邱 浩，郭 倩，崔浪軍，閆鵬東，閆亞平

(西北瀕危藥材資源開發(fā)國家工程實驗室/藥用資源與天然藥物化學教育部重點實驗室/陜西師范大學 生命科學學院，陜西 西安 710119)

白及為蘭科植物白及Bletillastriata(Thunb.) Reichb.f.的干燥塊莖，具有止血、抗菌、消腫、抗腫瘤、生肌斂瘡等功效[1]，其主要次生代謝物白及多糖具有抗炎癥、抗腫瘤、降血脂、降血糖和抗衰老等作用[2]。此外，白及多糖具有良好降解性、相容性和可修飾性，多用于藥物遞送系統(tǒng)、傷口敷料、生物材料等[3]。

關鍵次生代謝物含量是衡量藥用植物品質的重要指標，其合成除了與植物自身遺傳特性密切相關外，與外界環(huán)境特征也顯著相關。根際土壤真菌不僅能誘導植物合成特定的次生代謝物，有些真菌還能夠提高植物的抗病性，從而提升植物產量[4]。土壤理化因子是土壤肥力的重要指標，土壤真菌對土壤養(yǎng)分的穩(wěn)定和可持續(xù)利用起到關鍵作用[5]，二者相互作用，顯著影響植物生長和次生代謝物質的積累。研究表明，土壤Zn2+、Mn2+等能夠改變植物根際土壤真菌群落結構，影響植物的生長和次生代謝物的合成[6]。如人參(PanaxginsengC. A. Mey.)根際土壤真菌群落結構改變能提高宿主植物多糖含量的積累[7]，而大豆(Giycinemax(L)Merrill)根際土壤的鐮刀真菌等則降低宿主多糖含量[8]。因此，篩選與宿主植物次生代謝物質積累密切相關的土壤理化因子和根際土壤真菌，對于藥用植物次生代謝物質積累機制的揭示和高產、科學田間管理方案的研發(fā)具有重要的指導意義。

有研究表明，土壤養(yǎng)分狀況能夠影響白及多糖及產量變化[9]，且根際土壤真菌群落與白及產量和多糖變化關系密切[10]。然而，影響白及產量及質量主要根際土壤真菌種類和關鍵土壤理化因子尚不清楚。基于此，筆者研究以不同產地的白及和根際土壤為材料，系統(tǒng)分析、揭示關鍵根際土壤理化因子和真菌種類與白及產量、多糖含量之間的關系，為開發(fā)高質高產的白及田間管理技術方案提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料采集

2019年采集7個產地的白及及其根際土壤樣品。每個產地隨機選取30株白及(分為3組，每組10株)，收集白及根系表面土壤，混合均勻，除去雜質，冰盒運回實驗室，分為兩部分待測：一部分自然風干用于土壤理化性質的測定，另一部分立即放入-80℃冰箱，用于土壤真菌群落分析。產地見表1。

表1 白及樣品來源

1.2 白及產量、多糖含量測定

將采收后的部分附子曬干至恒重，稱量其重量并計算產量。粉碎后，采用苯酚—濃硫酸法測定多糖含量[11]。

1.3 根際土壤理化因子測定

土壤中大量與微量元素含量的測定采用PW2403型X-Ray熒光光譜儀(Brukers 8，德國)[12]。

1.4 根際土壤真菌測定

使用Soil Genomic DNA Kit(天根)試劑盒提取土壤總DNA，測定總DNA濃度，1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測總DNA提取質量。利用引物(ITSIF. 5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'，ITS2R. 5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3')PCR擴增后，建庫、Illumina HiSeq高通量測序。利用云平臺(http://www.biocloud.net/)進行OTU聚類分析和物種分類學分析等。

1.5 統(tǒng)計學分析

使用 R(v4.1.1；http://www.r-project.org/)分析數(shù)據(jù)。在P<0.05水平上采用單因素方差(One-way ANOVA)分析白及多糖、產量多樣性指數(shù)之間的差異，繪制理化因子含量熱圖、真菌豐度熱圖、相關性熱圖，分析根際土壤理化因子與真菌對白及質量及產量的影響，產量、多糖、理化因子、真菌數(shù)據(jù)進行標準化處理以確保分析準確性。

2 結果與分析

2.1 白及品質含量分析

方差分析結果表明(表2)，陜西省商洛市山陽縣(A)和云南省麗江市永勝縣(D)產地的白及產量接近，與其他產地差異顯著(P<0.05)。除河南省三門峽市(E)產地的白及多糖含量明顯高于其他產地外，多糖含量在其他產地含量相近。

表2 產量及多糖含量

2.2 根際土壤理化因子分析

對白及根際土壤理化因子進行聚類，繪制熱圖。如圖1所示，不同產地理化因子可聚為三類，陜西省商洛市(A)、湖北省宜昌市(B)、河南省三門峽市(E)、云南省普洱市(G)聚為一類；云南省麗江市(D)、湖南省張家界市(F)聚為一類；陜西省漢中市聚為一類(C)。其中，Ca2+在河南省三門峽市(E)含量較高，在其他產地含量相近，Zn2+、P等在陜西省漢中市含量較高，其他產地含量相近。Na+、Mg2+等在陜西省商洛市(A)、湖北省宜昌市(B)含量較高，在其他產地含量相近，Al3+、Fe2+等在不同產地含量相近。

圖1 根際土壤理化因子含量熱圖

2.3 根際土壤真菌多樣性指數(shù)

通過繪制稀性曲線，評判樣本的當前測序深度是否足以反映樣本真菌多樣性。隨樣品測序量的增大，相應深度下的Operational Taxonomic Unit(OTU)數(shù)量不斷增多，隨著測序數(shù)據(jù)量不斷增大，各曲線趨向平坦，繼續(xù)增加測序深度發(fā)現(xiàn)新的 OTU 概率較小，說明每個樣品測序數(shù)量已經滿足數(shù)據(jù)分析需求，測序可以反映出樣品中真菌群落的多樣性信息，因此測序數(shù)據(jù)充足、合理，可以用于后續(xù)的生物信息學分析(圖2)。

圖2 根際土壤真菌稀釋曲線

較不同產地附子根際土壤真菌Alpha多樣性(表3)。其中，Shannon、Simpson、Ace指數(shù)均在云南省麗江市(D)、湖南省張家界市(F)、云南省普洱市(G)之間相似；Chao指數(shù)在陜西省商洛市(A)、湖北省宜昌市(B)之間相似，以及陜西省漢中市(C)、云南省麗江市(D)、湖南省張家界市(F)之間相似，Coverage在不同產地均相似。

表3 根際土壤真菌Alpha多樣性指數(shù)

2.4 根際土壤真菌群落結構主成分分析

對白及根際土壤屬水平真菌進行主成分分析，繪制不同產根際土壤真菌主成分分析圖(PCA)反映真菌群落的組成差異性。如圖3所示，兩種主成分累積貢獻率56.62%。第一主成分分析表明，除A產地，根際土壤真菌群落結構在其他產地相近。第二主成分分析表明，除C產地，真菌群落結構在其他產地相近。

圖3 根際土壤真菌PCA

2.5 根際土壤真菌差異性分析

對白及根際土壤真菌中豐度較高的真菌屬進行聚類，繪制物種豐度熱圖。如圖4所示，E、F和G聚為一類，呈現(xiàn)出：青霉菌屬(Penicillium)、葡萄球菌屬(Staphylotrichum)、 木拉克酵母屬(Cystofilobasidium)等豐度高，鐮刀菌屬(Fusarium)、莖點霉屬(Phoma)、鏈格孢屬(Alternaria)豐度低的特點。其余的聚為另一類，呈現(xiàn)出：鐮刀菌屬(Fusarium)、莖點霉屬(Phoma)、鏈格孢屬(Alternaria)豐度高、青霉菌屬(Penicillium)、葡萄球菌屬(Staphylotrichum)、 木拉克酵母屬(Cystofilobasidium)豐度低的特點。且在G中青霉菌屬(Penicillium)、葡萄球菌屬(Staphylotrichum)等真菌豐度最高。F中木拉克酵母屬(Cystofilobasidium)、梭孢殼屬(Thielavia)等真菌豐度最高。 E中頭束霉屬(Cephalotrichum)、被孢霉屬(Mortierella)等真菌豐度最高。D中鏈格孢屬(Alternaria)、莖點霉屬(Phoma)等真菌豐度最高。C中鐮刀菌屬(Fusarium)、織球殼菌屬(Plectosphaerella)等真菌豐度最高。B中擬盾殼霉屬(Paraconiothyrium)真菌豐度最高。A中毛殼菌屬(Chaetomium)、耐冷酵母屬(Guehomyces)真菌豐度最高。

圖4 根際土壤真菌群落物種差異

2.6 白及產量、多糖與根際土壤理化因子、真菌群落相關性分析

將白及產量、多糖含量與豐度前20的根際土壤真菌，以及土壤關鍵理化因子進行相關性分析，結果表明，產量、多糖含量只與少量真菌及個別理化因子顯著相關(圖5)。其中產量、多糖含量與土壤Cystofilobasidium、Thielavia豐度、以及Zn2+含量正相關，與土壤Phoma豐度和Na+含量負相關。此外，土壤Penicillium和Fusarium豐度與白及產量正相關，與多糖含量負相關， 而Al3+、Ca2+與多糖含量正相關，與產量負相關；

圖5 白及根際土壤真菌及理化因子與產量相關性分析

3 結果與討論

多糖是白及的主要活性成分，具有很強的抗菌性和抗癌特性?？梢栽鰪娧軆绕ぜ毎脑鲋澈脱軆绕どL因子的表達的[13]。已有研究表明，植物遺傳特性、根際土壤理化因子、土壤真菌群落結構會影響白及多糖的積累及產量[14]。然而，影響白及多糖及產量具體的理化因子與土壤真菌尚不明確，本研究對不同產地白及進行研究發(fā)現(xiàn)，部分理化因子、真菌與白及多糖積累及產量密切相關。

次生代謝產物通過調控植物和土壤生物之間的相互作用，在植物演替或凋落物分解等生態(tài)系統(tǒng)過程中發(fā)揮著重要作用[15]。部分根際土壤真菌能促進植物吸收礦質養(yǎng)分，提高植物抗性，調節(jié)植物次生代謝產物的產生[16]。筆者研究結果表明，白及產量、根際土壤理化因子含量在不同產地間差異較大，而白及多糖含量和根際土壤真菌多樣性指數(shù)在不同產地間差異不大，但根際土壤真菌屬水平上豐度較高的真菌屬在不同產地差異較大。由此可初步推測，根際土壤理化因子及真菌群落結構與白及產量、多糖含量可能密切相關。

相關性分析結果顯示，諸多土壤理化因子中，白及多糖含量與Zn2+和Ca2+含量正相關，與Na+含量負相關，而產量與Zn2+含量正相關，與Al3+負相關。類似的研究結果已有報道。Zn2+能提高玉米(ZeamaysL.)和豌豆(PisumsativumL.)的產量屬性及產量[17]，改善辣椒發(fā)育、產量和品質特性，有助于辣椒(CapsicumannuumL.)的栽培[18]。Na+可提升甜菜(BetavulgarisL.)土壤pH，增加土壤結皮并降低滲透率，降低甜菜蔗糖含量，從而降低甜菜質量與產量[19]。土壤中鋁能夠降低植物根伸長率和枝條生長、減少生物量產量、導致養(yǎng)分失衡以及生理和代謝過程改變，降低作物產量和質量[20]。而Ca2+能有效改善土壤鹽分，降低鋁毒性，促進植物成長，提高產量和增強抗病性[21]。此外，土壤理化因子還可通過影響土壤真菌群落，進而改變植物的生長和影響植物次生代謝物的積累[22]。本研究結果表明，白及多糖及產量與木拉克酵母屬(Cystofilobasidium)、梭孢殼屬(Thielavia)正相關，與莖點霉屬(Phoma)負相關，產量與青霉菌屬(Penicillium)正相關，多糖含量與鐮刀菌屬(Fusarium)負相關，雖然不能確定這些菌是否能直接合成多糖類物質，但已有的研究表明，這些屬的菌與宿主植物的次生代謝物質的積累關系密切。土壤中的木拉克酵母屬(Cystofilobasidium)能夠促進南瓜(Cucurbitamoschata(Duch. ex Lam.) Duch. ex Poiret)次生代謝物的合成與積累[23]，Cystofilobasidium與Sporobolomyces比例增加，能夠提升胡蘿卜(DaucuscarotaL. var. sativa Hoffm.)中內胡蘿卜素的積累，提升胡蘿卜質量與產量[24]。土壤中的梭孢殼屬(Thielavia)為植物提供高活性的內切葡聚糖酶，增加植物葡萄糖的積累，促進植物對土壤營養(yǎng)成分的吸收，從而提升苜蓿(MedicagosativaLinn)、玉米的產量[25～26]。莖點霉屬(Phoma)是引發(fā)植物葉病的主要病原菌[27]，能夠提升土壤中病原菌Leptosphaeriamaculans和Leptosphaeriabiglobosa比例，提高油菜(BrassicanapusL.)病害率，降低有效成分積累與產量[28]。青霉菌屬(Penicillium)對抑制真菌病害方面的功效[29]，能夠提升櫻桃(CerasuspseudocerasusG. Don)與玉米等植物產量[30]。鐮刀菌屬(Fusarium)引起的鐮刀菌枯萎病，嚴重影響了土壤真菌群落結構組成及土壤酸堿度[31]，從而使菠菜(SpinaciaoleraceaL.)、香蕉(MusananaLour.)等作物有效成分積累減少，產量降低[32]。由此說明，通過調節(jié)根際土壤中Zn2+、Na+、Ca2+、Al3+的含量及木拉克酵母屬(Cystofilobasidium)、梭孢殼屬(Thielavia)、莖點霉屬(Phoma)、青霉菌屬(Penicillium)、鐮刀菌屬(Fusarium)的豐度，可能可以改變白及產量及多糖含量。

綜上所述，白及產量及理化因子在不同產地間差異較大，多糖及真菌群落多樣性在不同產地間具有較高的相似性。提高Zn2+、Ca2+含量及木拉克酵母屬(Cystofilobasidium)、青霉菌屬(Penicillium)、梭孢殼屬(Thielavia)的豐度，降低Na+、Al3+的含量及莖點霉屬(Phoma)、鐮刀菌屬(Fusarium)的豐度，可能能夠提升白及產量及多糖含量。