劉忠學(xué),張渝竣,劉林,劉世家,田云錄,周時(shí)榮,江玲,萬建民,2,劉玲瓏*

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/江蘇省植物基因工程技術(shù)研究中心,江蘇 南京210095;2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所,北京100081)

水稻(Oryzasativa)是我國(guó)主要糧食作物之一,同時(shí)也是單子葉模式作物[1]。葉綠體是否正常發(fā)育和能否發(fā)揮功能對(duì)水稻的生長(zhǎng)發(fā)育起到重要作用。葉色突變體的發(fā)現(xiàn)為研究葉綠體代謝、發(fā)育和光合作用分子機(jī)制提供理想遺傳材料[2]。在水稻中發(fā)現(xiàn)了黃綠葉突變體yellow-greenleaf2(ygl2)[3]、yellow-greenleaf11t(ygl11t)[4]、yellow-greenleaf1(yg180)[5]、green-white-greenleaf(gwgl)[6],這些突變體的研究增加了對(duì)水稻光合作用和葉綠體發(fā)育的理解。

核黃素是一種水溶性維生素,可影響動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)的吸收和生長(zhǎng)及動(dòng)物對(duì)疾病的抵抗力[7-10];核黃素也可以消除植物中的活性氧[11]。核黃素在植物體內(nèi)的合成路徑已經(jīng)清晰,并且這些過程在所有植物體中都相似[12]。6,7-二甲基-8-核糖醇基二氧四氫蝶啶合酶(LS)催化核黃素合成反應(yīng)中5-氨基-6-核糖基氨基-2,4(1H,3H)-嘧啶二酮與3,4-二羥基-2-丁酮4-磷酸縮合產(chǎn)生6,7-二甲基-8-核糖醇[12]。LS基因的突變會(huì)導(dǎo)致核黃素在植物體內(nèi)的表達(dá)水平變化,進(jìn)而影響植株生長(zhǎng)、抗病性及眾多生理生化過程[13-14]。例如,在擬南芥中發(fā)現(xiàn)了CORONATINEINSENSITIVE1(COI1)抑制基因CONIDIOPHORESTALK-LESS1(COS1),其編碼一個(gè)LS基因,過表達(dá)COS1能恢復(fù)coi1突變體植物防御和衰老缺陷的表型[15]。但LS影響水稻葉色和葉綠體發(fā)育的作用還鮮有報(bào)道。

本研究從水稻品種‘中花11’中分離到1個(gè)黃綠葉突變體ygl4,在3葉期初期,ygl4葉片呈黃綠色表型,ygl4葉片光合色素含量降低,葉綠體發(fā)育受阻,突變性狀在整個(gè)生長(zhǎng)期均能保持。圖位克隆和測(cè)序分析表明候選基因?yàn)長(zhǎng)OC_Os04g42000。同時(shí),通過體外核黃素補(bǔ)充試驗(yàn)驗(yàn)證核黃素水平的恢復(fù)能彌補(bǔ)突變體的表型變化。這為研究該基因在水稻光色素合成中的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料和農(nóng)藝性狀調(diào)查

從水稻品種‘中花11’甲基磺酸乙酯(EMS)誘變突變體庫篩選到黃綠葉突變體ygl4。將突變體ygl4與秈稻品種‘N22’雜交,對(duì)F2代分離群體2 073個(gè)單株進(jìn)行遺傳分析,其中挑選表型與突變體一致的551個(gè)黃綠葉單株進(jìn)行基因定位。水稻種植于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)土橋?qū)嶒?yàn)基地,采用常規(guī)的田間栽培管理措施[16]。野生型和突變體大田種植采用完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì),每個(gè)小區(qū)均種植4行,每行10株,每個(gè)小區(qū)重復(fù)3次。在野生型和突變體成熟后,調(diào)查株高、分蘗數(shù)、穗長(zhǎng)、劍葉長(zhǎng)和寬等。在種子收獲期,調(diào)查枝梗數(shù)、結(jié)實(shí)率、每穗粒數(shù)、粒長(zhǎng)、粒寬、千粒重等農(nóng)藝性狀。每個(gè)性狀每個(gè)小區(qū)調(diào)查20株,計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。

1.2 葉綠體顯微結(jié)構(gòu)觀察

在野生型和突變體植株生長(zhǎng)至倒2葉期,分別取野生型和突變體完全白化部位、半黃化部位以及正常部位葉片。參考王致遠(yuǎn)等[16]的方法,用Hitachi H-7650透射電鏡對(duì)樣品進(jìn)行觀察和拍照。

1.3 不同溫度下葉綠素(Chl)和類胡蘿卜素(Car)含量測(cè)定

選取發(fā)育完好的野生型和突變體ygl4的種子各300粒,用清水浸種24 h,再于30 ℃培養(yǎng)箱中黑暗催芽12 h,挑選長(zhǎng)勢(shì)一致的種子分別于20、25、30 ℃恒溫光照培養(yǎng)箱培養(yǎng),每個(gè)溫度梯度野生型與突變體種子各50粒,光照/黑暗時(shí)間為16 h/8 h。10 d后準(zhǔn)確稱各溫度條件下野生型和突變體葉片各0.05 g,并剪成均勻塊狀,將其放入裝滿95%乙醇溶液的4 mL離心管中,在4 ℃條件下避光處理24 h,輕輕搖晃多次,使色素完全溶解。吸取200 μL上清液,采用酶標(biāo)儀分別測(cè)量665、649和470 nm波長(zhǎng)的吸光值。色素含量計(jì)算公式參照文獻(xiàn)[16]。

1.4 基因定位

突變體與秈稻品種‘N22’雜交得到F1種子,F1自交獲得F2種子。將F2代種子種植于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)土橋?qū)嶒?yàn)基地。在F2分離群體中挑選551個(gè)與ygl4表型一致的極端單株用于基因定位。使用CTAB法提取DNA[15],利用本實(shí)驗(yàn)室的SSR與Indel引物庫篩選均勻分布在水稻12條染色體,且多態(tài)性良好的138對(duì)標(biāo)記用于定位。選取10個(gè)與ygl4表型一致的單株進(jìn)行初步連鎖分析,將基因定位于N4-27和N4-33之間,根據(jù)Gramene(http://www.gramene.org/)數(shù)據(jù)庫‘日本晴’和‘93-11’序列,利用NCBI(https://www.ncbi.nlm. nih.gov/)設(shè)計(jì)分子標(biāo)記[15],將剩余的極端單株用于精細(xì)定位。新開發(fā)的用于精細(xì)定位引物見表1。

1.5 蛋白序列分析

通過NCBI網(wǎng)站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)下載YGL4以及同源蛋白氨基酸序列;通過 Pfam網(wǎng)站(http://pfam.xfam.org/)預(yù)測(cè)蛋白功能結(jié)構(gòu)域;通過BioXM(V2.6)軟件比對(duì)蛋白氨基酸序列。

1.6 實(shí)時(shí)定量PCR分析

分別取野生型和突變體植株倒2葉,剪碎并加入鋼珠,放進(jìn)2.0 mL離心管磨碎后用RNA prep pure Plant Kit(天根生化有限公司)提取葉片總RNA。RNA反轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)定量PCR均采用TaKaRa公司Super Script Ⅱ反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR?PremixExTaqTMKit,使用ABI prism 7500實(shí)時(shí)定量PCR系統(tǒng)。反應(yīng)體系參照文獻(xiàn)[15]。UBQ5(Ubiquitin)基因作為內(nèi)參,每個(gè)樣品3次重復(fù),采用2-ΔΔCT法進(jìn)行分析處理[16]。相關(guān)基因引物參照文獻(xiàn)[17]。

1.7 亞細(xì)胞定位

分別擴(kuò)增野生型YGL4與突變體ygl4全長(zhǎng)cDNA,然后拼接到含有CaMV35S啟動(dòng)子的瞬時(shí)表達(dá)載體pAN580中。原生質(zhì)體提取參照Livak等[18]的方法,載體轉(zhuǎn)化到水稻原生質(zhì)體參照Liu等[19]的方法。使用激光共聚焦顯微鏡(LSM780,Carl Zeiss,Germany)觀察GFP熒光信號(hào)定位情況。

1.8 核黃素互補(bǔ)試驗(yàn)

取野生型與突變體飽滿種子各200粒在清水中浸種36 h,置于30 ℃培養(yǎng)箱中黑暗催芽12 h,挑選長(zhǎng)勢(shì)一致的種子在20 ℃恒溫光照培養(yǎng)箱培養(yǎng),光照/黑暗時(shí)間為16 h/8 h。野生型和其中1份突變體用正常水澆灌,另1份突變體用5 mg·L-1核黃素溶液澆灌。待2葉1心期時(shí)觀察表型。

圖1 不同時(shí)期野生型(WT)和突變體ygl4的表型Fig.1 Phenotypes of wild type(WT)and mutant ygl4 at different stages A. 4葉期植株表型,比例尺為1 cm;B. 4葉期葉片表型,比例尺為0.5 cm;C.3葉期前田間植株表型;D.5葉期后田間植株葉色表型。A. The phenotypes of plants at four-leaf stage,bar=1 cm;B. The phenotypes of leaves at four-leaf stage,bar=0.5 cm;C. The phenotypes of plants at three-leaf stage in the field;D. The phenotypes of leaf color at five-leaf stage in the field.

2 結(jié)果與分析

2.1 突變體ygl4的表型觀察

與野生型相比,ygl4在2～3葉齡出現(xiàn)黃綠葉表型,之后略有緩解(圖1)。突變體秧苗在6月中下旬移栽大田后,黃綠葉表型更明顯(圖2-A),生長(zhǎng)后期(圖2-B)葉片白化部位約占全葉片總面積的50%,該性狀一直保持到全生育期(圖2-B)。相比野生型,ygl4的株高、穗長(zhǎng)、結(jié)實(shí)率、千粒重極顯著下降,有效分蘗數(shù)、劍葉長(zhǎng)寬、一次枝梗和二次枝梗數(shù)、每穗粒數(shù)均無明顯差異(表2)。

圖2 大田移栽后突變體ygl4的表型Fig.2 The phenotype of mutant ygl4 plants after transplanting into the fieldA. 移栽1周后ygl4的表型;B. 移栽12周后ygl4的表型。A. Phenotype of ygl4 in one week after transplanting into the field;B. Phenotype of ygl4 in 12 weeks after transplanting into the field.

表2 WT和ygl4農(nóng)藝性狀比較Table 2 Agronomic trait comparison of WT and ygl4

圖3 不同處理溫度下WT和ygl4的表型Fig.3 The phenotypes of WT and ygl4 under different treatment temperaturesA,D. 20 ℃;B,E. 25 ℃;C,F. 30 ℃. Bar=1 cm in Fig.A,B and C;Bar=0.5 cm in Fig.D,E and F.

2.2 突變體ygl4溫敏性分析

對(duì)野生型與突變體ygl4分別在20、25、30 ℃條件下進(jìn)行了溫敏性試驗(yàn)(圖3),測(cè)定葉片葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量(圖4)。結(jié)果顯示:突變體在20 ℃條件下黃化表型加重,且在20 ℃條件下突變體葉綠素a、葉綠素b及類胡蘿卜素含量相較于野生型顯著降低,而在25、30 ℃溫度條件下黃化表型以及葉綠素、類胡蘿卜素含量變化沒有20 ℃明顯,可見該基因受低溫誘導(dǎo),是一種低溫敏感型葉色突變體。

圖4 不同處理溫度下WT和ygl4的色素含量Fig.4 The pigment contents of WT and ygl4 under different treatment temperatures

圖5 WT和 ygl4 葉綠體超微結(jié)構(gòu)觀察Fig.5 Transmission electron microscopic observation of WT and ygl4 A—D. 野生型(A、B)正常部位對(duì)應(yīng)突變體(C、D)完全白化部位葉綠體超微結(jié)構(gòu);E—H. 野生型(E、F)正常部位對(duì)應(yīng)突變體(G、H)半黃化部位葉綠體超微結(jié)構(gòu);I—L. 野生型(I、J)正常部位對(duì)應(yīng)突變體(K、L)正常綠色部位葉綠體超微結(jié)構(gòu)。圖A、C、E、G、I、K 比例尺為 2 μm;圖B、D、F、H、J、L比例尺為1 μm。CP:葉綠體;Thy:類囊體片層;OB:嗜鋨體。A-D. Transmission electron microscopic observation of the chloroplasts in the fully albino part of mutants(C,D)corresponding to the normal part of wild type(A,B);E-H. Transmission electron microscopic observation of the chloroplasts in the semi yellowing part of mutants(G,H)corresponding to the normal part of wild type(E,F);I-L. Transmission electron microscopic observation of the chloroplasts in the normal green part of wild-type(I,J)corresponding mutants(K,L). Bar in Fig.A,C,E,G,I and K is 2 μm;Bar in Fig.B,D,F,H,J,L is 1μm. CP:Chloroplast;Thy:Thylakoid lamellar;OB:Osmiophilic body.

2.3 突變體ygl4葉綠體超微結(jié)構(gòu)觀察

分別取野生型與突變體ygl4正常部位、半黃化部位(正常與白化部位過渡區(qū))、完全白化部位,對(duì)葉綠體超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察。結(jié)果表明,相比于野生型,ygl4完全白化部位葉片細(xì)胞葉綠體結(jié)構(gòu)已完全損壞分解,并且葉片細(xì)胞內(nèi)除細(xì)胞核外所有的細(xì)胞器都已被破壞(圖5-A—D)。野生型與突變體半黃化部位葉片細(xì)胞葉綠體超微結(jié)構(gòu)無差異(圖5-E—H)。野生型與ygl4正常綠色部位葉片細(xì)胞葉綠體超微結(jié)構(gòu)也基本無差異(圖5-I—L)。

2.4 突變體ygl4的圖位克隆

圖6 ygl4的精細(xì)定位及候選基因分析Fig.6 Fine mapping and candidate gene analysis of ygl4 A. 初步定位:利用37個(gè)黃綠葉單株,將區(qū)間定位在L24與L7之間;B. 攜帶ygl4的細(xì)菌人工染色體(BAC);C. 精細(xì)定位:利用551個(gè)黃綠葉單株,將區(qū)間定位在VF0424697147與VF04245874之間;D. 基因預(yù)測(cè)。A. Preliminary mapping:the interval is mapped between L24 and L7 using 37 yellow-green plants;B. Bacterial artificial chromosome(BAC)harboring ygl4;C. Fine mapping:551 yellow-green plants are used to map the gene interval between VF0424697147 and VF04245874;D. Gene prediction.

2.5 YGL4蛋白序列分析

將ygl4基因序列輸入NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)網(wǎng)站中查找其在其他物種中的同源基因。包括水稻(XP_015637168.1)、大麥(KAE_8767088.1)、玉米(NP_001356459.1)、高粱(OQU_91117.1)、粟(XP_004976101.1)、黍(XP_025824687.1)、大麻(XP_030507524.1)、狗尾草(XP_034604013.1)。蛋白序列比對(duì)分析(圖7)表明,在N端信號(hào)肽處各種植物的氨基酸序列保守性較差,而在C端的氨基酸序列則基本相似,保守性較高。表明突變體ygl4的單個(gè)氨基酸變化發(fā)生在一個(gè)高度保守區(qū)域。

圖7 YGL4同源蛋白序列比對(duì)Fig.7 Alignment of related proteins for YGL4 保守的氨基酸序列在共有序列中用紅色方框標(biāo)出;紅色三角標(biāo)出的是突變體ygl4氨基酸突變位點(diǎn);比較序列分別來自水稻(XP_015637168.1)、大麥(KAE_8767088.1)、玉米(NP_001356459.1)、高粱(OQU_91117.1)、粟(XP_004976101.1)、黍(XP_025824687.1)、大麻(XP_030507524.1)、狗尾草(XP_034604013.1)。Conserved amino acid sequences are marked in red in the common sequence;The red triangulated line is the site of the ygl4 amino acid mutation;The comparison sequences are respectively from Oryza sativa(XP_015637168.1),Hordeum vulgare(KAE_8767088.1),Zea mays(NP_001356459.1),Sorghum bicolor(OQU_91117.1),Setaria italica(XP_004976101.1),Panicum hallii(XP_025824687.1),Cannabis sativa(XP_030507524.1),Setaria viridis(XP_034604013.1).

圖8 在20 ℃條件下突變體ygl4外施核黃素的植株(A)和葉片(B)表型Fig.8 Phenotypes of plant(A)and leaf(B)of mutant ygl4 treated with riboflavin at 20 ℃野生型(WT)(左)、外施核黃素處理的突變體(ygl4)(中)和未處理的突變體(ygl4)(右)。比例尺為1 cm。Wild-type(WT)(left),riboflavin-treated mutant ygl4(middle),and untreated mutant ygl4(right). Bar=1 cm.

2.6 突變體ygl4外施核黃素互補(bǔ)分析

為了證實(shí)LS基因就是YGL4突變基因,對(duì)突變體ygl4進(jìn)行外施核黃素處理,以驗(yàn)證核黃素水平的恢復(fù)是否能彌補(bǔ)突變體ygl4的葉色表型變化。從結(jié)果(圖8)可以看出,外施的核黃素的突變體ygl4苗期黃綠葉表型消失,顏色變?yōu)榕c正常野生型一致。因此推測(cè)該LS基因就是YGL4基因。

2.7 YGL4細(xì)胞定位

利用水稻的原生質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)化系統(tǒng)對(duì)YGL4進(jìn)行亞細(xì)胞定位檢測(cè)(圖9)。發(fā)現(xiàn)該基因定位于葉綠體,呈點(diǎn)狀分布,并且在突變體中同樣定位在葉綠體中。這與前人預(yù)測(cè)的植物核黃素合成都主要發(fā)生于葉綠體的結(jié)論一致[20]。表明其基因N端信號(hào)肽雖在各種植物中同源性較低,但功能類似,都能將該基因的表達(dá)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到葉綠體。

圖9 YGL4亞細(xì)胞定位Fig.9 Subcellular localization of the YGL4

2.8 突變體ygl4葉綠素生物合成相關(guān)基因定量分析

從20 ℃光照培養(yǎng)箱中選取長(zhǎng)勢(shì)一致的3葉期野生型和突變體ygl4植株,黑暗處理3 h,再對(duì)葉片進(jìn)行葉綠素生物合成相關(guān)基因定量分析(圖10)。結(jié)果發(fā)現(xiàn):CAO、DVR和POR等參與葉綠素合成光反應(yīng)階段的基因表達(dá)水平在ygl4中明顯下調(diào),而HEMA、HEML、HEMC、HEME、HEMF等參與葉綠素合成暗反應(yīng)階段的基因表達(dá)水平在ygl4中上調(diào)。這些結(jié)果表明突變體ygl4葉綠體發(fā)育受損與基因表達(dá)密切相關(guān)。

圖10 WT與ygl4中葉綠素生物合成相關(guān)基因定量分析Fig.10 Quantitative analysis of genes associated with chlorophyll biogenesis in WT and ygl4 HEMA:谷氨酰t-RNA還原酶基因 Glutamyl t-RNA reductase gene;HEML:谷氨酸-1-半醛轉(zhuǎn)氨酶基因Glutamate-1-semialdehyde-2,1-aminomutase gene;HEMB:膽色素原合酶基因 Porphobilinogen synthase gene;HEMC:羥甲基后膽色素原合酶基因 Hydroxymethylbilane synthase gene;HEME:尿卟啉原脫羧酶基因 Uroporphyrinogen Ⅲ decarboxylase gene;HEMF:糞卟啉原氧化脫羧酶基因 Coproporphyrinogen Ⅲ oxidase gene;CHLH:鎂螯合酶H亞基基因 Mg-chelatase subunit H gene;CHLI:鎂螯合酶Ⅰ亞基基因Mg-chelatase subunitⅠgene;CHLM:鎂原卟啉IX甲基轉(zhuǎn)移酶基因Mg-protoporphyrin Ⅸ methyltransferase gene;CRD:鎂原卟啉原IX單甲酯環(huán)化酶基因Mg-protoporphyrin Ⅸ monomethyl ester(oxidative)cyclase gene;DVR:二乙烯基還原酶基因Divinyl reductase gene;POR:原葉綠素酸氧化還原酶基因 Protochlorophyllide oxidoreductase gene;CHELG綠素合酶G亞基基因 Mg-chelatase subunit G gene;CAO:葉綠素a氧化酶基因Chlorophyll a oxygenase gene.

3 討論

ygl4是一個(gè)低溫誘導(dǎo)突變體,在20 ℃培養(yǎng)箱中呈黃綠色,在25和30 ℃時(shí)與野生型相似,葉綠素含量?jī)H在20 ℃時(shí)表現(xiàn)不同。在稻田生長(zhǎng)環(huán)境下,ygl4在2～3葉齡時(shí)表現(xiàn)出不規(guī)則的黃綠色葉片癥狀,葉片嚴(yán)重部位表現(xiàn)出白化表型,突變性狀在整個(gè)生育期都能保持,直到種子成熟。缺乏鐵氧還蛋白-NADP(H)還原酶的煙草植株由于系統(tǒng)PET鏈被破壞和光合氧化還原的不平衡,表現(xiàn)出黃綠色表型[21]。因此,突變體在野外比在培養(yǎng)箱中更嚴(yán)重的白化表型可能是由光氧化作用造成的。

圖位克隆YGL4基因結(jié)果表明其編碼6,7-二甲基-8-核糖醇基二氧四氫蝶啶合酶(LS)。LS催化植物、真菌和微生物中核黃素(維生素B2)生物合成的倒數(shù)第2步[22],它是核黃素合成途徑的關(guān)鍵成分。核黃素是核黃素單磷酸和黃素腺嘌呤二核苷酸輔酶的前體,核黃素途徑產(chǎn)生的黃酮酶被發(fā)現(xiàn)在所有細(xì)胞中都是不可缺少的氧化還原輔助因子,如在DNA光修復(fù)、光敏感和生物發(fā)光等多種途徑發(fā)揮作用[23]。由于核黃素途徑對(duì)多種重要的細(xì)胞過程是必不可少的,完全消除核黃素途徑將導(dǎo)致營(yíng)養(yǎng)缺陷表型,并可能影響植物的生長(zhǎng)。在突變體ygl4中,突變蛋白中的氨基酸替換減弱了核黃素的合成,但并沒有完全破壞這一途徑,結(jié)果驗(yàn)證了這一結(jié)論。

YGL4亞細(xì)胞定位于葉綠體內(nèi),呈現(xiàn)點(diǎn)狀分布。由于其點(diǎn)狀分布的不均勻性,猜測(cè)其精細(xì)定位在葉綠體的內(nèi)囊體中。透射電鏡觀察的結(jié)果顯示突變體ygl4葉色變化的可能機(jī)制是提前衰老,因此推測(cè)YGL4基因?qū)е氯~色變化的可能機(jī)制是突變體中LS基因表達(dá)異常,致使體內(nèi)核黃素含量下降,導(dǎo)致ALA在黑暗環(huán)境下異常持續(xù)合成所帶來的原葉綠素酸酯過多積累,使細(xì)胞受損、衰老及葉綠體提前降解,從而導(dǎo)致葉色變黃,甚至白化。

水稻作為單子葉模式植物,通常為其他作物基因功能研究提供借鑒。本文在水稻中發(fā)現(xiàn)LS基因和葉綠體發(fā)育密切相關(guān),但該基因在其他單子葉植物中的作用仍有待進(jìn)一步研究。

致謝:農(nóng)業(yè)部長(zhǎng)江中下游粳稻生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、長(zhǎng)江流域雜交水稻協(xié)同創(chuàng)新中心、現(xiàn)代作物生產(chǎn)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心、江蘇南京水稻種質(zhì)資源國(guó)家野外科學(xué)觀測(cè)研究站、南方粳稻研究院(公司)給予本研究支持,謹(jǐn)致謝意。