紀(jì)偉霞，胡傳活，馬祺琦，何芝鳳，黃 芳，汪燕玲

(1.廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧 530004；2.廣西壯族自治區(qū)畜牧研究所，廣西南寧 530001)

在醫(yī)學(xué)臨床上，有不少人工體外表達(dá)的融合蛋白被應(yīng)用于疾病的治療，起到了改善患者臨床癥狀的作用。這些融合蛋白中，F(xiàn)NK蛋白是一種人工構(gòu)建的細(xì)胞保護(hù)蛋白，來(lái)源于大鼠Bcl-xL蛋白；PTD是自身具有跨膜活性的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，能將與其通過(guò)化學(xué)交聯(lián)或基因工程連接的外源物質(zhì)包括大分子、藥物等帶進(jìn)細(xì)胞。將PTD與FNK結(jié)合獲得的PTD-FNK蛋白，其穿透細(xì)胞的能力很強(qiáng)，對(duì)各種異常刺激引起的凋亡與壞死細(xì)胞具有保護(hù)作用，對(duì)各種類(lèi)型細(xì)胞受到的多種損害刺激具有良好的防御作用。這種組織細(xì)胞保護(hù)作用目前已經(jīng)在人的臨床治療上被廣泛應(yīng)用，但關(guān)于 PTD-FNK 蛋白的作用機(jī)理尚不清楚。本試驗(yàn)通過(guò)生物信息學(xué)技術(shù)并結(jié)合互作蛋白方法，研究 PTD-FNK 蛋白在細(xì)胞凋亡、精子發(fā)生過(guò)程中的作用，以期為進(jìn)一步探究PTD-FNK蛋白的功能提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

PTD-FNK蛋白基因序列由廣西大學(xué)動(dòng)物解剖實(shí)驗(yàn)室重組構(gòu)建并測(cè)序。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)分析 利用Expasy中Protparam(https：//web.expasy.org/protparam)分析PTD-FNK蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量、理論等電點(diǎn)、不穩(wěn)定指數(shù)等理化性質(zhì)。

1.2.2 蛋白親疏性分析 利用ProtScale(https：//web.expasy.org/protscale/)在線工具Kyte & Doolittle進(jìn)行分析。

1.2.3 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 利用SOPMA(https：//prabi.ibcp.fr/htm/site/web/login/SOPMA)進(jìn)行預(yù)測(cè)，分析無(wú)規(guī)律卷曲、α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角和延伸鏈的比例。

1.2.4 蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)建模 利用SWISS-MODEL(http：//www.swissmodel.expasy.org/)在線軟件進(jìn)行分析。

1.2.5 蛋白亞細(xì)胞定位 利用WoLF PSORT(http：//wolfpsort.hgc.jp/)在線軟件進(jìn)行定位。

1.2.6 蛋白的跨膜區(qū)分析 利用TMHMM Server 2.0(http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM)在線軟件進(jìn)行分析。

1.2.7 蛋白的信號(hào)肽分析 利用SignalP 5.0(http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)分析。

1.2.8 蛋白翻譯后修飾位點(diǎn) 利用NetGlyc(http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetGlyc/)在線軟件分析-糖基化位點(diǎn)；利用YingOYang(http：//www.cbs.dtu.dk/services/YingOYang)在線軟件分析-糖基化位點(diǎn)；利用NetPhos 3.1 Server(http：www.cbs.dtu./dk/services/NetPhos/)在線軟件預(yù)測(cè)磷酸化位點(diǎn)(閾值都為0.5)。

1.2.9 蛋白抗原表位分析 利用Predicting Antigenic Peptides(http：//imed.med.ucm.es/Tools/antigenic.p-l)預(yù)測(cè)分析抗原決定簇(閾值為0.5)；利用IEDB(http：//tools.im-muneepitope.org/bcell/)預(yù)測(cè)分析B細(xì)胞抗原表位(閾值為0.5)。

1.2.10 功能結(jié)構(gòu)域分析 利用NCBI的保守域數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.2.11 蛋白的互作蛋白分析 為了研究PTD-FNK蛋白在豬睪丸支持細(xì)胞中的互作蛋白質(zhì)，于2020年6—10月選取廣西省南寧市各豬場(chǎng)2周齡左右仔豬，無(wú)菌操作摘取其睪丸，用生理鹽水沖洗，低溫送至實(shí)驗(yàn)室后，立即分離培養(yǎng)支持細(xì)胞；送往武漢金開(kāi)瑞生物工程有限公司，利用HIS Pulldown技術(shù)拉取PTD-FNK蛋白未知的互作蛋白，得到的蛋白序列號(hào)利用UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)分析排名靠前蛋白的結(jié)構(gòu)、功能和序列。

2 結(jié)果與分析

2.1 PTD-FNK蛋白理化性質(zhì)

利用在線軟件ProtParam分析了PTD-FNK蛋白氨基酸序列組成和理化性質(zhì)。由表1可知，該蛋白質(zhì)共含有295個(gè)氨基酸，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為 33.195 ku，理論等電點(diǎn)為6.63，為酸性蛋白質(zhì)，分子式為CHNOS，包含20種氨基酸。其中，占比最高的是絲氨酸，占比為10.2%；最低的是半胱氨酸，占比為0.3%。帶負(fù)電荷數(shù)(天冬氨酸+谷氨酸)為35個(gè)，帶正電荷數(shù)(精氨酸+賴氨酸)32個(gè)。軟件分析結(jié)果顯示，PTD-FNK蛋白消光系數(shù)為47 440，蛋白質(zhì)不穩(wěn)定指數(shù)為42.33(>40)，為不穩(wěn)定蛋白，脂肪系數(shù)為64.81，預(yù)計(jì)蛋白在體外哺乳動(dòng)物類(lèi)網(wǎng)狀紅細(xì)胞中的半衰期為30 h，在酵母體內(nèi)的半衰期>20 h，在大腸桿菌體內(nèi)的半衰期>10 h。PTD-FNK蛋白親疏性分析結(jié)果顯示，親水性平均值(grand average of hydropathicity，簡(jiǎn)稱GRAVY)是-0.589(<0)，為親水性蛋白質(zhì)。

表1 PTD-FNK蛋白的氨基酸組成

2.2 PTD-FNK蛋白親水、疏水性

利用ProtScale在線預(yù)測(cè)PTD-FNK蛋白的親、疏水性，結(jié)果見(jiàn)圖1。疏水區(qū)最大值為第269位氨基酸，為2.533，親水區(qū)最小值為第43位氨基酸，值為-4.256，平均疏水性(GRAVY)值為-0.589，為親水性蛋白質(zhì)，此結(jié)果與ProtParam預(yù)測(cè)結(jié)果相一致。

2.3 PTD-FNK蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)

由圖2可知，PTD-FNK蛋白有116個(gè)氨基酸參與無(wú)規(guī)則卷曲，占比為39.32%，有132個(gè)氨基酸參與α-螺旋，占比44.75%，有28個(gè)氨基酸參與延伸鏈的構(gòu)成，占比為9.49%，有19個(gè)氨基酸參與 β-轉(zhuǎn)角，占比為6.44%。

2.4 PTD-FNK的三級(jí)結(jié)構(gòu)

由圖3可知，PTD-FNK蛋白三維模型主要由無(wú)規(guī)卷曲和α-螺旋組成，QMEAN(qualitative model energy analysis)值為-1.27，與Bcl-2同源性為98.71%，與參考蛋白模板匹配性較高，肽段覆蓋性相似度較高。

2.5 PTD-FNK蛋白亞細(xì)胞定位

PTD-FNK的亞細(xì)胞定位分?jǐn)?shù)分別為細(xì)胞核21，線粒體5，細(xì)胞質(zhì)膜4，過(guò)氫物酶體 2。定位分?jǐn)?shù)顯示PTD-FNK定位在動(dòng)物細(xì)胞細(xì)胞核中。

2.6 PTD-FNK蛋白的跨膜區(qū)

由圖4可知，PTD-FNK蛋白有1條跨膜螺旋區(qū)，位于260～277位。

2.7 PTD-FNK蛋白的信號(hào)肽

利用SignalP-5.0軟件實(shí)現(xiàn)的PTD-FNK蛋白信號(hào)肽分析方法，利用綜合剪切點(diǎn)分值的最大值來(lái)估計(jì)信號(hào)肽的正確剪切位置，并通過(guò)信號(hào)肽分值(值>0.5)來(lái)確定蛋白質(zhì)是否為分泌蛋白質(zhì)。由圖 5可知，第28位氨基酸值最大值為0.113，值第1～16位氨基酸的平均值為0.139(<0.5)，說(shuō)明PTD-FNK蛋白不具有分泌信號(hào)肽的特征，因此進(jìn)行蛋白原核表達(dá)前不需要對(duì)該蛋白進(jìn)行修飾。值與值均小于閾值0.5，預(yù)測(cè)該蛋白沒(méi)有信號(hào)肽結(jié)構(gòu)。

2.8 PTD-FNK蛋白的翻譯后修飾位點(diǎn)

由圖6可知，PTD-FNK蛋白有7個(gè)潛在的-糖基化位點(diǎn)，分別位于第3、4、11、119、153、165、211氨基酸。由圖7可知，PTD-FNK蛋白有3個(gè)潛在的N-糖基化修飾位點(diǎn)，分別位于第73位、80位、101位氨基酸。由圖8可知，PTD-FNK蛋白含有23個(gè)絲氨酸磷酸化修飾位點(diǎn)、2個(gè)酪氨酸磷酸化修飾位點(diǎn)、8個(gè)蘇氨酸磷酸化修飾位點(diǎn)，包含有PKC、PKA、PKG、UNSP、P38MAPK、RSK、ATM、CKI、CKII、CDC2、GSK3、DNAPK、INSR總共13類(lèi)蛋白質(zhì)激酶結(jié)合位點(diǎn)。

2.9 PTD-FNK蛋白抗原表位

由圖9可知，利用Predicting Anti-genic Peptides軟件分析發(fā)現(xiàn)，PTD-FNK蛋白有8個(gè)潛在的抗原決定簇；利用IEDB軟件分析B細(xì)胞抗原表位發(fā)現(xiàn)，連續(xù)氨基酸數(shù)量超過(guò)10個(gè)的B細(xì)胞抗原表位有3個(gè)，分別是：5～55、61～131、232～259位氨基酸。

2.10 功能結(jié)構(gòu)域分析

利用NCBI的數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行功能結(jié)構(gòu)域分析，結(jié)果顯示，PTD-FNK參與了細(xì)胞程序化死亡。由圖10可見(jiàn)，PTD-FNK在第48～280位氨基酸處含有保守結(jié)構(gòu)域Bcl-2，該結(jié)構(gòu)域?qū)儆贐cl-2超家族，因此PTD-FNK蛋白通過(guò)Bcl-2保守結(jié)構(gòu)域起到抑制細(xì)胞凋亡的作用。

2.11 PTD-FNK蛋白的互作蛋白

通過(guò)HIS pull-down技術(shù)拉取PTD-FNK未知互作蛋白，由圖11可知，對(duì)照組識(shí)別到了25個(gè)蛋白，加入PTD-FNK蛋白的試驗(yàn)組識(shí)別到了58個(gè)蛋白，其中2個(gè)組別共同檢測(cè)到了17個(gè)蛋白。排名靠前的有78 ku葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白、波形蛋白、組蛋白、肌球蛋白、肌動(dòng)蛋白、絨毛蛋白-1、角蛋白、微管蛋白β鏈等，見(jiàn)表2。

表2 PTD-FNK蛋白的互作蛋白信息

3 討論與結(jié)論

Bcl-xL屬于Bcl-2家族中的抗凋亡蛋白成員之一，在細(xì)胞凋亡途徑中起著極大的作用。它是從禽類(lèi)的DNA互補(bǔ)文庫(kù)中被發(fā)現(xiàn)的，具有降低細(xì)胞凋亡和壞死過(guò)程的功能。然而B(niǎo)cl-xL一旦被磷酸化，將促進(jìn)細(xì)胞凋亡活性，抑制其治療功效。因此，超級(jí)抗凋亡因子FNK是Asoh等通過(guò)定點(diǎn)突變大鼠Bcl-xL蛋白的3個(gè)氨基酸(22酪氨酸Y→苯丙氨酸 F、26谷氨酰胺Q→天冬酰胺N和165精氨酸R→賴氨酸K)構(gòu)建。PTD是蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，它的特點(diǎn)是轉(zhuǎn)導(dǎo)速度極快、在轉(zhuǎn)運(yùn)的過(guò)程中不需要消耗能量和具有廣譜性等。將PTD與FNK二者結(jié)合獲得的PTD-FNK蛋白，能快速轉(zhuǎn)入細(xì)胞?，F(xiàn)已證明，PTD-FNK蛋白可以提高冷凍豬、水牛精子的活性，可能是通過(guò)抑制內(nèi)源性線粒體途徑介導(dǎo)的凋亡發(fā)揮對(duì)豬精子冷凍解凍的保護(hù)作用。大多試驗(yàn)是關(guān)于PTD-FNK蛋白功能方面的研究，關(guān)于其作用機(jī)制的研究及PTD-FNK蛋白與其他蛋白之間的聯(lián)系鮮有研究，本試驗(yàn)旨在探討PTD-FNK是否可能通過(guò)自身機(jī)理或與其他蛋白結(jié)合調(diào)控細(xì)胞凋亡、細(xì)胞損傷和應(yīng)急過(guò)程。

預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，PTD-FNK蛋白是一類(lèi)化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定、酸性強(qiáng)的小分子結(jié)構(gòu)親水性蛋白質(zhì)。PTD-FNK蛋白的二級(jí)分子結(jié)構(gòu)中無(wú)規(guī)則卷曲含量較高，因此易于研發(fā)抗體；此外，在無(wú)規(guī)則卷曲的蛋白質(zhì)肽鏈中，形成了配體和受體結(jié)合的部位，其結(jié)構(gòu)易受側(cè)鏈影響而發(fā)生改變，表明PTD-FNK可能存在著較多的抗原表位，針對(duì)疫苗問(wèn)題相關(guān)有待進(jìn)一步研究。PTD-FNK可能具有跨膜區(qū)域和多個(gè)翻譯后的修飾位點(diǎn)，推斷該蛋白質(zhì)是具有不同修飾表型的跨膜蛋白。而PTD-FNK蛋白存在與激酶磷酸化相關(guān)的PKA、PKC、P38MAPK 等特異性位點(diǎn)，影響線粒體凋亡途徑釋放出CytC，激活Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)抑制細(xì)胞凋亡。

互作蛋白鑒定結(jié)果顯示，排名靠前的有波形蛋白、肌動(dòng)蛋白、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78、組蛋白、肌球蛋白、絨毛蛋白-1、角蛋白等。肌球蛋白介入細(xì)胞的吞噬、運(yùn)動(dòng)、受精和物質(zhì)運(yùn)輸?shù)壬磉^(guò)程；可以推測(cè)在睪丸支持細(xì)胞中，PTD-FNK蛋白可與該功能的蛋白結(jié)合，迅速進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，參與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、受精等過(guò)程。葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(78-ku glucose-regulated protein，GRP 78)是熱休克蛋白70家族的成員之一，也被稱為免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白，是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中重要的一種分子伴侶，主要定位和表達(dá)于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器，具有抑制細(xì)胞調(diào)亡的作用。大量表達(dá)的GRP78可在低糖、低氧、低Ca等刺激環(huán)境下起到維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)定進(jìn)而保護(hù)細(xì)胞的作用，GRP78過(guò)表達(dá)使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未折疊蛋白疊加，導(dǎo)致氧糖失衡、鈣超載、氧化應(yīng)激和低氧環(huán)境等，最終引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激?？梢酝茢郟TD-FNK蛋白與GRP78結(jié)合通過(guò)調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，減少睪丸支持細(xì)胞非正常凋亡。組蛋白在DNA損害過(guò)程有重要的調(diào)節(jié)作用。DNA損傷后組蛋白被釋放至細(xì)胞質(zhì)，并轉(zhuǎn)位于線粒體，通過(guò)激活BAK蛋白，促進(jìn)CytC釋放并啟動(dòng)線粒體途徑的細(xì)胞凋亡，推測(cè)PTD-FNK蛋白可抑制線粒體釋放CytC等凋亡相關(guān)蛋白，抑制凋亡發(fā)生。絨毛蛋白-1是一種細(xì)胞骨架蛋白，參與肌動(dòng)蛋白成核、肌動(dòng)蛋白絲束組裝等過(guò)程，參與細(xì)胞侵襲和細(xì)胞凋亡等過(guò)程。研究表明，波形蛋白是睪丸支持細(xì)胞的骨架成分，在維持支持細(xì)胞的不對(duì)稱型形態(tài)、生精細(xì)胞的排列整齊、支持細(xì)胞和生精細(xì)胞間的信息溝通、精子成熟和釋放、血睪屏障的完整性等方面具有重要作用，主要參與脂多糖的細(xì)胞反應(yīng)，任何影響波形蛋白表達(dá)、分布、結(jié)構(gòu)、降解的因素都將影響支持細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能，進(jìn)而干預(yù)精子的發(fā)生，證明PTD-FNK蛋白會(huì)保護(hù)新生睪丸的生精細(xì)胞脫落，減少少精子癥。

PTD-FNK蛋白通過(guò)PKA、PKC特異性蛋白激酶結(jié)合位點(diǎn)參與蛋白酪氨酸磷酸化，介導(dǎo)線粒體細(xì)胞凋亡途徑；PTD-FNK蛋白通過(guò)蛋白間的結(jié)合，調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、線粒體凋亡途徑抑制細(xì)胞凋亡并減少少精子癥。本試驗(yàn)為PTD-FNK蛋白在細(xì)胞凋亡過(guò)程、精子發(fā)生過(guò)程的作用機(jī)制提供了依據(jù)。