王 斌,呂晗琪,張騰霄,桑亞姣,張春華,李 爽

(綏化學(xué)院 食品與制藥工程學(xué)院, 黑龍江 綏化 152061)

繡球菌(Sparassis crispa)隸屬于非褶孔菌目、繡球菌科、繡球菌屬，又名繡球蘑、地花蘑、白繡球花、花椰菜菌等，是珍稀名貴藥食兩用菌[1]，蛋白質(zhì)、碳水化合物、維生素和氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)豐富，具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗炎、抗病毒、抗氧化、抗輻射、降血糖、降血脂、保肝等多種功能[2]。繡球菌中維生素E含量位居菌類前列，還含有麥角固醇。近年來，國內(nèi)外學(xué)者深入研究了繡球菌生物學(xué)特性和營養(yǎng)生理特性。繼日本和韓國后，我國多地已實現(xiàn)了繡球菌的工廠化栽培，但栽培種為固體菌種[3～4]。液體菌種相對于固體菌種而言，具有菌種純度高、菌齡一致、周期短和易于工業(yè)化培養(yǎng)等優(yōu)點，推廣應(yīng)用成為行業(yè)主流。筆者通過單因素試驗基礎(chǔ)上采用正交試驗分析法，優(yōu)化繡球菌菌絲體液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)條件，確定最佳工藝參數(shù)，為繡球菌進一步開發(fā)利用及工廠化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 材料

繡球菌菌種由綏化學(xué)院食品與制藥工程學(xué)院微生物學(xué)實驗室提供。

1.2 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDA)：馬鈴薯100 g,葡萄糖10 g，水500 mL。改良馬丁氏培養(yǎng)基：蛋白胨2.5 g,葡萄糖10 g,磷酸氫二鉀0.5 g,酵母浸粉1 g，硫酸鎂0.25 g，水500 mL。查氏培養(yǎng)基：硝酸鈉1.5 g，磷酸氫二鉀0.5 g，硫酸鎂0.25 g,氯化鉀0.25 g,硫酸亞鐵0.005 g，蔗糖15 g，水500 mL。玉米汁培養(yǎng)基：玉米粉10 g,蔗糖7.5 g，磷酸二氫鉀1 g，硫酸鎂0.25 g，水500 mL。豆粉蔗糖培養(yǎng)基：豆粉10 g，蔗糖12.5 g，水500 mL。

1.3 主要儀器

FA2104電子天平，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；SW-CJ-2F雙人雙面凈化工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司；YXQ-LS-50SII型立式壓力蒸汽滅菌器，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；ZP-42 振蕩培養(yǎng)搖床，蘇州市國飛實驗室儀器有限公司。

2 方法

2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基初篩

以PDA培養(yǎng)基(A)、改良馬丁氏培養(yǎng)基(B)、查氏培養(yǎng)基(C)、玉米汁培養(yǎng)基(D)、豆粉蔗糖培養(yǎng)基(E)等5種液體培養(yǎng)基為初篩對象，按1.2進行配置，每瓶100 mL，121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min，冷卻至24 ℃左右在超凈工作臺進行接種，每瓶定量接種5 mL繡球菌菌絲體種子液，于24 ℃、130 r/min條件下無光恒溫振蕩培養(yǎng)7 d，抽濾(所有樣品均以200目尼龍濾布為介質(zhì)真空抽濾3min)收集菌絲體并稱重(濕重)，平行3次。

2.2 發(fā)酵工藝參數(shù)的單因素優(yōu)化

2.2.1 發(fā)酵溫度 按2.1優(yōu)化的培養(yǎng)基，每瓶接種5 mL繡球菌菌絲體種子液，振蕩速度130 r/min、發(fā)酵7 d，無光振蕩培養(yǎng)，考察發(fā)酵溫度18 ℃、20 ℃、22 ℃、24 ℃、26 ℃對繡球菌菌絲體產(chǎn)量(濕重)的影響，平行3次。

2.2.2 振蕩速度 按2.1優(yōu)化的培養(yǎng)基，每瓶接種5 mL繡球菌菌絲體種子液，發(fā)酵溫度24 ℃、發(fā)酵7 d，無光旋轉(zhuǎn)式振蕩培養(yǎng)，考察振蕩速度90 r/min、110 r/min、130 r/min、150 r/min、170 r/min對繡球菌菌絲體產(chǎn)量(濕重)的影響，平行3次。

2.2.3 發(fā)酵時間 按2.1優(yōu)化的培養(yǎng)基，每瓶接種5 mL繡球菌菌絲體種子液，發(fā)酵溫度24 ℃、振蕩速度130 r/min，無光振蕩培養(yǎng)，考察發(fā)酵7 d、9 d、11 d、13 d、15 d對繡球菌菌絲體產(chǎn)量(濕重)的影響，平行3次。

2.3 發(fā)酵液體培養(yǎng)基的優(yōu)化及復(fù)篩

2.3.1 碳源對菌絲體生長的影響 按2.2優(yōu)化的結(jié)果，分別加入不同碳源(1～5)，以菌絲體產(chǎn)量(濕重)為參考指標，平行3次。各組的碳源組成設(shè)計如下：1：馬鈴薯浸提液+2%葡萄糖；2：馬鈴薯浸提液+2%蔗糖；3：馬鈴薯浸提液+2%松木屑提取液；4：馬鈴薯浸提液+2%麥芽糖；5：馬鈴薯浸提液+2%果糖。

2.3.2氮源對菌絲體生長的影響 按2.2優(yōu)化的結(jié)果，分別加入不同氮源(1～5)，以菌絲體產(chǎn)量(濕重)為參考指標，平行3次。1：馬鈴薯浸提液+2%蔗糖+0.3%氯化銨；2：馬鈴薯浸提液+2%蔗糖+0.3%蛋白胨；3：馬鈴薯浸提液+2%蔗糖+0.3%酵母浸粉；4：馬鈴薯浸提液+2%蔗糖+1%黃豆粉；5：馬鈴薯浸提液+2%蔗糖+1%玉米粉。

2.3.3 無機鹽對菌絲體生長的影響 按2.2優(yōu)化的結(jié)果，分別加入不同無機鹽(1～5)，以菌絲體產(chǎn)量(濕重)為參考指標，平行3次。1：馬鈴薯浸提液+2%蔗糖+0.3%蛋白胨+0.2%KH2PO4；2：馬鈴薯浸提液+2%蔗糖+0.3%蛋白胨+0.2%KH2PO4+0.05%MgSO4；3：馬鈴薯浸提液+2%蔗糖+0.3%蛋白胨+0.2%NaH2PO4；4：馬鈴薯浸提液+2%蔗糖+0.3%蛋白胨+0.2%NaH2PO4+0.05%MgSO4；5：馬鈴薯浸提液+2%蔗糖+0.3%蛋白胨+0.2%NaH2PO4+0.05%KCl。

2.4 正交實驗設(shè)計

在單因素試驗基礎(chǔ)上，選擇對繡球菌菌絲體液態(tài)發(fā)酵工藝培養(yǎng)影響較大的因素進行L9(34)正交試驗，確定繡球菌菌絲體液態(tài)發(fā)酵最佳培養(yǎng)工藝條件。

3 結(jié)果與分析

3.1 發(fā)酵培養(yǎng)基初篩結(jié)果

不同液態(tài)培養(yǎng)基對繡球菌菌絲體生長的影響見圖1、圖2。

圖1 不同液態(tài)培養(yǎng)基對繡球菌菌絲體生長的影響

圖2 不同液態(tài)培養(yǎng)基對繡球菌菌絲體生長的影響

圖1和圖2可知，不同液態(tài)培養(yǎng)基對繡球菌菌絲體生長的影響存在明顯差異，PDA培養(yǎng)基中繡球菌菌絲體形成球狀且菌絲球密度最高，其次為玉米汁培養(yǎng)基，而查氏培養(yǎng)基中繡球菌菌絲體幾乎不生長，改良馬丁氏培養(yǎng)基和豆粉蔗糖培養(yǎng)基的結(jié)果相近，但明顯不如PDA培養(yǎng)基，因此，后續(xù)正交設(shè)計實驗選擇PDA為基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

3.2 發(fā)酵工藝參數(shù)的單因素優(yōu)化結(jié)果

發(fā)酵溫度、振蕩速度、發(fā)酵時間優(yōu)化結(jié)果分別見圖3、圖4、圖5。不同種類的碳源、氮源、無機鹽對菌絲體生長的影響分別見圖6、圖7、圖8 。

圖3 培養(yǎng)溫度對繡球菌菌絲生長的影響

圖4 振蕩速度對繡球菌菌絲體生長的影響

圖5 發(fā)酵時間對繡球菌菌絲體生長的影響

圖6 碳源對繡球菌菌絲體生長的影響

圖7 氮源對繡球菌菌絲體生長的影響

圖3可知，18～26℃范圍內(nèi)隨著發(fā)酵溫度升高，繡球菌菌絲體生長速度隨之加快，提高溫度能夠顯著刺激菌絲體生長。繡球菌主栽品種屬低溫出菇型品種，出菇期溫度需保持13～20 ℃，但在液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)模式下其菌絲體生長階段卻需要較高生長溫度。因此，后續(xù)正交設(shè)計實驗發(fā)酵溫度設(shè)置為26 ℃。

圖4可知，振蕩速度是影響繡球菌菌絲體生長的重要因素，在90～150 r/min范圍內(nèi)，菌絲體的生長隨振蕩速度提高而增加，但170 r/min時反而減小。振蕩轉(zhuǎn)速主要影響溶氧效率、養(yǎng)分的均勻分布和菌絲斷裂程度，較高轉(zhuǎn)速會造成菌絲斷裂頻率過高及機械碰撞損傷過度，斷裂處無法形成有效生長點。繡球菌是典型的好氧真菌，結(jié)果表明，液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)最適振蕩速為150 r/min，此條件既保障了充足氧氣供應(yīng)，又不會對菌絲造成機械損傷。

圖5可知，發(fā)酵時間對繡球菌菌絲體生長影響較顯著，7～13 d持續(xù)保持較高的生長速率，但13 d后生長速度明顯變緩，再增加發(fā)酵時間對收獲菌絲體的貢獻不大，且造成菌絲衰老，從節(jié)約時間提高效率角度，發(fā)酵時間適宜選擇13 d。木耳、香菇、金針菇及側(cè)耳等其它常見食用菌發(fā)酵至7 d便趨于平緩(即可收獲菌絲體)，繡球菌與其相比菌絲體生長緩慢，收獲時間滯后約6 d。

圖6可知，碳源對繡球菌菌絲體生長影響顯著，葡萄糖和蔗糖效果最好，其次為麥芽糖、松木屑提取液，果糖最差，說明繡球菌菌絲體對各種碳源吸收及利用存在顯著差異。由于考察碳源的種類不同，本實驗結(jié)果與林衍銓等[5]研究的結(jié)果基本一致，但與元玲剛等[6]研究的結(jié)果略有差異。

圖8 無機鹽對繡球菌菌絲體生長的影響

圖7可知，不同氮源對繡球菌菌絲體生長影響顯著，蛋白胨和黃豆粉為氮源時菌絲體收獲量較大，其次為玉米粉、酵母浸粉，而氯化銨效果最差。說明繡球菌對有機氮源的利用效率優(yōu)于無機氮源。

圖8可知，繡球菌對各類無機鹽響應(yīng)不是很敏感，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入少量磷酸鹽、鎂鹽、鉀鹽均能略微提高菌絲體的生長速度，其中0.2%磷酸二氫鉀+0.05%硫酸鎂的組合效果最好，其次為0.2%磷酸二氫鈉+0.05%硫酸鎂，單用0.2%磷酸二氫鈉效果最差。

3.3 多因素正交試驗結(jié)果

選用L9(34)正交設(shè)計對振蕩速度、發(fā)酵時間、碳源、氮源4個關(guān)鍵因素進行發(fā)酵試驗，固定發(fā)酵溫度為26 ℃，以菌絲體產(chǎn)量(濕重)為參考指標，因素水平安排見表1。正交實驗結(jié)果見表2和表3。

表1 正交試驗設(shè)計因素及水平

表2 正交試驗優(yōu)化研究直觀分析

表3 正交試驗的方差分析

由表2和表3可知，各因素中對結(jié)果影響的大小順序為B>A>C>D，最佳實驗方案為A2B2C1D3，即最佳液態(tài)發(fā)酵工藝條件為振蕩速度為150 r/min、發(fā)酵時間為13 d、碳源為葡萄糖、氮源為玉米粉，以最佳工藝條件進行實驗驗證，發(fā)酵收獲的菌絲體鮮重為3.998 g，比初篩的最高值1.968 g高出103.15%，比單因素試驗的最高值3.691 g高出8.32%，驗證結(jié)果達到了期望目標。

以液態(tài)發(fā)酵法高效獲取繡球菌菌絲體及菌種是行業(yè)規(guī)?；l(fā)展的必然需求，對其培養(yǎng)基配方組分及發(fā)酵生產(chǎn)工藝進行優(yōu)化以獲得最優(yōu)工藝條件[7～9]，為實際生產(chǎn)提供全面、可靠的理論依據(jù)。

4 結(jié)論

以常用的5種真菌培養(yǎng)基為初篩對象，結(jié)果顯示PDA培養(yǎng)基最好，次為改良馬丁氏培養(yǎng)基；再以PDA培養(yǎng)基為基礎(chǔ)同時進行發(fā)酵工藝因素、培養(yǎng)基配方兩個方面的單因素試驗，確定了最適溫度26 ℃、最佳振蕩速度150 r/min、最佳發(fā)酵時間13 d、最佳碳源2%葡萄糖、最佳氮源0.3%蛋白胨，最佳無機鹽0.2%磷酸二氫鉀+0.05%硫酸鎂；結(jié)合多因素正交試驗結(jié)果，繡球菌菌絲體最佳液態(tài)發(fā)酵工藝條件為：PDA培養(yǎng)基、最適溫度26 ℃、振蕩速度150 r/min、發(fā)酵時間為13 d、碳源為葡萄糖、氮源為玉米粉。