任曉彤 周永恒 李天峰 李仁貴 馬 躍，4 李德生 黃 炎 徐艷春，4，5*

(1.東北林業(yè)大學(xué)野生動物與自然保護(hù)地學(xué)院，哈爾濱，150040；2.中國大熊貓保護(hù)研究中心，都江堰，611830；3.大熊貓國家公園珍稀動物保護(hù)生物學(xué)國家林業(yè)和草原局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，都江堰，611830；4.國家林業(yè)和草原局野生動植物檢測中心，哈爾濱，150040；5.國家林業(yè)和草原局野生動物保護(hù)與利用工程技術(shù)研究中心，哈爾濱，150040)

線粒體DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)拷貝數(shù)在其細(xì)胞能量代謝以及其他一系列細(xì)胞活動如鈣信號、鐵穩(wěn)態(tài)、激素合成和細(xì)胞程序性死亡[1-3]中起著核心作用，單個(gè)哺乳動物細(xì)胞擁有成百上千個(gè)mtDNA拷貝，這種遠(yuǎn)高于核DNA(nuclear DNA，nuDNA)的拷貝數(shù)在哺乳動物基因組復(fù)雜的進(jìn)化中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，平均每個(gè)細(xì)胞內(nèi)mtDNA拷貝數(shù)(Nmpc)反映著線粒體耗竭、能量儲備和氧化應(yīng)激等情況，也在一定程度上反映了機(jī)體當(dāng)下的代謝狀態(tài)[4]。據(jù)此推測，機(jī)體在生長發(fā)育和衰老的過程中可能伴隨著一定規(guī)律的mtDNA拷貝數(shù)的變化。

糞便是動物的遺留物，也是動物研究中常用的非損傷性材料，無論是對野外還是飼養(yǎng)種群的采集都比較方便。糞便中包含的宿主DNA主要來自腸上皮細(xì)胞[5-6]，機(jī)體的生長發(fā)育和衰老伴隨著腸道功能的發(fā)育和衰退，影響腸道的生理狀態(tài)和代謝能力[7]，在這個(gè)過程中，作為能量供應(yīng)中樞的線粒體中DNA拷貝數(shù)可能也會發(fā)生變動[8]，但是，變動的方式尚不了解。

大熊貓(Ailuropodamelanoleuca)是世界矚目的珍稀物種[9-10]，主要以竹子為食。竹纖維經(jīng)過簡單咀嚼后直接進(jìn)入胃腸道，絕大多數(shù)的竹纖維都無法被消化分解[11]，經(jīng)過腸道時(shí)，會黏附大量的腸道上皮細(xì)胞，并帶入糞便中，為相關(guān)研究提供足夠多、質(zhì)量足夠好的DNA。人工飼養(yǎng)種群具有準(zhǔn)確的出生記錄和詳細(xì)的系譜信息，本研究選用出生月份記錄清晰的圈養(yǎng)大熊貓的糞便為材料，研究腸道上皮細(xì)胞中mtDNA拷貝數(shù)與月齡的關(guān)系，以期揭示大熊貓不同生長發(fā)育和衰老階段腸道代謝功能的變動規(guī)律，為飼養(yǎng)種群和野外種群的管理提供新的視角。

1 材料與方法

1.1 樣本收集與糞便DNA提取

2021年6—7月從中國大熊貓保護(hù)研究中心的都江堰、核桃坪和耿達(dá)3個(gè)基地共采集64只11～357月齡的大熊貓的新鮮糞便(圖1)。采集時(shí)用無菌手術(shù)刀和剪刀對每個(gè)糞便樣本的頂部、尾部和中間3個(gè)部位切取表面的竹纖維，得到200～300 g的樣品，立即置于冰箱中-20 ℃暫存，在干冰中運(yùn)到實(shí)驗(yàn)室備用。使用QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit(Qiagen，德國)，按照說明書的流程提取糞便總DNA。

圖1 本研究采用的64只大熊貓的月齡分布

1.2 引物設(shè)計(jì)及有效性驗(yàn)證

通過實(shí)時(shí)定量PCR方法測定nuDNA和mtDNA的拷貝數(shù)。分別以大熊貓nuDNA(NCBI參考序列號：NC048220.1)上β-actin基因和mtDNA(NCBI參考序列號：NC009492.1)上Cytb基因?yàn)槟康幕蛟O(shè)計(jì)引物對，同時(shí)以大熊貓基因組為比對數(shù)據(jù)庫通過NCBI-BLAST排除核內(nèi)mtDNA片段(Numts)的干擾[12]，最終選擇nuDNA的PCR引物對為Nβ(NβF：5′-GGGGATGGCGTTACTCATACT-3′；NβR：5′-ACATCACGAACAATCTCCCG-3′)，mtDNA的PCR引物對為MC(MCF：5′-AAGTGCCCCGCCACATATTT-3′；MCR：5′-GGTCGGAATATCATGCTTCGTTG-3′)。2對引物的熔解溫度(melting temperature，Tm)均為60 ℃，片段長度分別為170、171 bp，引物由庫美生物科技有限公司合成。

2個(gè)DNA片段采用相同擴(kuò)增體系和擴(kuò)增程序。擴(kuò)增反應(yīng)在10.0 μL體系中進(jìn)行，包括2 ×RapidTaqMaster Mix(南京維諾贊生物科技有限公司)5.0 μL，10 μmol/L上下游引物各0.3 μL，DNA模板2.0 μL(～40 ng總DNA)，ddH2O 2.4 μL?；靹蚝笏矔r(shí)離心，用9700型PCR擴(kuò)增儀(GeneAmp，USA) 擴(kuò)增。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性20 s，56 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，30個(gè)循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后72 ℃延伸 5 min。從2個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)中分別取4 μL的擴(kuò)增產(chǎn)物，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳緩沖液為1×TAE，95 V下電泳25 min。

1.3 qRT-PCR熒光定量標(biāo)準(zhǔn)品制備

1.3.1 nuDNA和mtDNA目的基因片段處理

Nβ、MC2對引物的擴(kuò)增體系等比放大至40 μL，將PCR產(chǎn)物在2%的瓊脂糖凝膠中，按照相同的條件電泳分離。紫外燈下切取2條目的條帶，用DNA純化回收試劑盒(Axygen，美國)分別進(jìn)行回收，按照說明書操作。

純化回收的DNA經(jīng)超微量分光光度計(jì)(Implen，德國)檢測濃度后，與pMD18-T載體(TaKaRa，日本)連接，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至EscherichiacoliDH5α感受態(tài)細(xì)胞(TaKaRa，日本)中，通過藍(lán)白斑篩選隨機(jī)挑取10個(gè)白色菌落，轉(zhuǎn)移至LB液體培養(yǎng)基中37 ℃下?lián)u動培養(yǎng)16 h。吸取菌液1 μL，用1.2中的10 μL體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增以及電泳檢測。確定陽性后，用EasyPure?Plasmid MiniPrep Kit(Trans，北京)提取質(zhì)粒，操作流程按照說明書進(jìn)行。提取到的2種質(zhì)粒用Sange法對插入片段測序，將測序結(jié)果在NCBI上比對，確認(rèn)得到目的片段。

1.3.2 建立標(biāo)準(zhǔn)品濃度梯度

用所得的陽性質(zhì)粒制備標(biāo)準(zhǔn)品。用微量分光光度計(jì)測定其濃度，按照公式計(jì)算質(zhì)粒拷貝數(shù)(C)：

C=n×60.2×1014×(1/660N)。

式中：n為質(zhì)粒濃度；N為插入片段的長度。

用滅菌的ddH2O按照10×等比例梯度稀釋質(zhì)粒，以稀釋10-7～10-2的質(zhì)粒為模板，進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增以建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，每個(gè)濃度做3個(gè)重復(fù)。熒光定量PCR反應(yīng)在10.0 μL體系中進(jìn)行，包括1.0 μL質(zhì)粒溶液、5.0 μL TB Green Premix ExTaqⅡ(TaKaRa，日本)、10 μmol/L上下游引物各0.4 μL和3.2 μL ddH2O。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火34 s，72 ℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)；熔解段95 ℃處理15 s，60 ℃處理1 min，95 ℃處理15 s。反應(yīng)用BTK-96實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析儀(無錫百泰克生物技術(shù)有限公司)完成，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。最終得到濃度為102～107拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)品(Ct值10～30)。

1.4 糞便DNA中mtDNA拷貝數(shù)估算

將來自每個(gè)糞便樣品不同部位的3份DNA稀釋成近似濃度并等量混合，以此作為該個(gè)體的DNA樣品。按照1.3.2中反應(yīng)體系和程序，用Nβ和MC2對引物進(jìn)行擴(kuò)增，檢測Ct值，并按照1.3.2中得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線估算nuDNA和mtDNA的拷貝數(shù)。再根據(jù)公式計(jì)算平均每個(gè)腸上皮細(xì)胞中mtDNA的拷貝數(shù)(Nmpc)：Nmpc=2Nmt/Nnu，式中Nmt為樣品中總mtDNA拷貝數(shù)；Nnu為樣品中總nuDNA拷貝數(shù)。每個(gè)樣品重復(fù)3次，取均值作為最終數(shù)據(jù)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)3σ原則，把測得的Nmt、Nnu和Nmpc取值超出(μ-3σ，μ+3σ)區(qū)間的認(rèn)定為異常值(μ為均值，σ為標(biāo)準(zhǔn)差)。檢測到的異常值在后續(xù)分析中被剔除。對整理后的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)計(jì)算，得到Nmpc的平均值(mean)、標(biāo)準(zhǔn)差(SD)和變異系數(shù)(CV)；對所有個(gè)體的Nmt、Nnu和Nmpc取自然對數(shù)并做頻率分布直方圖；將個(gè)體月齡與Nmpc及l(fā)n(Nmpc)做線性回歸分析，得到兩者之間的關(guān)系；計(jì)算每個(gè)單獨(dú)數(shù)據(jù)減去群體均值之后的絕對值作為變異度，與群體月齡做線性回歸曲線。

考慮到性別對糞便DNA拷貝數(shù)的潛在影響，把Nmpc按照性別分組，分別計(jì)算雌、雄2組的平均值、標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)；分別對雌、雄2組所有個(gè)體的Nmt、Nnu和Nmpc取自然對數(shù)并做頻率分布直方圖；由于樣品中雌性和雄性月齡分布略有差異，按照性別及月齡層次分布進(jìn)行分層隨機(jī)抽樣，減小月齡分布偏好度的影響，抽樣比例設(shè)置為60%，對抽樣數(shù)據(jù)取對數(shù)處理后進(jìn)行秩和檢驗(yàn)；分別將雌、雄2組的月齡與Nmpc做線性回歸曲線；計(jì)算雌、雄2組的變異度，分別與群體月齡做線性回歸曲線。以上分析均采用SPSS 24.0(IBM Corp.USA)完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物對Nβ和MC的有效性

以3只大熊貓糞便總DNA為模板，引物對Nβ和MC均擴(kuò)增了目的片段(圖2)，表明這2對引物對nuDNA和mtDNA的擴(kuò)增均是有效的。用大熊貓糞便DNA進(jìn)行Nβ和MC引物的熒光定量PCR檢驗(yàn)，引物Nβ和MC的熔解曲線如圖3所示，熔點(diǎn)峰值分別為85.1、80.0 ℃，熔解曲線峰值點(diǎn)僅有1個(gè)且高度重合，說明引物無非特異性擴(kuò)增以及二聚體，可用于樣品拷貝數(shù)的分析。

圖2 3只大熊貓Nβ和MC引物擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果

圖3 引物Nβ(左)和引物MC(右)的qRT-PCR熔解曲線

2.2 qRT-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線

以菌液為模板，通過引物對Nβ和MC進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在瓊脂糖凝膠上檢測到在170 bp左右的條帶；測得序列與NCBI上大熊貓的參考序列NC048220.1和NC009492.1的同源性均為100%，證明插入質(zhì)粒的片段是目的片段。

經(jīng)微量分光光度計(jì)測定，nuDNA質(zhì)粒的初始濃度為129.00 ng/μL，mtDNA質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的初始濃度為119.95 ng/μL。通過計(jì)算得到的nuDNA和mtDNA拷貝數(shù)分別為6.92×1010、6.40×1010拷貝/μL。經(jīng)過10×梯度稀釋后，分別用引物對Nβ和MC的熒光定量PCR檢測Ct值，并與實(shí)際拷貝數(shù)進(jìn)行回歸，繪制mtDNA和nuDNA 2種標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中nuDNA的R2值為0.990，擴(kuò)增效率(E)為97.95%，曲線方程Y=-3.811X+35.264；mtDNA的R2值為0.992，擴(kuò)增效率為99.52%，曲線方程Y=-4.077X+39.063(圖4)。最終得到的拷貝數(shù)檢測下限為102。

圖4 nuDNA(左)和mtDNA(右)標(biāo)準(zhǔn)品的qRT-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 平均每個(gè)細(xì)胞mtDNA的拷貝數(shù)

將月齡和對應(yīng)的Nmpc數(shù)據(jù)按照性別劃分，雌性和雄性月齡分別為11～357、13～336月齡，平均值分別為172、123月齡；對應(yīng)的Nmpc分別為24.00～7 803.00和46.00～8 467.00，平均值分別為1 177.00和1 990.00，標(biāo)準(zhǔn)差分別為1 840.34和2 449.51，變異系數(shù)分別為56.32%和123.08%；最終雌性和雄性的變異系數(shù)/平均月齡值分別為0.9%和1.0%。分別對雌、雄2組Nmt、Nnu和Nmpc進(jìn)行自然對數(shù)轉(zhuǎn)換后，其頻率分布如圖5(D-F為雌性，G-I為雄性)，對于雌性個(gè)體，Nmt跨度最大，Nmpc頻率分布最集中且跨度最小，Nnu頻率分布最分散；對于雄性個(gè)體，Nmt頻率分布最集中且跨度最大，Nmpc跨度最小，Nnu頻率分布最分散。對抽樣數(shù)據(jù)進(jìn)行性別和Nmpc的秩和檢驗(yàn)，顯著性為0.002。將每個(gè)性別的Nmpc進(jìn)行自然對數(shù)轉(zhuǎn)換后與月齡進(jìn)行線性回歸分析，結(jié)果顯示2個(gè)性別中Nmpc都隨著月齡的增加呈下降趨勢，但趨勢未達(dá)到顯著水平(圖7，雌性R2=0.060，P=0.176；雄性R2=0.110，P=0.074)。

圖5 大熊貓糞便總DNA中Nmt、Nnu和Nmpc的頻率分布

圖6 大熊貓糞便總DNA中Nmpc及其變異度與月齡的相關(guān)性

圖7 不同性別大熊貓糞便總DNA中Nmpc及其變異度與月齡的相關(guān)性

3 討論與展望

生物體內(nèi)線粒體功能的發(fā)揮隨著個(gè)體生長發(fā)育而改變，長期以來，與衰老相關(guān)的線粒體功能下降一直被認(rèn)為是多種生物學(xué)變化的基礎(chǔ)，線粒體功能改變的機(jī)制涵蓋多個(gè)領(lǐng)域，包括能量(ATP)產(chǎn)生和能量儲備的下降[13-14]，自由基產(chǎn)生的增加[15]，凋亡和有絲分裂速率的改變，以及融合、分裂的改變。這些關(guān)鍵的細(xì)胞內(nèi)變化會導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙、組織改變和疾病風(fēng)險(xiǎn)增加[16]。已有一些研究證明mtDNA異質(zhì)性與衰老之間具有相關(guān)性[17-20]，有關(guān)每個(gè)細(xì)胞的mtDNA分子的數(shù)量，即每個(gè)細(xì)胞mtDNA的拷貝數(shù)與月齡之間相關(guān)性的研究卻很少。

機(jī)體細(xì)胞mtDNA拷貝數(shù)的普遍減少會破壞線粒體的整體效能，過度增加也會帶來疾病風(fēng)險(xiǎn)[21]，如人類的mtDNA拷貝數(shù)改變與癌癥、神經(jīng)退行性疾病和糖尿病等衰老相關(guān)的疾病有關(guān)[22-23]。因此，從維持細(xì)胞和組織穩(wěn)態(tài)的角度，mtDNA拷貝數(shù)應(yīng)受到機(jī)體的嚴(yán)格控制。

本研究對大熊貓糞便中mtDNA拷貝數(shù)與月齡之間的相關(guān)性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)mtDNA拷貝數(shù)隨著月齡的增加呈現(xiàn)總體下降的趨勢，并達(dá)到顯著水平(P=0.004，圖6A)。筆者推測這種趨勢可能源于mtDNA拷貝數(shù)是線粒體復(fù)制和細(xì)胞能量轉(zhuǎn)換的標(biāo)志，當(dāng)個(gè)體處于幼齡期時(shí)，基礎(chǔ)代謝率較高，線粒體的總體活動更為活躍，導(dǎo)致細(xì)胞中mtDNA拷貝數(shù)普遍較高；而老年個(gè)體基礎(chǔ)代謝水平降低[24]，在這一水平上維持能量轉(zhuǎn)化的穩(wěn)態(tài)所需的mtDNA拷貝數(shù)相對減少。

綜上所述，本研究證明大熊貓腸道脫落上皮細(xì)胞中mtDNA拷貝數(shù)隨著月齡的增加而減少，且減少速率逐漸放緩。無論老幼，拷貝數(shù)都存在著一個(gè)基本水平，反映了組織對線粒體發(fā)揮功能存在基本要求。此外，性別對于mtDNA拷貝數(shù)具有明顯的影響，同一生長階段的雄性比雌性更高。這些發(fā)現(xiàn)都為進(jìn)一步探究腸道上皮細(xì)胞mtDNA拷貝數(shù)與生長發(fā)育和衰老之間的關(guān)系，以及利用其作為指標(biāo)來評估機(jī)體的生理狀況提供了依據(jù)。同時(shí)，本研究以糞便為材料獲取腸道上皮細(xì)胞的機(jī)能狀態(tài)信息，為進(jìn)一步擴(kuò)大糞便的應(yīng)用范圍提供了范例。