娜孜熱木·夏甫開提 孫 威 楊 蕾 沈 靜 肖 輝

糖尿病(diabetes mellitus,DM)是全世界高發(fā)的疾病之一[1]。國(guó)際糖尿病聯(lián)合會(huì) (International Diabetes Federation，IDF) 數(shù)據(jù)顯示，2019年全球糖尿病患者約為4.63億，預(yù)計(jì)2045年全球總患病人數(shù)將達(dá)到7億[2]。單純餐后高血糖癥 (isolated post-challenge hyperglycaemia,IPH)主要表現(xiàn)為空腹血糖(fasting plasmaglucose,FPG)<7.0mmol/L而2h餐后血糖(2h-PG)≥11.1mmol/L[3]。研究表明,我國(guó)糖尿病患者經(jīng)口服糖耐量試驗(yàn)(oral glucose tolerance test,OGTT)診斷的新發(fā)糖尿病患者中，有46.6%的患者僅表現(xiàn)為單純餐后血糖水平升高而空腹血糖水平處于正常，漏診率達(dá)60.7%[4]。本研究利用非靶向代謝組學(xué)方法，試圖找到IPH患者空腹血清中的特征標(biāo)志物，從而降低漏診率，達(dá)到早發(fā)現(xiàn)、早干預(yù)治療的重要現(xiàn)實(shí)意義。

對(duì)象與方法

1.研究對(duì)象：選擇2020年9月11日～2021年1月31日期間于烏魯木齊友誼醫(yī)院體檢的374例受檢者，根據(jù)研究目的分為餐后高血糖病例組(IPH組)、2型糖尿病組(T2DM組)和正常對(duì)照組。經(jīng)性別、年齡基線資料匹配后，確定每組研究對(duì)象為20例。

2.納入與排除標(biāo)準(zhǔn)：納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡35～65歲；②長(zhǎng)期(≥5年)居住于烏魯木齊市；③符合相關(guān)組入組分類標(biāo)準(zhǔn)，T2DM組診斷標(biāo)準(zhǔn)：空腹血糖濃度≥7.0mmol/L(空腹的定義為至少8h未攝入能量)，OGTT試驗(yàn)2h血糖≥11.1mmo1/L(依照WHO推薦的執(zhí)行方法，將75g無水葡萄糖溶于水中作為糖負(fù)荷)；IPH組診斷標(biāo)準(zhǔn)：空腹血糖濃度<7.0mmol/L 和2h餐后血糖濃度≥11.1mmo1/L；正常糖耐量即空腹血糖和2h餐后血糖均為正常。排除標(biāo)準(zhǔn):①有嚴(yán)重肝臟、腎臟疾?。虎诨几哐獕?、遺傳病、冠心病等疾?。?型糖尿病及高血糖病情不穩(wěn)定患者；③服用對(duì)試驗(yàn)研究目的有潛在影響的藥物者。

3.臨床采集與保存：血樣采集12h空腹血液，采用一次性真空負(fù)壓采血管抽取肘靜脈血10ml均放于真空管中。取5ml血樣靜置30min后，4℃ 3000r/min離心10min，取離心后的血清于-80℃凍存。

4.儀器與試劑：LC20超高效液相色譜儀購(gòu)自日本Shimadzu公司；TripleTOF-6600質(zhì)譜儀購(gòu)自美國(guó)AB Sciex公司；渦旋混合器MIX-200購(gòu)自上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司；離心機(jī)5427R購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司；乙腈、甲醇、甲酸、2-氯苯丙氨酸購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司。

5.樣品前處理與色譜與質(zhì)譜條件及進(jìn)樣方式：取樣本100μmol加入到對(duì)應(yīng)的已編號(hào)的1.5ml離心管中，加入300μl純甲醇(含1ppm的2-氯苯丙氨酸)。渦旋2min，放入-20℃冰箱孵育0.5h。渦旋2min，12000r/min、4℃條件下離心10min；取200μl上清液轉(zhuǎn)移至新的1.5ml離心管中,-20℃靜置0.5h。再將上清液在12000r/min、4℃條件下離心15min。取上清液于進(jìn)樣瓶中，用于LC-MS/MS分析。色譜柱：Waters T3 C18柱，內(nèi)徑2.1mm×100mm, 1.8μm(C18 MWM-13)；流動(dòng)相A: 0.04%乙酸/水；流動(dòng)相B: 0.04%乙酸/乙腈；儀器柱溫：40℃；流速：0.35ml/min；進(jìn)樣量：2μl。

結(jié) 果

1.研究對(duì)象的臨床特征：3組研究對(duì)象在性別、年齡、總膽固醇、低密度脂蛋白水平方面比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。然而在體重指數(shù)、甘油三酯、高密度脂蛋白和糖化血紅蛋白水平方面比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。3組臨床基線資料的比較詳見表1。

表1 3組研究對(duì)象臨床基線資料比較

2.代謝組學(xué)結(jié)果：通過對(duì)3組樣本進(jìn)行主成分分析(principal component analysis，PCA)，結(jié)果顯示各代謝組間有分離趨勢(shì)，提示樣本代謝組存在差異。為了得到更好的組間差異效果投影圖，進(jìn)行監(jiān)督性多元統(tǒng)計(jì)分析方法，即偏最小二乘判別分析(partial least squares-discriminant analysis,PLS-DA)。與PCA比較，OPLS-DA可以使組間區(qū)分最大化，有利于尋找3組差異代謝物。從OPLS-DA分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Q2=0.634,R2X=0.224，R2Y=0.995，是一個(gè)有效模型3組比較得到了明顯的分離趨勢(shì)(圖1)?；贠PLS-DA結(jié)果，獲得模型的變量重要性投影(variable importance in projection，VIP)，通過選取VIP≥1可以初步篩選出不同組間差異的代謝物。同時(shí)可以結(jié)合單變量分析的P<0.05和差異倍數(shù)值(fold change,FC)FC≥2 和FC≤0.5 的代謝物來篩選出可能潛在的標(biāo)志物，本研究通過S-plot，發(fā)現(xiàn)3組樣本都有明顯的差異代謝物(圖2)。

圖1 OPLS-DA散點(diǎn)得分圖

圖2 3組差異代謝物繪制S-plot圖

3.差異代謝物的篩選結(jié)果：正負(fù)離子模式下，血清樣本篩選出的差異化合物與PubChem、HMDB數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較,3組樣本通過非靶向代謝組學(xué)方法共鑒定出1205個(gè)差異代謝物質(zhì), 包括脂類與類脂分子(28%)、有機(jī)酸(9%)、有機(jī)氮化合物(11%)、苯類化合物(11%)及其他代謝物；其中IPH組與T2DM組和正常對(duì)照組比較，分別得到24個(gè)和254個(gè)顯著差異代謝物，表2展示各組前10個(gè)顯著差異代謝物。

表2 差異代謝物篩選結(jié)果(前10項(xiàng))

4.差異代謝物代謝途徑富集分析:正負(fù)離子模式下，根據(jù)差異代謝物結(jié)果進(jìn)行KEGG通路富集分析，通過差異表達(dá)的代謝物中在對(duì)應(yīng)通路中的個(gè)數(shù)與該通路檢測(cè)注釋到的代謝物總數(shù)的比值富集因子(rich factor)來表達(dá)富集程度，該值越大表示富集程度越大；同時(shí)觀察富集顯著性(P)值，其越接近于0，表示富集越顯著。3組的差異代謝物在94條KEGG通路中富集，其中在7條通路顯著富集(P≤0.05)，這些通路為2-氧代羧酸的代謝、氰胺酸代謝、谷胱甘肽的代謝、氨基酸的生物合成、纈氨酸亮氨酸和異亮氨酸的降解、托烷、哌啶和吡啶類生物堿的生物合成和?；撬岷痛闻；撬岬拇x途徑；IPH組與T2DM組差異代謝物在初級(jí)膽汁酸的生物合成和膽汁酸的分泌代謝通路中顯著富集(P≤0.05，圖3A)；與正常對(duì)照組差異代謝物則在9條代謝通路富集(圖3B)。

圖3 差異代謝物KEGG富集圖A.IPH組與T2DM組差異代謝物；B.IPH組與正常對(duì)照組差異代謝物

討 論

單純餐后高血糖癥屬糖尿病早期的亞系，與心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)[5,6]。目前研究者認(rèn)為，糖代謝在糖調(diào)節(jié)受損和糖尿病階段是存在較大的異質(zhì)性，IPH可能是單純糖耐量受損病情進(jìn)一步加深的結(jié)果，處于這兩種階段的患者的病理機(jī)制和發(fā)病機(jī)制有所區(qū)別[7]。本研究利用目前較認(rèn)可的代謝組學(xué)方法，試找到IPH患者區(qū)別性特征標(biāo)志物。

此次研究中IPH患者占22.45%(84/374)，根據(jù)《中國(guó)成人血脂異常防治指南》標(biāo)準(zhǔn)，血脂異常的IPH患者檢出率為27.38%(23/84),且血糖異常以高甘油三酯(TG)為主[8]。TG作為脂肪組織中的含量豐富的一種脂質(zhì)，可影響糖、脂代謝[9]；當(dāng)患者出現(xiàn)較高的TG水平時(shí),就提示患者存在高血糖癥可能性[10]。按照中國(guó)成年人體重指數(shù)參考值，此次調(diào)查中超重肥胖的IPH患者51.19%(43/84)，超重和肥胖是血脂異常的主要危險(xiǎn)因素，也與諸多代謝紊亂性疾病發(fā)病密切相關(guān)[11]。TG水平與BMI受生活習(xí)慣、飲食、年齡等的影響。新疆地區(qū)居民的膳食結(jié)構(gòu)總體上呈現(xiàn)高蛋白、高脂肪、低維生素(蔬菜、水果攝入單一)、低礦物質(zhì)的膳食模式傾向，并存在季節(jié)性飲食結(jié)構(gòu)差異[12]。本研究收集樣本血清由9月(秋季)過渡到次年1月(冬季)，秋冬季寒冷且漫長(zhǎng)，日照相對(duì)少，飲食中多熱性、味重、油膩的食品，肉、乳的消費(fèi)較高。此類季節(jié)飲食特點(diǎn)使體內(nèi)的脂肪含量增加的同時(shí)TG水平也隨之上升，從而可能增加餐后高血糖癥的發(fā)生與發(fā)展。

本研究檢測(cè)出的3組差異代謝物中占比最多為脂類和類脂分子(28%)。劉麗燕等[13]利用UPLC-Q-TOF-MS對(duì)IPH人群的血清進(jìn)行代謝指紋圖譜分析，發(fā)現(xiàn)的17種化合物中有13種為脂類化合物。Arneth等[14]在關(guān)注代謝組學(xué)脂質(zhì)譜和糖尿病早期之間的關(guān)系研究上，發(fā)現(xiàn)在T2DM前期患者體內(nèi)存在高濃度的低碳脂質(zhì)，例如甘油磷脂和鞘磷脂。同樣，本研究IPH組分別與T2DM組、正常對(duì)照組兩兩比較發(fā)現(xiàn)的脂類差異代謝物包括甘油磷脂、丙醇脂類、鞘脂類、脂肪?；惡皖惞檀寂c類固醇衍生物，其中，兩個(gè)比較組共有的高表達(dá)差異代謝物甘油磷脂包括的1，2-二乙酰甘油-3-磷酸(PA、PE)和低表達(dá)單甲基磷酸乙醇胺(PE-NMe)中，前者是三乙基甘油和磷脂生物合成中的中間體，后者是細(xì)胞脂質(zhì)雙層的關(guān)鍵成分。進(jìn)一步來說，作為細(xì)胞膜主要組成成分的磷脂，與機(jī)體胰島素敏感度相關(guān)；既往研究表明，紅細(xì)胞膜磷脂高低變化與胰島素抵抗有關(guān)[15]。本研究初步推測(cè)上述甘油磷脂類差異代謝物作為診斷IPH的生物學(xué)標(biāo)志物具有一定的特異性。

3組研究對(duì)象差異代謝物中有7%為有機(jī)酸類化合物。在既往的研究中，該膽汁酸的水平紊亂與新發(fā)疾病呈正相關(guān)，并證實(shí)與T2DM前期發(fā)病有關(guān)[16]。筆者也發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于T2DM組，存在于初級(jí)膽汁中膽烷酸類-去甲膽堿酸、次級(jí)膽汁酸-去氧膽酸是IPH高表達(dá)差異代謝物。Fall等[17]研究顯示，上述兩種膽汁酸都以膽固醇為原料在肝臟中合成，并且在脂類消化吸收過程調(diào)控糖脂及能量代謝中起關(guān)鍵信號(hào)分子作用。本研究結(jié)果提示，IPH患者體內(nèi)該膽汁酸代謝物發(fā)生改變并且該代謝物在通路初級(jí)膽汁酸的生物合成和膽汁酸的分泌代謝中發(fā)生紊亂。

支鏈氨基酸(branched chain amino acid，BCAA)如亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸是人體重要的必需氨基酸,參與機(jī)體多重代謝過程。既往研究發(fā)現(xiàn)，支鏈氨基酸與胰島素抵抗密切相關(guān)，BCAAs分解代謝增加導(dǎo)致中間代謝物增加，潛在地導(dǎo)致受體應(yīng)激和胰島素分泌作用受損[18,19]。本研究發(fā)現(xiàn)，3組差異代謝物在纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的降解代謝途徑顯著富集，另外還在2-氧化羧酸的代謝、谷胱甘肽代謝、?；撬岷痛闻；撬岬拇x、托烷、哌啶和吡啶類生物堿的生物合成代謝通路等多條代謝途徑富集；這更加表明，與正常人群比較，IPH患者與T2DM患者機(jī)體多種代謝途徑改變。除此之外，發(fā)現(xiàn)的谷氨酰胺、苯丙氨酸、L-苯丙氨酰，是IPH組與兩組比較共有的差異代謝物。

在胰島素抵抗動(dòng)脈粥樣硬化研究(IRAS)的參與者中，發(fā)現(xiàn)谷氨酰胺與谷氨酸的比率可以預(yù)測(cè)5年后的胰島素抵抗。Wang等[20]利用代謝組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)，甘氨酸水平是糖耐量受損重要的預(yù)測(cè)因子。在代謝組學(xué)與2型糖尿病Meta分析研究中，233項(xiàng)代謝組學(xué)研究中的甘氨酸代謝表明與糖耐量受損程度呈負(fù)相關(guān),甘氨酸和谷氨酰胺分別與11%和15%的糖尿病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)降低相關(guān)[21]。還有關(guān)于谷氨酰胺的8項(xiàng)分析中，有3項(xiàng)報(bào)告了顯著的反向關(guān)聯(lián)[22,23]。同樣，本研究中的該谷氨酰胺差異代謝物分別在IPH組與正常對(duì)照組的比較和T2DM組與正常對(duì)照組比較中出現(xiàn)，未在IPH組單獨(dú)與T2DM組比較中出現(xiàn)。雖該谷氨酰胺能否作為判別IPH患者的標(biāo)志物尚不明確。但可以表明，與正常人群比較,IPH患者與T2DM患者該差異代謝物發(fā)生改變。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過研究對(duì)象空腹血清進(jìn)行代謝組學(xué)探索性研究，發(fā)現(xiàn)區(qū)別IPH和正常對(duì)照組與區(qū)別T2DM和IPH的生物學(xué)標(biāo)志物是相同的幾種甘油磷脂類、去氧膽酸和膽酸以及氨基酸類，初步說明診斷IPH患者時(shí)該代謝物可以作為參考指標(biāo)，并且該指標(biāo)只利用了空腹血清檢測(cè)，可以解決IPH患者漏診現(xiàn)象。但關(guān)于本研究類似相關(guān)報(bào)道較少，結(jié)果重復(fù)性差。此外，本研究樣本量小、采集的樣本血清具有區(qū)域性,受生活方式、飲食習(xí)慣等因素影響，不能夠完全做出關(guān)于IPH患者的代謝紊亂的結(jié)論性陳述,需要更多的試驗(yàn)研究結(jié)果來驗(yàn)證。在往后的深入研究中,筆者將會(huì)進(jìn)一步增加樣本量和統(tǒng)計(jì)指標(biāo),以期得到更好的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和實(shí)驗(yàn)結(jié)論。