jī)體免疫抑制狀態(tài)。本研究也發(fā)現(xiàn)OAML患者外周血Treg細(xì)胞比例高于正常對(duì)照，與上述研究結(jié)果一致，提示Treg細(xì)胞的免疫逃逸可能在OAML的發(fā)病過程中發(fā)揮了作用。

OAML是一種臨床進(jìn)程緩慢的惰性淋巴瘤，90%以上患者是以眼附屬器局限性病灶為主要表現(xiàn)，僅少數(shù)患者發(fā)生眼外部位的受累。這種疾病特點(diǎn)很容易讓患者甚至醫(yī)生忽略對(duì)于眼外病灶的評(píng)估。對(duì)于初診淋巴瘤患者，臨床工作中常使用多部位CT或PET/CT等影像學(xué)檢查，用來評(píng)估有無其他組織器官累及。此外，骨髓穿刺作為血液系統(tǒng)疾病常用的有創(chuàng)檢查，也被用于判斷有無骨髓受累的可能。目前尚未發(fā)現(xiàn)簡(jiǎn)便易行的血清學(xué)指標(biāo)，有利于預(yù)估OAML患者的病變累及部位。本研究發(fā)現(xiàn)，OAML伴有眼外組織受累的患者外周血Treg細(xì)胞比例高于病灶局限于眼附屬器患者，尤其是骨髓受累患者外周血Treg細(xì)胞比例明顯增高，提示Treg細(xì)胞比例增高可能與腫瘤的侵襲性相關(guān)。Treg細(xì)胞升高可能提示機(jī)體的免疫機(jī)制受損明顯，降低了機(jī)體對(duì)于腫瘤的防御能力，從而導(dǎo)致腫瘤的多部位侵犯。因此，筆者認(rèn)為對(duì)于外周血Treg比例較高的眼附屬器MALT患者應(yīng)該警惕眼附屬器以外部位的受累，建議盡早完善全身評(píng)估，尤其是骨髓的評(píng)估，避免延誤病情。

Dehghani等[21]總結(jié)了47例經(jīng)典霍奇金淋巴瘤(classic Hodgkin′s lymphoma，cHL)與48例DLBCL患者發(fā)現(xiàn)，外周血Treg細(xì)胞比例在診斷開始時(shí)顯著升高，在一線治療后降低至正常范圍，但在復(fù)發(fā)/難治患者中顯著降低。因此，認(rèn)為外周血Treg細(xì)胞的高水平可能是cHL和DLBCL患者對(duì)治療反應(yīng)和復(fù)發(fā)等疾病結(jié)局的有利預(yù)后因素；推測(cè)復(fù)發(fā)患者外周血中Treg細(xì)胞顯著減少的一個(gè)可能原因是Treg細(xì)胞遷移至復(fù)發(fā)部位，從而在這些患者的腫瘤微環(huán)境中高度積累，導(dǎo)致外周血中Treg水平降低。由于本研究為回顧性研究，并未檢測(cè)治療后以及病情進(jìn)展時(shí)期外周血Treg細(xì)胞比例，因此在進(jìn)一步的研究中，可以通過檢測(cè)不同疾病階段、不同治療階段的MALT淋巴瘤患者外周血Treg比例，來探討其與疾病發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)性。

另有研究發(fā)現(xiàn)，DLBCL患者中外周血Treg細(xì)胞高表達(dá)組(>8%)的總生存率高于Treg細(xì)胞低表達(dá)組(≤8%)，考慮Treg細(xì)胞在DLBCL患者中與不良預(yù)后相關(guān)，證實(shí)了Treg細(xì)胞在適應(yīng)性免疫中的抑制作用[8]。本研究結(jié)果雖然未發(fā)現(xiàn)低Treg細(xì)胞組與高Treg細(xì)胞組之間的PFS比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是筆者觀察到低Treg細(xì)胞組患者3年P(guān)FS率(92.9%)明顯高于高Treg細(xì)胞組(66.8%)。因此，筆者將在進(jìn)一步的研究中，通過延長(zhǎng)隨訪時(shí)間、擴(kuò)大樣本量等措施，進(jìn)一步探討外周血中Treg細(xì)胞水平是否可能與OAML的預(yù)后有關(guān)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)Treg細(xì)胞在OAML疾病過程中發(fā)揮了免疫逃逸機(jī)制，其比例的增加與腫瘤的侵襲性相關(guān)。外周血中較高的Treg細(xì)胞水平可能提示眼附屬器以外部位受累，尤其是骨髓的受累。因此，OAML患者一旦發(fā)現(xiàn)外周血Treg細(xì)胞比例增高，應(yīng)該盡早進(jìn)行全身評(píng)估以明確疾病累及部位。