趙素芬 王運(yùn)盛 李婧倫 蔣 鵬 滑 榮 張 歡 胡 昕 詹同彤 李 茹* 盧 巖*

(1.北京動(dòng)物園管理處，圈養(yǎng)野生動(dòng)物技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京，100044；2.大連森林動(dòng)物園有限公司，大連，116013)

丹頂鶴(Grusjaponensis)為鶴科(Gruidae)鶴屬的大型涉禽，我國一級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生動(dòng)物[1]，IUCN易危(VU)物種(https：//www.iucnredlist.org/search？query=Grus%20japonensis&searchType=species)，CITES附錄Ⅰ物種。截至2019年12月，我國28個(gè)省級(jí)行政區(qū)的90個(gè)圈養(yǎng)單位飼有丹頂鶴，圈養(yǎng)種群數(shù)量總計(jì)2 386只[2]，丹頂鶴飼養(yǎng)保護(hù)工作取得了長足的發(fā)展。然而近些年，我國多地動(dòng)物園及自然保護(hù)區(qū)出現(xiàn)丹頂鶴及其他珍稀鶴類突然發(fā)病死亡，瀕死前進(jìn)行血液學(xué)檢查，發(fā)現(xiàn)血液內(nèi)寄生大量原蟲，對(duì)病原進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定，疑似為瘧原蟲科(Plasmodiidae)的住白細(xì)胞原蟲(Leucocytozoonsp.)。2020年，大連某動(dòng)物園1只119日齡丹頂鶴幼鶴發(fā)病，治療1 d后死亡，經(jīng)尸體剖檢、實(shí)驗(yàn)室檢查和病理學(xué)檢查，分析該病例死于血液原蟲感染，現(xiàn)將病例報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 發(fā)病動(dòng)物情況

患病丹頂鶴為人工育雛鶴，30日齡后與同年繁育幼鶴合籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)籠舍與成年鶴籠舍相鄰。該丹頂鶴發(fā)病前1 d采食量減少，發(fā)病當(dāng)日精神沉郁、排綠色水樣便，采集糞便樣品，使用直接鏡檢法進(jìn)行便常規(guī)檢查，肌內(nèi)注射頭孢曲松鈉和阿米卡星。治療無效，次日死亡。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 剖檢及病理組織學(xué)檢查

剖檢發(fā)病死亡的丹頂鶴，觀察其病理變化。采集心、肝、脾、肺、腎和腸等組織，迅速投入10%的福爾馬林液，進(jìn)行病理石蠟切片前處理；同時(shí)，使用無菌鋒利刀片剖開肝臟，清潔載玻片輕觸新鮮剖面，制備肝組織印片，自然風(fēng)干，用甲醇固定。

1.2.2 瑞氏吉姆薩染色

使用瑞氏吉姆薩染液染色肝組織印片15 min；雙蒸水漂浮，流水沖洗，風(fēng)干，在光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.2.3 HE染色

石蠟切片分別經(jīng)二甲苯脫蠟，100%、95%、85%、75%、50%乙醇梯度復(fù)水，下行至雙蒸水中，蘇木精染色15 min，1%鹽酸乙醇分色數(shù)秒，水洗返藍(lán)15 min；再依次通過50%、75%、85%、95%乙醇梯度脫水后，伊紅染色1 min，95%乙醇洗滌，再經(jīng)無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。光學(xué)顯微鏡下觀察組織病理學(xué)變化情況。

1.2.4 細(xì)菌分離培養(yǎng)

采集死亡丹頂鶴心、肝、腎和脾，無菌條件下使用直接劃線法接種于哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h。

2 結(jié)果與分析

2.1 剖檢病變

死亡丹頂鶴尸僵完全，機(jī)體消瘦(圖1A)。心外膜表面散在大量出血點(diǎn)，心耳水腫(圖1B)；肝腫大，表面散在分布大量的、界限清晰的、圓形的、大小不一的出血點(diǎn)及灰白色小結(jié)節(jié)(圖1C)；脾腫大，表面有點(diǎn)狀出血(圖1D)；腎腫大、質(zhì)脆(圖1E)；小腸腫脹，切面外翻，黏膜面有散在出血點(diǎn)(圖1F)；直腸輕度水腫，出血。其余臟器眼觀未見異常。

圖1 丹頂鶴臨床剖檢結(jié)果

2.2 病原形態(tài)

瑞氏吉姆薩染液染色，肝組織印片內(nèi)可觀察到大量寄生于細(xì)胞內(nèi)的、藍(lán)染的、直徑6～14 μm、不同發(fā)育狀態(tài)的、圓形或橢圓形的蟲體，游離于細(xì)胞的蟲體多呈棒狀或香蕉狀(圖2)。

圖2 丹頂鶴肝組織印片

2.3 病理學(xué)檢查結(jié)果

心：低倍鏡下觀察，可見心肌大面積壞死、心肌萎縮，炎性細(xì)胞浸潤，心肌水腫，肌纖維間隙增寬；高倍鏡下觀察，肌纖維間隙及血管內(nèi)散在大量寄生于細(xì)胞內(nèi)的、藍(lán)染的、直徑6～14 μm、呈圓形、橢圓形或香蕉狀的蟲體(圖3A)。

肺：低倍鏡下觀察，肺組織出血、淤血，肺內(nèi)出現(xiàn)大面積藍(lán)染壞死區(qū)域；高倍鏡下觀察，肺泡壁毛細(xì)血管擴(kuò)張、淤血，血管腔內(nèi)可見大量纖維素及紅細(xì)胞，肺泡壁及血管腔內(nèi)可見大量藍(lán)染蟲體寄生，壞死區(qū)域邊緣寄生大量蟲體(圖3B)。

腎：低倍鏡下觀察，腎組織大面積水腫，腎小管失去固有結(jié)構(gòu)；高倍鏡下觀察，腎小管上皮細(xì)胞變性、脫落和壞死，間質(zhì)可見大量蟲體寄生(圖3C)。

肝：低倍鏡下觀察，肝大面積壞死、藍(lán)染，肝淤血，中央靜脈內(nèi)蓄積大量血液，肝索紊亂，失去固有結(jié)構(gòu)；高倍鏡下觀察，肝細(xì)胞崩解，細(xì)胞間隙及肝血竇內(nèi)可見大量藍(lán)染蟲體(圖3D)。

脾：低倍鏡下觀察，脾組織出現(xiàn)大面積壞死區(qū)域；高倍鏡下觀察，大量藍(lán)染蟲體寄生(圖3E)。

腸：腸絨毛固有層內(nèi)可見大量蟲體寄生(圖3F)。

圖3 丹頂鶴主要臟器病理學(xué)觀察結(jié)果

2.4 糞便常規(guī)

直接鏡檢法檢查丹頂鶴糞便樣品內(nèi)寄生蟲和潛血等，高倍鏡下觀察，未見白細(xì)胞和紅細(xì)胞，蛔蟲卵、滴蟲滋養(yǎng)體極少觀察到(表1)。

表1 丹頂鶴糞便常規(guī)檢測結(jié)果

2.5 細(xì)菌分離培養(yǎng)

采集死亡丹頂鶴心、肝、腎和脾，無菌條件下使用直接劃線法接種于哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基，經(jīng)37 ℃恒溫培養(yǎng)，24、48 h后均無細(xì)菌生長。

3 診斷

根據(jù)肝組織印片、病理剖檢結(jié)論及實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)結(jié)果，確認(rèn)該丹頂鶴因血液原蟲感染致死。

4 討論

本病例在發(fā)病時(shí)未采集血液進(jìn)行血涂片檢查，但通過臨床癥狀、病理學(xué)檢查及臨床經(jīng)驗(yàn)，該?dān)Q與近些年我國多地動(dòng)物園及自然保護(hù)區(qū)出現(xiàn)丹頂鶴及其他珍稀鶴類死亡病因相同，為血液原蟲感染致死。病原在體內(nèi)大量復(fù)制增殖，隨著病程發(fā)展，病原隨血液擴(kuò)散至機(jī)體各個(gè)臟器，引起機(jī)體損傷，伴發(fā)寄生蟲性壞死，并繼發(fā)實(shí)質(zhì)性心肌炎，同時(shí)該病原寄生于紅細(xì)胞及白細(xì)胞內(nèi)，引起動(dòng)物貧血及免疫功能下降，甚至產(chǎn)生大量毒素，從而造成動(dòng)物死亡。根據(jù)蟲體形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)，分析該致病原可能隸屬于頂復(fù)亞門(Apicomplexa)，孢子蟲綱(Sporozoa)，球蟲亞綱(Coccidia)，血孢子蟲目(Haemosporidia)的住白細(xì)胞原蟲；基于鳥類血孢子蟲目常規(guī)引物進(jìn)行套式PCR(第1輪擴(kuò)增引物：HaemNF1，5′-CATATATTAAGAGAAITATGGAG-3′)；HaemNR3，5′-ATAGAAAGATAAGAAATACCATTC-3′。第2輪擴(kuò)增引物：HaemF，5′-ATGGTGTTTTAGATACTTACATT-3′；HaemR2，5′-CATTATCTGGATGAGATAATGGIGC-3′)，未能擴(kuò)增出該病原的Cytb基因片段，其基因特點(diǎn)、分子生物學(xué)鑒定及分類有待進(jìn)一步研究。

據(jù)報(bào)道，住白細(xì)胞原蟲的傳播媒介為雙翅目(Diptera)昆蟲蚋(Simuliidae)和蠓(Ceratopogouidae)等，蟲媒的活動(dòng)習(xí)性使該病的發(fā)生呈明顯的季節(jié)性，多發(fā)于夏秋季，在雨季過后20 d左右開始發(fā)生，當(dāng)氣溫高于20 ℃時(shí)，蠓的繁殖及活動(dòng)最為活躍，該病的流行性明顯增加[3-4]。大連市2020年氣溫偏高，降水偏多，8月出現(xiàn)6次區(qū)域性暴雨、大暴雨和大風(fēng)天氣，9月出現(xiàn)4次強(qiáng)對(duì)流天氣，降水量超同期。該?dān)Q于2020年8月7日出殼，氣溫適宜蟲媒活動(dòng)，合籠后飼養(yǎng)的籠舍環(huán)境易積水，利于蟲媒繁殖棲息，可能使該丹頂鶴在易感季節(jié)被叮咬感染。禽類對(duì)該病原的易感性與日齡成正比，危害程度隨年齡增加呈下降趨勢；幼禽感染后死亡率高，成年禽通常無明顯臨床癥狀，部分可耐過，死亡率較低[5]。該丹頂鶴病例為幼齡鶴，于119日齡開始出現(xiàn)癥狀，病程快，隔天即死亡，死亡時(shí)間正值秋冬換季時(shí)節(jié)，推測為氣溫突變等外界因素造成機(jī)體抵抗力下降，誘發(fā)感染病原在體內(nèi)大量增殖，從而引起動(dòng)物發(fā)病死亡。其他飼養(yǎng)單位亦有類似大連某動(dòng)物園病例在秋冬季節(jié)發(fā)生死亡的情況。此外，幼鶴發(fā)病后排綠色水樣便，剖檢多臟器出血，肝表面可觀察到大量的灰白色病灶，這與禽霍亂癥狀相似，但臨床上極少報(bào)道丹頂鶴發(fā)生霍亂致死，住白細(xì)胞原蟲病導(dǎo)致幼鶴肝表面散布?jí)乃涝?，而非呈彌散性壞死，剖檢時(shí)需注意區(qū)分。

治療住白細(xì)胞原蟲感染的藥物通?？蛇x擇磺胺二甲嘧啶、乙胺嘧啶和二氯二甲吡啶酚等[6-7]。賈婷[8]研究發(fā)現(xiàn)，目前治療血液原蟲的藥物對(duì)鶴的治療效果欠佳，肌內(nèi)注射青蒿琥酯能夠在一段時(shí)間內(nèi)控制病情，但之后血液學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，感染寄生蟲的血細(xì)胞數(shù)量會(huì)突然上升，隨即動(dòng)物死亡，未來藥物治療研究仍是工作重點(diǎn)。目前，對(duì)于鶴類血液原蟲病仍以預(yù)防為主，在蟲媒活動(dòng)頻繁的季節(jié)應(yīng)及時(shí)清理籠舍周邊的雜草、樹叢和積水，做好消毒工作，保持籠舍衛(wèi)生，減少吸血昆蟲孳生；亦可使用殺蟲劑如溴氰菊酯、戊酸氰醚酯和蠅毒磷等在籠舍周圍噴灑殺滅媒介昆蟲[9-10]，有條件的籠舍建議安裝防蚊蟲紗網(wǎng)，切斷傳播媒介[11]。在進(jìn)入血液原蟲流行季節(jié)前，可在日糧中添加多種維生素以提高機(jī)體抵抗力。