劉曉紅，劉柳青青，栗敏，劉強，曹東東，鄭浩, ，羅先香, *

1.中國海洋大學(xué)近海環(huán)境污染控制研究所/海洋環(huán)境與生態(tài)教育部重點實驗室，山東 青島 266100；2.青島海洋科學(xué)與技術(shù)國家實驗室海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)功能實驗室，山東 青島 266071

微塑料（Microplastics，MPs）指尺寸小于5 mm的塑料纖維、顆粒和碎片等（Thompson et al.，2004；Xu et al.，2020）。MPs廣泛存在于農(nóng)田土壤中。例如，智利大都會地區(qū)農(nóng)田土壤中 MPs豐度范圍為600—10400 ind·kg-1（Corradini et al.，2019），韓國中西部地區(qū)農(nóng)田土壤中MPs豐度范圍為10—7630 ind·kg-1（Kim et al.，2021）。中國山東壽光農(nóng)田土壤中MPs豐度范圍為310—5698 ind·kg-1（Yu et al.，2021），陜西省19個市縣農(nóng)田土壤中MPs豐度范圍為 1430—3410 ind·kg-1（Ding et al.，2020），云南滇池南部柴河流域農(nóng)田土壤中 MPs豐度高達7100—42960 ind·kg-1（Zhang et al.，2018）。

農(nóng)業(yè)地膜是農(nóng)田土壤中MPs主要的來源之一，其低的回收率和難降解性導(dǎo)致 MPs在農(nóng)田土壤中廣泛殘留（Qi et al.，2020）。2020年，中國農(nóng)用地膜使用量高達135.7×104t，約占世界總量的70%（靳拓等，2020；中國農(nóng)村統(tǒng)計年鑒委員會，2021）。農(nóng)用地膜的主要成分為聚乙烯（Polyethylene，PE）和聚氯乙烯（Polyvinyl chloride，PVC），其中，PE占比高達60%左右（Ren et al.，2021）。由于塑料的降解周期長并含有多種化學(xué)添加劑，MPs已成為土壤生態(tài)系統(tǒng)中的持久性有害物質(zhì)（Ren et al.，2021），對植物生長產(chǎn)生影響。MPs對植物的影響與植物類型、MPs的種類、粒徑和濃度有關(guān)。例如，在同一植物群落中，添加量0.4%的聚酯纖維微塑料顯著促進了拂子茅（Calamagrostisepigeios(L.) Roth）的生長，但絨毛草（HolcuslanatusL.）的生長受到顯著抑制（Lozano et al.，2020）。野胡蘿卜（DaucuscarotaL.）隨著聚醚砜、聚酰胺和聚丙烯纖維微塑料的質(zhì)量分數(shù)從0.1%增加到0.4%，其生物量隨之增加，但隨著聚酯和聚丙烯薄膜微塑料質(zhì)量分數(shù)的增加其生物量隨之降低（Lozano et al.，2021）；粒徑 200—250 μm的PE，在0.5%—2%暴露質(zhì)量分數(shù)范圍內(nèi)，小麥（TriticumaestivumL.）地上部鮮重隨著微塑料濃度的增加而增加，而在2%—8%的范圍內(nèi)地上部鮮重隨著微塑料質(zhì)量分數(shù)的增加而減?。↙iu et al.，2021）。一種粒徑為 50、500、4800 nm，103—107plastics·mL-1的綠色熒光塑料顆粒顯著降低了英菜（LepidiumSativumL.）的發(fā)芽率，且隨著粒徑的增加抑制作用增強（Bosker et al.，2019）；在質(zhì)量分數(shù)為1%的MPs暴露下，片狀PE（6.92 mm×6.10 mm）顯著降低了小麥根生物量，而顆粒狀PE（粒徑為0.05—1 mm）對小麥根生物量無顯著影響（Qi et al.，2018）。綜上所述，MPs的類型、粒徑和濃度均會影響植物的生長，但其交互作用對植物的生長的影響并不清楚。

本文選取2種典型農(nóng)作物主糧玉米（ZeamaysL.）和蔬菜黃瓜（CucumissativusL.）作為供試植物，探究3種粒徑的PE在不同濃度下對2種植物種子發(fā)芽、幼苗生長和根系形態(tài)的影響，探討了PE粒徑、濃度和二者的交互作用對農(nóng)作物生長的潛在影響，以期為微塑料對農(nóng)作物的生態(tài)評價毒性效應(yīng)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗用 MPs為廣泛用于制備農(nóng)業(yè)地膜原料的聚乙烯微塑料顆粒。3種PE的平均粒徑分別為13、58和178 μm，分別命名為PE13、PE58和PE178。供試玉米品種為丹玉86號，黃瓜品種為盛達3號。

實驗土壤為山東省招遠市（37.43N，120.33E）農(nóng)田表層土（0—20 cm）。土壤樣品經(jīng)自然風(fēng)干，剔除石塊和植物殘渣等雜質(zhì)，磨碎過2 mm不銹鋼篩備用。土壤pH為4.98，總氮含量為0.17%，總碳含量為1.37%。

1.2 微塑料的表征

掃描電鏡（Jeol7610F）分析PE顆粒的表面形態(tài)結(jié)構(gòu)特征，X射線光電子能譜儀（XPS，Thermo Scientific K-Alpha，美國）測定表面元素含量。

PE顆粒和水按1∶20質(zhì)量比在40 mL頂空瓶中進行添加劑浸出實驗。頂空瓶置于震蕩箱 25 ℃黑暗條件以 150 r·min-1震蕩 7 d，溶液過 0.45 μm 聚四氟乙烯膜，保存濾液備用（Luo et al.，2019）。pH計法測定濾液pH，TOC分析儀（Elementar TOC-Vcpn，Shimadzu，日本）測定濾液溶解有機碳含量（DOC），電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（NexION 350，PerkinElmer，美國）分析濾液重金屬含量。

1.3 種子發(fā)芽實驗

將顆粒均勻飽滿的玉米和黃瓜種子浸泡在 3%H2O2溶液中消毒30 min，使用絹布分離出種子，蒸餾水沖洗 3次后置于飽和 CaSO4溶液中浸泡 12 h后備用。處理好的種子置于直徑為90 mm培養(yǎng)皿內(nèi)以去離子水為基質(zhì)進行發(fā)芽試驗。發(fā)芽試驗中 PE設(shè)置5個質(zhì)量分數(shù)梯度，分別為0、0.1%、0.5%、1%和2%，3種粒徑PE，每種植物15個處理，每個處理4個重復(fù)。每皿10粒種子，每粒種子之間的間距大于1 cm（Yang et al.，2005）。培養(yǎng)皿置于(25±1) ℃的恒溫培養(yǎng)箱中，黑暗培養(yǎng)7 d，每天補水保持水分恒定。第7天用直尺測定芽長、根長并計算種子的發(fā)芽率RG、發(fā)芽勢PG和種子活力指數(shù)IV（Lian et al.，2020；王波，2018）。

式中：

Nm——日發(fā)芽種子數(shù)最大時的發(fā)芽數(shù)；

NG——萌發(fā)種子數(shù)；

N——供試種子數(shù)；

lg——芽長；

lr——根長。

1.4 盆栽實驗

以同樣的玉米和黃瓜種子進行盆栽實驗。每種PE按質(zhì)量分數(shù)0、0.1%、0.5%、1%和2%與80 g土壤充分混合，混合后的土壤放入育苗盒中，加入20 mL蒸餾水活化兩天后將浸泡過夜的種子置于育苗盒高度的1/3處，每盆放置3粒種子。每種植物15個處理，每個處理 3個重復(fù)。保持土壤水分為田間最大持水量的 60%，每天光照 12 h，光照強度為30000 lx。30 d培養(yǎng)結(jié)束后，測量作物的株高，用蒸餾水將農(nóng)作物根部沖洗干凈，濾紙吸干水分，分離地上部和地下部，稱質(zhì)量得到植物鮮質(zhì)量。利用根系掃描儀（10000XL，Epson Scanning，日本），運用WinRHIZO軟件（Prp.2005，Regent，加拿大）分析根系形態(tài)。最后，植物在105 ℃下殺青30 min，60 ℃保持恒溫72 h，取出烘干后稱質(zhì)量得到植物干質(zhì)量。PE58和PE178為同一批次試驗，PE13為補充批次試驗，不同批次試驗處理和過程完全一致。

1.5 數(shù)據(jù)分析

實驗結(jié)果以平均值±標準偏差表示。使用Excel 2016和Origin 2021進行實驗結(jié)果的處理分析及圖表繪制，使用SPSS 23.0對實驗數(shù)據(jù)進行顯著性差異分析（Duncan檢驗，P=0.05），雙因素方差分析（Two-Way ANOVA）探討PE質(zhì)量分數(shù)、粒徑及二者的交互作用對種子發(fā)芽、幼苗生長和根系形態(tài)的影響，CANOCO 5.0軟件分析微塑料特性與種子發(fā)芽、幼苗生長、根系形態(tài)的關(guān)系，所有數(shù)據(jù)均進行l(wèi)g(x+1)轉(zhuǎn)換，對種子發(fā)芽、幼苗生長、根系形態(tài)數(shù)據(jù)進行去趨勢對應(yīng)分析（DCA），排序軸梯度長度小于3時，適用基于線性的冗余分析方法（RDA），應(yīng)用Monte Carlo法進行相關(guān)性檢驗。

2 結(jié)果

2.1 微塑料的特性

3種粒徑的PE表面特征SEM和XPS全程譜如圖1所示。PE13粒徑范圍約為10—30 μm，其表面呈褶皺片層狀結(jié)構(gòu)（圖1a、d）；PE58的粒徑范圍約為40—60 μm，多數(shù)為近似球形，且表面有凹陷和裂痕（圖1b、e）；PE178粒徑約為150—200 μm，大多近似球形，有少數(shù)呈棒狀，其表面存在凹陷和裂痕（圖1c、f）。3種PE表面除了含有碳原子外，PE13表面還含有0.72%的氧原子（圖1g），PE 58表面含有1.06%氧原子和1.60%的氮原子（圖1e），PE178表面含有0.76%的氧原子（圖1i）。

圖1 PE表面特征掃描電鏡圖（a—f）和X射線光電子能譜全程譜圖（g—i）Figure 1 Scanning electron microscopy (a to f) and X-ray photoelectron spectroscopy (g to i) of surface characteristics of PE

表1為PE浸出液pH、DOC和重金屬質(zhì)量濃度。與空白對照組（CK）相比，PE13浸出液的DOC、重金屬Cu和Zn的質(zhì)量濃度顯著升高，PE58浸出液的pH顯著降低，DOC和重金屬的質(zhì)量濃度（Cd除外）顯著升高，PE178浸出液中Zn的質(zhì)量濃度顯著升高。PE58浸出液中DOC、重金屬Pb和Cr質(zhì)量濃度顯著高于PE13和PE178，Cd質(zhì)量濃度顯著高于PE178，這說明相比于另外兩種粒徑的PE，PE58中含有較多的塑料添加劑。

表1 PE微塑料的物理化學(xué)性質(zhì)Table1 The physicochemical properties of PE microplastics

2.2 微塑料對種子發(fā)芽的影響

圖2所示為PE對玉米和黃瓜種子發(fā)芽和生長的影響。1%的PE13顯著降低了玉米種子的發(fā)芽率，2%的PE13使其發(fā)芽勢和發(fā)芽率均顯著降低；質(zhì)量分數(shù)小于 1%的 PE58均顯著降低了玉米種子的發(fā)芽勢和發(fā)芽率，1%和 2%的PE58顯著降低了黃瓜種子的發(fā)芽勢和發(fā)芽率，且隨質(zhì)量分數(shù)的增加抑制作用增強；PE178對玉米和黃瓜種子的發(fā)芽勢和發(fā)芽率均無顯著差異（圖2a—d）。Two-Way ANOVA顯示，PE的粒徑、質(zhì)量分數(shù)及二者的交互作用均顯著影響玉米種子的發(fā)芽勢和發(fā)芽率，而僅PE的質(zhì)量分數(shù)對黃瓜種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢有顯著影響。與粒徑相比，PE的質(zhì)量分數(shù)是影響兩種植物種子發(fā)芽的最主要因素。

圖2 PE對玉米（a、c、e、g）和黃瓜（b、d、f、h）種子萌發(fā)的影響Figure 2 Effects of PE on seed germination of maize (a, c, e, g) and cucumber (b, d, f, h)

續(xù)圖2 PE對玉米（a、c、e、g）和黃瓜（b、d、f、h）種子萌發(fā)的影響Continued figure 2 Effects of PE on seed germination of maize (a, c, e, g) and cucumber (b, d, f, h)

0.5%、1%和2%的PE13、2%的PE58、1%和2%的PE178均顯著降低了玉米的芽長，且質(zhì)量分數(shù)越大抑制作用越強（圖2e）。PE13對黃瓜根的生長顯示出低促高抑特征；0.5%、1%和2%的PE58和PE178均顯著降低了黃瓜的芽長和根長，且質(zhì)量分數(shù)越大抑制作用越強（圖2f）。Two-Way ANOVA顯示，PE的質(zhì)量分數(shù)對玉米和黃瓜芽長均有顯著影響，但粒徑對芽長無顯著影響；PE的粒徑、質(zhì)量分數(shù)及粒徑和質(zhì)量分數(shù)的交互作用均顯著影響黃瓜的根長。

種子活力指數(shù)反映了種子的活力。2%的 PE13顯著抑制了黃瓜種子活力；PE58在所有質(zhì)量分數(shù)下均顯著抑制了玉米種子活力，在1%和2%時顯著抑制了黃瓜種子活力；PE178在質(zhì)量分數(shù)為0.5%、1%和2%時，顯著抑制了玉米和黃瓜的種子活力，且隨著質(zhì)量分數(shù)增加，抑制作用增強（圖2g、h）。Two-Way ANOVA顯示，PE的粒徑和質(zhì)量分數(shù)均顯著影響玉米和黃瓜種子的活力，但二者的交互作用僅對玉米種子的活力有顯著影響。與粒徑相比，質(zhì)量分數(shù)是影響2種植物種子活力的最主要因素。

2.3 微塑料對農(nóng)作物幼苗生長的影響

圖 3所示為 PE對玉米和黃瓜幼苗生長的影響。0.1%的PE13顯著增加了玉米株高，0.5%和1%的 PE178顯著降低了玉米株高（圖 3a），0.5%的PE58顯著降低了黃瓜株高（圖 3b）。Two-Way ANOVA顯示，PE的粒徑、質(zhì)量分數(shù)及二者的交互作用均顯著影響玉米的株高，且PE的粒徑效應(yīng)更顯著；PE的質(zhì)量分數(shù)和粒徑對黃瓜株高影響不顯著。2%的 PE13顯著降低了玉米地上部鮮質(zhì)量，PE178質(zhì)量分數(shù)為1%時顯著降低了玉米地下部鮮質(zhì)量（圖3c）。PE58在所有質(zhì)量分數(shù)下均顯著降低了黃瓜地上部鮮質(zhì)量，在0.1%和0.5%時顯著降低了黃瓜地下部鮮質(zhì)量；1%和 2%的 PE178顯著降低了黃瓜地上部鮮質(zhì)量，在質(zhì)量分數(shù)0.5%、1%和2%時顯著降低了黃瓜地下部鮮質(zhì)量（圖3d）。Two-Way ANOVA顯示，PE的質(zhì)量分數(shù)對玉米地下部鮮質(zhì)量有顯著影響，但沒有粒徑效應(yīng)；PE對黃瓜的地下部鮮質(zhì)量有顯著的粒徑效應(yīng)，但PE的質(zhì)量分數(shù)對黃瓜的地下部鮮質(zhì)量無顯著影響。0.1%的PE58 顯著降低了黃瓜地上部和地下部干質(zhì)量，0.5%的 PE58顯著降低了黃瓜地下部干質(zhì)量；PE178在質(zhì)量分數(shù) 1%和 2%時顯著降低了黃瓜地上干質(zhì)量，0.5%和1%時顯著降低了黃瓜地下部干質(zhì)量（圖3f）。Two-Way ANOVA顯示，PE的粒徑、粒徑和質(zhì)量分數(shù)的交互作用顯著影響黃瓜地下部干質(zhì)量，且粒徑效應(yīng)更顯著。

圖3 PE對玉米（a、c、e）和黃瓜（b、d、f）幼苗生長的影響Figure 3 Effects of PE on seedling growth of maize (a, c, e) and cucumber (b, d, f)

2.4 微塑料對農(nóng)作物根系形態(tài)的影響

圖4所示為3種粒徑的PE對玉米幼苗根系形態(tài)的影響及 PE13對黃瓜幼苗根系形態(tài)的影響。PE13在質(zhì)量分數(shù)0.1%和0.5%下顯著增加了玉米根體積和根表面積。PE58和PE178對玉米的根長、根體積、根表面積和根尖數(shù)均無顯著影響。PE13在質(zhì)量分數(shù) 2%時顯著增加了黃瓜根長、根表面積和根尖數(shù)，在質(zhì)量分數(shù)1%時顯著增加了黃瓜根尖數(shù)。PE對玉米幼苗根系形態(tài)的Two-Way ANOVA顯示，PE的質(zhì)量分數(shù)對玉米根體積和根表面積有顯著影響，PE的粒徑對玉米根長、根體積、根表面積和根尖數(shù)有顯著影響，質(zhì)量分數(shù)和粒徑的交互作用對玉米根體積和根尖數(shù)有顯著影響，PE對玉米的根尖數(shù)的粒徑效應(yīng)更顯著。

圖4 PE對玉米和黃瓜根系形態(tài)的影響Figure 4 Effects of PE on root morphology of maize and cucumber

3 討論

本文利用RDA分析討論了PE的粒徑、質(zhì)量分數(shù)和浸出物對玉米和黃瓜種子發(fā)芽、幼苗生長及根系形態(tài)的影響（圖5）。玉米的RDA排序結(jié)果顯示，前兩個排序軸的特征值為0.471和0.040，玉米生長發(fā)育的各項指標與PE特性在第一軸和第二軸的相關(guān)系數(shù)為0.847和0.636。黃瓜的RDA排序結(jié)果顯示，前兩個排序軸的特征值為0.257和0.067，黃瓜生長發(fā)育的各項指標與PE特性在第一軸和第二軸的相關(guān)系數(shù)為0.838和0.661。Monte Carlo置換檢驗所有排序軸均達到顯著水平（P<0.05），說明排序軸是可靠的。PE特性的篩選采用向前映入法（Forward selection），保留能通過Monte Carlo置換檢驗的顯著因子。其結(jié)果顯示，與玉米生長發(fā)育有顯著相關(guān)的因子包括PE的粒徑、質(zhì)量分數(shù)、浸出液重金屬Zn和Cu質(zhì)量濃度，與黃瓜生長發(fā)育有顯著相關(guān)的因子包括PE的粒徑、質(zhì)量分數(shù)、浸出液DOC、重金屬Zn和Cu質(zhì)量濃度。

圖5 PE特性與玉米（a）和黃瓜（b）種子發(fā)芽、幼苗生長狀況的冗余分析Figure 5 Characteristics of PE and redundancy analysis of seed germination and seedling growth of maize (a)and cucumber (b)

玉米的發(fā)芽根長、幼苗株高、幼苗根長、根體積和根表面積與PE粒徑呈顯著負相關(guān)，黃瓜的發(fā)芽根長、種子活力指數(shù)和幼苗干質(zhì)量與PE粒徑呈顯著負相關(guān)。這說明隨著粒徑的增加，PE對玉米和黃瓜發(fā)芽和生長的負面影響越明顯。其可能的原因是隨著粒徑的增加，PE對植物根系產(chǎn)生更強的機械損傷，誘導(dǎo)植物的氧化應(yīng)激，抑制了根的發(fā)育和植株的生長（Pehlivan，2021；Guo et al.，2022）。玉米的芽長、幼苗的根體積和根表面積與PE的質(zhì)量分數(shù)呈顯著負相關(guān)；黃瓜的芽長、根長和種子活力指數(shù)與PE的質(zhì)量分數(shù)呈顯著負相關(guān)。這說明隨著PE質(zhì)量分數(shù)的增加，PE對玉米和黃瓜發(fā)芽和生長的負面影響越明顯。其可能的原因是PE質(zhì)量分數(shù)越高，引起植物氧化應(yīng)激產(chǎn)生的ROS水平越高，會導(dǎo)致更嚴重的組織和細胞氧化損傷、細胞和基因毒性，從而抑制植物根的發(fā)育（Giorgetti et al.，2020）。此外，隨PE質(zhì)量分數(shù)增加，積累在植物根系的微塑料量會增加，導(dǎo)致水分和養(yǎng)分吸收阻礙，從而抑制植物種子發(fā)芽和幼苗根系生長（Bosker et al.，2019；Sun et al.，2020；Urbina et al.，2020）。

黃瓜的種子發(fā)芽勢和發(fā)芽率、玉米和黃瓜種子的芽長和根長、黃瓜的種子活力指數(shù)、玉米幼苗根長、根體積和根表面積與PE浸出液的重金屬Zn質(zhì)量分數(shù)呈顯著負相關(guān)，玉米和黃瓜種子的發(fā)芽勢和芽長、黃瓜的種子發(fā)芽的根長和種子活力指數(shù)、玉米幼苗的根長與 PE浸出液的重金屬 Cu呈顯著負相關(guān)。這說明隨著浸出液中Cu和Zn質(zhì)量分數(shù)的增加，PE對玉米和黃瓜發(fā)芽和生長的負面影響越顯著?？赡艿脑蚴请S著重金屬（Zn、Cu）質(zhì)量分數(shù)增加，重金屬可能通過增加根細胞膜通透性，降低酶的活性，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，抑制了種子的萌發(fā)和根的生長（Cheng，2003；Esmaeilzadeh et al.，2017；Kova?evi? et al.，2020；Riyazuddin et al.，2021）。黃瓜的種子的發(fā)芽勢、芽長、根長和種子活力指數(shù)與PE浸出液中的DOC呈顯著負相關(guān)。DOC質(zhì)量分數(shù)越高表明PE釋放的有機添加劑越多，XPS分析結(jié)果也顯示PE表面含有少量氧和氮，這進一步說明了PE中可能添加了一些含氮和氧元素的阻燃劑、光穩(wěn)定劑和塑化劑等有機添加劑，微塑料中主要的有機添加劑是塑化劑，包括鄰苯二甲酸二丁酯、鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯、鄰苯二甲酸二辛酯等（Wang et al.，2013；Hahladakis et al.，2018；Fauser et al.，2022）。這些有機添加劑可能抑制淀粉酶活性，減少種子萌發(fā)養(yǎng)分，誘導(dǎo)植物氧化應(yīng)激（Gao et al.，2017），從而抑制黃瓜種子萌發(fā)和生長。

4 結(jié)論

（1）3種粒徑 PE對玉米和黃瓜種子發(fā)芽和幼苗生長存在顯著的毒性效應(yīng)，且在種子萌發(fā)階段玉米和黃瓜對PE污染更加敏感。PE13對玉米和黃瓜的根系形態(tài)影響顯著，促進了根的發(fā)育。

（2）PE對玉米和黃瓜種子發(fā)芽、幼苗生長和根系形態(tài)發(fā)育均存在不同程度的粒徑效應(yīng)和質(zhì)量分數(shù)效應(yīng)。隨著粒徑的增大和質(zhì)量分數(shù)的增加，PE的負面效應(yīng)更加顯著。其中PE的質(zhì)量分數(shù)對兩種植物種子的發(fā)芽影響更顯著，而對幼苗的生長和根系形態(tài)，PE的粒徑效應(yīng)更顯著。

（3）PE的浸出的重金屬和有機添加劑對玉米和黃瓜種子發(fā)芽有一定的毒性效應(yīng)，RDA分析結(jié)果顯示隨著PE浸出物重金屬和添加劑質(zhì)量分數(shù)的增加，其毒性效應(yīng)增強。