韋慶旭 張建鵬 梁煜晨 唐連群 王 平*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，楊凌 712100；2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，烏魯木齊 830002)

青貯體系中乳酸菌的種類和數(shù)量是影響青貯質(zhì)量的直接因素[1]。青貯的發(fā)酵質(zhì)量高度依賴附生微生物區(qū)系，對(duì)于用不同作物調(diào)制的青貯飼料，甚至是在不同環(huán)境條件下種植的同一作物，附生微生物區(qū)系可能有很大差異[2]。構(gòu)樹(shù)營(yíng)養(yǎng)豐富，是優(yōu)質(zhì)的飼料資源，但構(gòu)樹(shù)開(kāi)發(fā)利用不當(dāng)，不僅會(huì)造成飼料資源的浪費(fèi)損失，還會(huì)影響動(dòng)物的生產(chǎn)性能。構(gòu)樹(shù)中較高的水分和蛋白質(zhì)含量及較低的水溶性碳水化合物含量使其青貯具有挑戰(zhàn)性。研究表明，未經(jīng)生物發(fā)酵處理的構(gòu)樹(shù)被畜禽食用后消化吸收利用率不高[3]，常通過(guò)添加乳酸菌來(lái)改善構(gòu)樹(shù)青貯品質(zhì)。乳酸菌是指能利用可溶性碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)生乳酸的細(xì)菌，是青貯飼料中常添加的飼用菌種[4]。乳酸菌通過(guò)調(diào)節(jié)青貯飼料內(nèi)微生物區(qū)系，使乳酸菌快速大量繁殖成為青貯飼料中的優(yōu)勢(shì)菌群，快速產(chǎn)生乳酸，降低青貯飼料pH，抑制好氧菌生長(zhǎng)，從而達(dá)到提高青貯飼料品質(zhì)的作用。

不同地區(qū)的乳酸菌種類相似度較低，且不同地區(qū)作物附著乳酸菌均為適合其附著的作物種類和當(dāng)?shù)刈匀画h(huán)境的特異性菌群[5]。作物附著的微生物為該作物的內(nèi)源附著微生物，其他物種附著的微生物則為該作物的外源微生物，內(nèi)源附著乳酸菌對(duì)附著的作物的碳水化合物利用能力更佳，內(nèi)源附著乳酸菌與微生物之間的相互作用在目標(biāo)作物青貯飼料中效果更強(qiáng)，與接種外源乳酸菌相比，接種內(nèi)源乳酸菌能更快降低目標(biāo)作物pH并產(chǎn)生大量乳酸[2]，故分離篩選構(gòu)樹(shù)自然發(fā)酵青貯中內(nèi)源乳酸菌用于構(gòu)樹(shù)青貯是可行的。玉米由于其自然附著乳酸菌數(shù)量可觀，自然發(fā)酵條件下能夠成功保存，被廣泛用于青貯，推測(cè)將玉米青貯中存在的乳酸菌接種至構(gòu)樹(shù)青貯能夠激發(fā)出與玉米青貯相似的性能。有研究表明，從宿主動(dòng)物消化道中分離的乳酸菌可能更利于動(dòng)物生產(chǎn)性能的提高[6]，將羔羊的消化道環(huán)境作為一種自然的篩選流程，推測(cè)飼喂構(gòu)樹(shù)青貯的健康羔羊糞便中可能存在能夠在羔羊消化道環(huán)境中存活或能夠影響動(dòng)物生產(chǎn)性能的乳酸菌。

目前，在對(duì)青貯飼料中乳酸菌篩選及乳酸菌對(duì)青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)等應(yīng)用研究方面，我國(guó)主要采用國(guó)外商品化乳酸菌制劑進(jìn)行研究，對(duì)具有自主性知識(shí)產(chǎn)權(quán)的乳酸菌制劑研究較少[7]。因此，篩選出優(yōu)良青貯用乳酸菌對(duì)研制具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的乳酸菌制劑具有重要意義。本研究擬從構(gòu)樹(shù)青貯、玉米青貯和飼喂構(gòu)樹(shù)青貯的健康奶山羊羔羊直腸糞便篩選出生長(zhǎng)速率、產(chǎn)酸能力、耐酸能力、抑菌能力等方面綜合表現(xiàn)良好的可飼用菌株，為后續(xù)開(kāi)發(fā)構(gòu)樹(shù)青貯飼料提供試驗(yàn)材料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

構(gòu)樹(shù)青貯樣品來(lái)自陜西康構(gòu)草業(yè)科技有限公司。于株高120～150 cm時(shí)收獲全株構(gòu)樹(shù)，邊收割邊切短至2 cm左右，留茬高度15 cm左右。每千克構(gòu)樹(shù)中添加2.5×1011CFU植物乳桿菌(臺(tái)灣亞芯生物科技有限公司)和2.5×107CFU布氏乳桿菌(陜西泰克生物科技有限公司)，使用4層以上拉伸膜裹包密封，發(fā)酵30 d以上。構(gòu)樹(shù)青貯含水量78%左右，感官評(píng)價(jià)良好，而且飼喂動(dòng)物未發(fā)現(xiàn)不良反應(yīng)。

玉米青貯樣品來(lái)自西北農(nóng)林科技大學(xué)薩能奶山羊種羊場(chǎng)青貯塔。于蠟熟期收獲全株玉米，切短至2 cm左右，留茬高度15 cm左右。全株玉米青貯制作中未添加任何添加劑，貯藏于磚混凝土結(jié)構(gòu)的青貯塔中，采樣時(shí)已發(fā)酵6個(gè)月，含水量72%左右，感官評(píng)價(jià)良好，而且飼喂動(dòng)物未發(fā)現(xiàn)不良反應(yīng)。

構(gòu)樹(shù)青貯和玉米青貯各采集500 g，密封保存后立即置冰盒中帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行后續(xù)操作。

1.1.2 糞便樣品的采集

糞便樣品來(lái)自西北農(nóng)林科技大學(xué)薩能奶山羊種羊場(chǎng)飼喂構(gòu)樹(shù)青貯的4只8月齡健康奶山羊羔羊。羔羊分欄飼養(yǎng)，每欄2只，飼喂含19.8%構(gòu)樹(shù)青貯的全混合日糧(TMR)。飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。飼糧中粗蛋白質(zhì)含量采用GB/T 6432—2018的方法測(cè)定，中性洗滌纖維含量采用GB/T 20806—2006的方法測(cè)定，酸性洗滌纖維含量采用NY/T 1459—2007的方法測(cè)定，鈣含量采用GB/T 6436—2018的方法測(cè)定，磷含量采用GB/T 6437—2018的方法測(cè)定。每天分別于07：30和15：30各飼喂1次，自由采食和飲水。每日清掃羊舍，保證羊舍的清潔衛(wèi)生。

表1 飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

于10：00徒手采集羔羊糞便。為保證糞便不受污染，采集人員戴滅菌手套通過(guò)肛門部位采集直腸糞便，丟棄靠近肛門的樣品。每只羊采集4粒糞球，將4只羊的糞便樣品混合裝于10 mL滅菌離心管，放入裝有溫水(37 ℃)的保溫杯，立即帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行后續(xù)操作。

會(huì)計(jì)主體假設(shè)作為會(huì)計(jì)學(xué)中主要假設(shè)因素，同時(shí)也是政府會(huì)計(jì)制度及有待處理的關(guān)鍵問(wèn)題，要想促進(jìn)政府預(yù)算會(huì)計(jì)和財(cái)務(wù)會(huì)計(jì)的融合，就要從會(huì)計(jì)主體入手，促進(jìn)二者協(xié)調(diào)。結(jié)合新政府會(huì)計(jì)制度得知，政府會(huì)計(jì)主體一般以各級(jí)政府部門、各級(jí)單位為主，充分展現(xiàn)出了政府會(huì)計(jì)主體和本級(jí)政府財(cái)政部門之間的關(guān)系。在把組織當(dāng)作會(huì)計(jì)主體時(shí)，需要綜合思考各個(gè)應(yīng)用預(yù)算資金單位及公共部門設(shè)定特點(diǎn)，促進(jìn)政府預(yù)算會(huì)計(jì)和財(cái)務(wù)會(huì)計(jì)融合。此外，在進(jìn)行會(huì)計(jì)主體選擇時(shí)，也可以把“基金”當(dāng)作會(huì)計(jì)主體，也可以將“政府整體”作為會(huì)計(jì)主體。根據(jù)新政府會(huì)計(jì)制度要求，合理選擇。

1.1.3 培養(yǎng)基

MRS液體培養(yǎng)基(1 L)(北京索萊寶科技有限公司，pH為6.2±0.2)：葡萄糖20 g，蛋白胨10 g，牛肉浸粉5 g，吐溫80 1 mL，酵母浸粉4 g，檸檬酸三胺2 g，磷酸氫二鉀2 g，乙酸鈉5 g，硫酸鎂0.2 g，硫酸錳0.05 g。

MRS瓊脂培養(yǎng)基(1 L)(北京索萊寶科技有限公司，pH為6.2±0.2)：葡萄糖20 g，蛋白胨10 g，牛肉浸粉5 g，吐溫80 1 mL，酵母浸粉4 g，檸檬酸三胺2 g，磷酸氫二鉀2 g，乙酸鈉5 g，硫酸鎂0.2 g，硫酸錳0.05 g，瓊脂粉15 g。

LB液體培養(yǎng)基[9](400 mL)：胰蛋白胨4 g，酵母提取物2 g，氯化鈉4 g。

LB平板瓊脂培養(yǎng)基[10](400 mL)：胰蛋白胨4 g，酵母提取物2 g，氯化鈉4 g，瓊脂6 g。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 乳酸菌的分離與純化

在超凈工作臺(tái)中，使用無(wú)菌操作方法將10 g糞便加入90 mL滅菌的磷酸鹽緩沖液(PBS)后振蕩混勻，用4層滅菌紗布過(guò)濾；將25 g玉米青貯及25 g構(gòu)樹(shù)青貯剪碎后分別加入225 mL滅菌的PBS后震蕩混勻，用4層滅菌紗布過(guò)濾，各取100 μL于加有1%碳酸鈣的MRS固體培養(yǎng)基上均勻涂布，37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h。

根據(jù)菌落的顏色、大小、狀態(tài)的不同，挑取有溶鈣圈的典型菌落，采用平板劃線法在MRS平板上做單菌落劃線分離，37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h，純化4～6次。對(duì)各菌株進(jìn)行編號(hào)標(biāo)記。并挑取單菌落接種至1 mL MRS液體培養(yǎng)基37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h，于20%甘油中-80 ℃保存。

1.2.2 菌株種屬鑒定

分別將分離到的所有純化菌液以1%接種量接種于10 mL MRS液體培養(yǎng)基充分活化后，離心收集菌體，根據(jù)細(xì)菌DNA提取試劑盒(糞便細(xì)菌基因組DNA試劑盒，天根生化科技有限公司)方法提取菌體DNA并進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序引物采用16S rRNA通用引物序列：27F(5′-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′)。將測(cè)序結(jié)果與NCBI核酸數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源性對(duì)比。

1.2.3 乳酸菌耐酸性能測(cè)定

參照韋票[10]的方法進(jìn)行乳酸菌耐酸性能測(cè)定。將供試菌株接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，用6 mol/L的鹽酸分別調(diào)節(jié)MRS液體培養(yǎng)基pH至3.0、3.5、4.0后滅菌。將活化的乳酸菌以1%的接種量分別接種至未調(diào)pH培養(yǎng)基及調(diào)pH培養(yǎng)基至3.0、3.5、4.0的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h，測(cè)定600 nm波長(zhǎng)下吸光度(OD600)值，以未調(diào)pH培養(yǎng)基為對(duì)照，計(jì)算比值。

1.2.4 乳酸菌生長(zhǎng)曲線、產(chǎn)酸速率曲線測(cè)定

參照韋票[10]的方法進(jìn)行乳酸菌生長(zhǎng)曲線測(cè)定，將活化的乳酸菌以1%的接種量接種至MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)，在第0、2、4、6、8、10、12、14、16、20、24、28、32、36、48 h測(cè)定菌液OD600值，以菌液培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD600值為縱坐標(biāo)，繪制生長(zhǎng)曲線。

參照何江波等[11]的方法進(jìn)行乳酸菌產(chǎn)酸速率曲線測(cè)定，將活化的乳酸菌以1%的接種量接種至MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)，在第0、2、4、6、8、12、16、24、36、48 h測(cè)定菌液pH，以菌液培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，pH為縱坐標(biāo)，繪制產(chǎn)酸速率曲線。

1.2.5 乳酸菌菌株上清液抑菌特性測(cè)定

參照何江波等[11]抑菌性試驗(yàn)方法，以沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌為指示菌，采用牛津杯法進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。將候選菌株于MRS培養(yǎng)基培養(yǎng)活化2代，將活化好的菌液以8 000×g離心2 min，上清液經(jīng)濾膜過(guò)濾吸取150 μL加入牛津杯中，37 ℃培養(yǎng)24 h后檢測(cè)其是否對(duì)指示菌產(chǎn)生抑制作用，抑菌能力根據(jù)抑菌圈大小判定，判定方法參考高擎燏等[12]。

1.2.6 菌株之間的拮抗性

參照韋票[10]方法，在菌液中加入無(wú)菌圓濾片(直徑6 mm)，浸泡10 min；以其中一株菌作為指示菌，指示菌種子液稀釋10倍，吸取100 μL涂布于MRS固體培養(yǎng)基，靜置10 min，將浸泡在菌液中的濾紙片依次加入，編號(hào)，37 ℃培養(yǎng)48 h后觀察待測(cè)菌與指示菌間拮抗性，待測(cè)菌周圍有透明圈表明該菌株與指示菌菌株之間有拮抗作用；無(wú)透明圈表明該菌株與指示菌菌株之間無(wú)拮抗作用，不會(huì)互相抑制生長(zhǎng)。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2019和SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行描述統(tǒng)計(jì)和正態(tài)檢驗(yàn)，并進(jìn)行方差分析，平均值間差異顯著性用LSD法進(jìn)行多重比較分析。采用GraphPad Prism 8軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌菌株分離純化

共分離得到74株菌株，所有菌株革蘭氏染色為陽(yáng)性，過(guò)氧化氫酶觸反應(yīng)為陰性。部分菌株在MRS瓊脂培養(yǎng)基的菌落形態(tài)見(jiàn)圖1，乳酸菌菌落形態(tài)呈圓形凸起，表面光滑，邊緣整齊，菌落顏色為乳白色。

2.2 乳酸菌菌株鑒定

將純化好的菌液16S rRNA測(cè)序結(jié)果與NCBI核酸數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源性對(duì)比后發(fā)現(xiàn)74株乳酸菌，其中包括31株植物乳桿菌、4株副干酪乳桿菌、1株戊糖乳桿菌、1株布氏乳桿菌、1株香腸乳桿菌、4株海氏腸球菌、1株非解乳鏈球菌、11株牛鏈球菌、5株巴黎鏈球菌、3株嬰兒鏈球菌、2株馬腸鏈球菌、1株糞腸球菌、1株腸膜明串珠菌和8株嗉囊乳桿菌。根據(jù)《飼料添加劑品種目錄(2013)》中可飼用微生物目錄，其中37株為可飼用乳酸菌。37株可飼用乳酸菌中構(gòu)樹(shù)來(lái)源的有34株，包括29株植物乳桿菌、4株副干酪乳桿菌和1株布氏乳桿菌；飼喂構(gòu)樹(shù)青貯的羔羊糞便來(lái)源的有1株植物乳桿菌；玉米青貯來(lái)源的有1株植物乳桿菌和1株糞腸球菌。37株可飼用乳酸菌鑒定結(jié)果見(jiàn)表2，這些菌株的覆蓋率均為99%，同源性均在99.45%以上。這些乳酸菌分別屬于植物乳桿菌、布氏乳桿菌、副干酪乳桿菌、糞腸球菌，其中植物乳酸菌占83.73%，布氏乳桿菌占2.70%，副干酪乳桿菌占10.81%，糞腸球菌占2.70%(圖2)。

A：副干酪乳桿菌 Lactobacillus paracasei；B：布氏乳桿菌 Lactobacillus brucelli；C：植物乳桿菌 Lactobacillus plantarum；D：糞腸球菌 Enterococcus faecalis。

表2 37株可飼用乳酸菌鑒定結(jié)果

續(xù)表2菌株編號(hào)Strain number中文菌名Bacteria name in Chinese英文菌名Bacteria name in English覆蓋率Coverage/%同源性Homology/%GQ-3-18植物乳桿菌Lactobacillus plantarum9999.93GQ-3-19植物乳桿菌Lactobacillus plantarum9999.93GQ-3-20植物乳桿菌Lactobacillus plantarum9999.80GQ-3-22植物乳桿菌Lactobacillus plantarum9999.73GQ-3-25植物乳桿菌Lactobacillus plantarum9999.73GQ-3-26植物乳桿菌Lactobacillus plantarum10099.73GQ-3-27植物乳桿菌Lactobacillus plantarum9999.87GQ-3-28植物乳桿菌Lactobacillus plantarum99100.00GQ-3-29植物乳桿菌Lactobacillus plantarum9999.93GQ-3-30植物乳桿菌Lactobacillus plantarum9999.87GQ-3-31植物乳桿菌Lactobacillus plantarum9999.73Y-3-22植物乳桿菌Lactobacillus plantarum9999.86GQ-5-1植物乳桿菌Lactobacillus plantarum9999.80GQ-5-2植物乳桿菌Lactobacillus plantarum9999.86GQ-5-4植物乳桿菌Lactobacillus plantarum9999.86GQ-5-6植物乳桿菌Lactobacillus plantarum9999.45GQ-5-7植物乳桿菌Lactobacillus plantarum99100.00GQ-5-9植物乳桿菌Lactobacillus plantarum9999.93FB-4-2植物乳桿菌Lactobacillus plantarum9999.45GQ-3-11副干酪乳桿菌Lactobacillus paracasei99100.00GQ-3-12副干酪乳桿菌Lactobacillus paracasei9999.93GQ-5-3副干酪乳桿菌Lactobacillus paracasei9999.93GQ-5-8副干酪乳桿菌Lactobacillus paracasei9999.93GQ-3-21布氏乳桿菌Lactobacillus buchneri9999.73Y-3-15糞腸球菌Enterococcus faecalis9999.93

Lactobacillus plantarum：植物乳桿菌；Lactobacillus brucelli：布氏乳桿菌；Lactobacillus paracasei：副干酪乳桿菌；Enterococcus faecalis：糞腸球菌。

2.3 乳酸菌生長(zhǎng)性能評(píng)價(jià)

乳酸菌生長(zhǎng)曲線如圖3所示，其中生長(zhǎng)速度快的菌株為GQ-3-2、GQ-3-6、GQ-3-8、GQ-3-9、GQ-3-12、GQ-3-18、GQ-3-19、GQ-3-26、GQ-3-29、GQ-3-31、GQ-5-1、GQ-5-2、GQ-5-6、Y-3-15、Y-3-22，它們?cè)诎l(fā)酵2 h進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。其中增殖能力較強(qiáng)的菌株為GQ-3-2、GQ-3-8、GQ-3-12、Y-3-22、GQ-3-26、GQ-3-19、GQ-5-6，生長(zhǎng)穩(wěn)定期的OD600值大于2.0。最快進(jìn)入生長(zhǎng)穩(wěn)定期的菌株為Y-3-15，在10 h進(jìn)入生長(zhǎng)穩(wěn)定期，其OD600值小于1.5。生長(zhǎng)速度較慢但增殖能力強(qiáng)的菌株為GQ-3-21、GQ-5-8、GQ-3-28和GQ-3-20，分別于6、14和16 h進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，其中GQ-3-21在16 h進(jìn)入生長(zhǎng)穩(wěn)定期，GQ-5-8和GQ-3-20在28 h進(jìn)入生長(zhǎng)穩(wěn)定期，這3株菌生長(zhǎng)穩(wěn)定期的OD600值都大于2.0。生長(zhǎng)速度最慢但增殖能力較強(qiáng)的菌株為GQ-5-4、FB-4-2、GQ-5-9，在0～8 h為生長(zhǎng)遲滯期，在26 h進(jìn)入生長(zhǎng)穩(wěn)定期，生長(zhǎng)穩(wěn)定期的OD600值都大于2.0。生長(zhǎng)速度慢且增殖能力較弱的菌株為GQ-3-1、GQ-3-5、GQ-3-10、GQ-3-16、GQ-3-17，生長(zhǎng)穩(wěn)定期的OD600值小于2.0。

圖3 乳酸菌生長(zhǎng)曲線

2.4 乳酸菌產(chǎn)酸速率曲線

乳酸菌產(chǎn)酸速率曲線如圖4所示，其中產(chǎn)酸速度快的菌株為GQ-3-1、GQ-3-2、GQ-3-3、GQ-3-5、GQ-3-6、GQ-3-7、GQ-3-8、GQ-3-9、GQ-3-10、GQ-3-12、GQ-3-15、GQ-3-16、GQ-3-17、GQ-3-18、GQ-3-19、GQ-3-21、GQ-3-22、GQ-3-25、GQ-3-26、GQ-3-27、GQ-3-29、GQ-3-30、GQ-3-31、GQ-5-1、GQ-5-2、GQ-5-4、GQ-5-6、GQ-5-7、Y-3-22，這些菌株在發(fā)酵0～16 h的pH均能快速下降，其中產(chǎn)酸最快的菌株為GQ-3-2，在發(fā)酵0～2 h時(shí)菌液pH下降速度最快，已經(jīng)降至5.0以下。產(chǎn)酸速度慢的菌株為GQ-3-11、GQ-3-28、GQ-5-9、FB-4-2、GQ-3-20、GQ-5-8、GQ-5-3、Y-3-15、GQ-3-28。另外大部分菌株在發(fā)酵12 h時(shí)菌液pH相對(duì)較低(<3.5)，而菌株GQ-3-30、GQ-3-22、GQ-5-1、FB-4-2、GQ-3-20、GQ-5-8、GQ-5-3、Y-3-15、GQ-3-28在發(fā)酵12 h時(shí)菌液pH相對(duì)較高(>3.5)。菌株Y-3-15在發(fā)酵48 h菌液pH最高，為3.99，其余菌株發(fā)酵48 h的菌液pH均在3.5以下。

2.5 乳酸菌耐酸性能

乳酸菌的耐酸性能見(jiàn)圖5，在pH 4.0的條件下，存活率最低的菌株為Y-3-15，存活率為15%，其余菌株存活率均大于50%。在pH 3.5的條件下，所有菌株存活率均大于10%，其中存活率較高的菌株為GQ-3-18、GQ-3-19、GQ-3-29、GQ-5-6、GQ-5-7、Y-3-22，這些菌株存活率均大于30%。在pH 3.0的條件下，存活率最高的菌株為Y-3-15，存活率為14%，其余所有菌株存活率均低于10%。

數(shù)據(jù)柱標(biāo)相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.6 乳酸菌抑菌性能

乳酸菌抑菌性能測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3和圖6。能夠抑制大腸桿菌的菌株有24株，其中抑制作用由強(qiáng)到弱的菌株依次為GQ-3-3、GQ-3-17、GQ-5-3、GQ-3-2、GQ-3-5、GQ-3-10、GQ-3-12、GQ-3-29、GQ-5-4、GQ-3-19、GQ-3-26、GQ-3-27、GQ-3-28、GQ-5-2、GQ-5-7、GQ-5-8、Y-3-15和Y-3-22。能夠抑制沙門氏菌的菌株有12株，其中抑制作用由強(qiáng)到弱的菌株依次為GQ-5-7、GQ-3-2、GQ-3-5、GQ-3-6、GQ-3-20、GQ-3-22、GQ-3-29、GQ-5-4。能夠抑制金黃色葡萄球菌的菌株有18株，其中抑制作用由強(qiáng)到弱的菌株依次為GQ-3-10、GQ-3-28、GQ-5-8、FB-4-2、GQ-3-2、GQ-3-20、GQ-3-27、GQ-3-29、GQ-5-3、GQ-5-4、GQ-5-9和Y-3-22。對(duì)鼠傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌及大腸桿菌均具有抑制作用的菌株為GQ-3-2、GQ-3-29、GQ-5-4。

表3 37株可飼用乳酸菌對(duì)沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌性能

續(xù)表3菌株編號(hào)Strain number沙門氏菌Salmonella金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus大腸桿菌Escherichia coliGQ-3-11NENENEGQ-3-12NE++++GQ-3-15NE+NEGQ-3-16NE+NEGQ-3-17+NE++++GQ-3-18+NENEGQ-3-19NENE++GQ-3-20++++NEGQ-3-21NENENEGQ-3-22++NE+GQ-3-25NENE+GQ-3-26+NE++GQ-3-27NE++++GQ-3-28NE++++++GQ-3-29+++++++GQ-3-30NENENEGQ-3-31NENE+GQ-5-1+NENEGQ-5-2NE+++GQ-5-3NE++++++GQ-5-4+++++++GQ-5-6NENENEGQ-5-7++++NE++GQ-5-8NE+++++GQ-5-9NE+++FB-4-2NE++++Y-3-15NE+++Y-3-22NE++++

NE：無(wú)抑制作用 without inhibition；+：抑菌圈直徑8～10 mm inhibition zone diameter 8 to 10 mm；++：抑菌圈直徑10～12 mm inhibition zone diameter 10 to 12 mm；+++：抑菌圈直徑12～14 mm inhibition zone diameter 12 to 14 mm；++++：抑菌圈直徑14～16 mm inhibition zone diameter 14 to 16 mm。

A：沙門氏菌 Salmonella；B：金黃色葡萄球菌 Staphylococcus aureus；C：大腸桿菌 Escherichia coli。

2.7 乳酸菌候選菌株之間拮抗性

圖7為候選菌株Y-3-15、GQ-5-4、GQ-3-29、GQ-3-21和GQ-3-2之間的拮抗性分析結(jié)果，圖7-A顯示菌株GQ-5-4、GQ-3-29、GQ-3-21和GQ-3-2與指示菌株Y-3-15之間無(wú)拮抗作用；圖7-B顯示菌株Y-3-15、GQ-3-29、GQ-3-21和GQ-3-2與指示菌株GQ-5-4之間無(wú)拮抗作用；圖7-C顯示菌株Y-3-15、GQ-5-4、GQ-3-21和GQ-3-2與指示菌株GQ-3-29之間無(wú)拮抗作用；圖7-D顯示菌株Y-3-15、GQ-5-4、GQ-3-29、GQ-3-2與指示菌株GQ-3-21之間無(wú)拮抗作用；圖7-E顯示菌株Y-3-15、GQ-5-4、GQ-3-29、GQ-3-21與指示菌株GQ-3-2之間無(wú)拮抗作用。5株菌株之間無(wú)拮抗作用，各菌株之間不會(huì)相互抑制生長(zhǎng)。

A：菌株Y-3-15 strain Y-3-15；B：菌株GQ-5-4 strain GQ-5-4；C：菌株GQ-3-29 strain GQ-3-29；D：菌株GQ-3-21 strain GQ-3-21；E：菌株GQ-3-2 strain GQ-3-2。

3 討 論

3.1 乳酸菌菌株分離與鑒定

現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，青貯發(fā)酵可以改善構(gòu)樹(shù)的適口性，降低毒性，同時(shí)提高營(yíng)養(yǎng)成分的消化率[13]，但由于調(diào)制技術(shù)和菌株來(lái)源不同，造成構(gòu)樹(shù)青貯的品質(zhì)差異較大[14]。乳酸菌為青貯發(fā)酵過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)微生物，因此，特異性乳酸菌的篩選對(duì)保證構(gòu)樹(shù)青貯質(zhì)量至關(guān)重要。本試驗(yàn)分別從構(gòu)樹(shù)青貯、玉米青貯和飼喂構(gòu)樹(shù)青貯的羔羊糞便中分離出植物乳桿菌、副干酪乳桿菌、布氏乳桿菌和糞腸球菌4種可飼用菌種，經(jīng)鑒定均為乳桿菌屬(Lactobacillus)。其中來(lái)自構(gòu)樹(shù)青貯的最多，為34株，而來(lái)自玉米青貯和飼喂構(gòu)樹(shù)青貯的羔羊糞便的相對(duì)較少，分別為2株和1株。張紅梅等[15]研究也表明，乳桿菌屬為青貯發(fā)酵期促進(jìn)青貯發(fā)酵的主要微生物。但是，本研究中從玉米青貯中分離得到的乳酸菌較少，分析可能的原因有2個(gè)，一個(gè)是所采集玉米青貯在調(diào)制過(guò)程中未添加任何發(fā)酵劑；另一個(gè)原因是所采集的青貯飼料在青貯塔中已貯存6個(gè)月，在低pH和較低水溶性碳水化合物條件下，飼料中存活的乳酸菌較少。因此，后續(xù)研究中有必要開(kāi)展飼料營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的評(píng)價(jià)，以確認(rèn)添加乳酸菌對(duì)青貯質(zhì)量的影響。

3.2 乳酸菌生長(zhǎng)與產(chǎn)酸性能評(píng)價(jià)

生長(zhǎng)和產(chǎn)酸性能是評(píng)價(jià)青貯用優(yōu)良乳酸菌的重要指標(biāo)。生長(zhǎng)速度快有助于乳酸菌快速繁殖成為飼料中優(yōu)勢(shì)菌群，從而競(jìng)爭(zhēng)性的抑制其他好氧菌活動(dòng)[11]。產(chǎn)酸速度快能夠促使乳酸生成，進(jìn)而迅速降低pH，抑制有害微生物生長(zhǎng)，降低飼料營(yíng)養(yǎng)損失。蔡義民等[16]研究顯示，乳酸球菌在發(fā)酵初期能夠快速繁殖，在乳酸發(fā)酵中起先導(dǎo)作用。已有研究中，王蔚淼等[13]對(duì)從酸奶、酸菜、山芋及青貯來(lái)源中分離到的10株菌進(jìn)行生長(zhǎng)特性的評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，乳酸菌對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期為發(fā)酵12～24 h，這與本研究結(jié)果中副干酪乳桿菌GQ-5-8及植物乳桿菌GQ-3-20結(jié)果一致。靳勝男等[14]評(píng)價(jià)了2株豬源乳酸菌的生長(zhǎng)特性，結(jié)果顯示乳酸菌在發(fā)酵4 h時(shí)進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，生長(zhǎng)穩(wěn)定期于發(fā)酵14 h開(kāi)始。何江波等[11]通過(guò)評(píng)價(jià)青海黑藏羊及西藏白絨山羊瘤胃內(nèi)容物來(lái)源的乳酸菌的生物學(xué)特性發(fā)現(xiàn)，2株戊糖片球菌在4 h進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，16 h進(jìn)入穩(wěn)定期，24 h菌液pH小于4.0；1株海氏腸球菌在2 h 進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，12 h進(jìn)入穩(wěn)定期，24 h后pH小于4.5；2株戊糖乳桿菌均在2 h進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，16 h進(jìn)入穩(wěn)定期，16 h后pH小于4.0。這與本研究部分菌株結(jié)果一致，但本研究分離得到的乳酸菌菌株生長(zhǎng)速度各有不同，具有生長(zhǎng)速度及產(chǎn)酸能力更強(qiáng)的乳酸菌，生長(zhǎng)延滯期更短，具有作為優(yōu)良青貯接種菌的潛能，植物乳桿菌GQ-3-2、GQ-3-29、GQ-5-4能夠最快進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，布氏乳桿菌GQ-3-21在6 h后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，最終菌液濃度較高，且上述菌株在發(fā)酵12 h時(shí)pH均小于4.0。另外本研究中產(chǎn)酸速度最快的菌株是GQ-3-2，pH在發(fā)酵2 h已經(jīng)降至5以下。糞腸球菌Y-3-15發(fā)酵開(kāi)始生長(zhǎng)速度很快，進(jìn)入生長(zhǎng)穩(wěn)定期太早(發(fā)酵10 h)導(dǎo)致其穩(wěn)定期菌液濃度低，相對(duì)應(yīng)的其pH最終未達(dá)到3.5以下。這說(shuō)明菌株GQ-3-2、GQ-3-29及GQ-5-4可作為候選菌株，在青貯發(fā)酵初期快速降低pH方面發(fā)揮作用。

3.3 乳酸菌耐酸性能評(píng)價(jià)

耐酸性能是評(píng)價(jià)青貯用乳酸菌的另一重要標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)全株玉米青貯的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(T/CAAA 005—2018)，pH小于4.2的全株玉米青貯為優(yōu)質(zhì)青貯。而且，良好的耐酸能力有助于乳酸菌適應(yīng)青貯中的低pH環(huán)境，直接影響青貯后期的發(fā)酵效果[15]。已有研究中，白長(zhǎng)勝等[17]從玉米、酸菜和淘米水中分離得到3株耐酸性能較好的菌株，這3株乳酸菌在pH 3.0的存活率大于10%，說(shuō)明耐酸能力較強(qiáng)。在本研究中，我們測(cè)定了37株乳酸菌對(duì)pH 3.0、3.5和4.0的耐受性，發(fā)現(xiàn)菌株GQ-3-18、GQ-3-19、GQ-3-29、GQ-5-6、GQ-5-7、Y-3-22在pH 3.5能夠較好存活，而當(dāng)pH降至3.0時(shí)，只有糞腸球菌Y-3-15存活率較高。而且，糞腸球菌Y-3-15對(duì)酸堿度從pH 4.0至pH 3.0的下降表現(xiàn)不敏感，存活率不會(huì)隨pH的下降表現(xiàn)明顯變化。這說(shuō)明菌株Y-3-15可作為構(gòu)樹(shù)青貯飼料發(fā)酵的候選菌株。

3.4 乳酸菌抑菌性能評(píng)價(jià)

乳酸菌對(duì)病原菌和腐敗菌的抑菌活性在抑制不良微生物發(fā)酵方面具有重要意義。具有良好抑菌性能的菌株通過(guò)抑制不良菌株生長(zhǎng)而保證飼料的衛(wèi)生安全[18]和動(dòng)物腸道健康。已有研究中，鄭昕等[19]從健康雞盲腸內(nèi)容物中分離的7株乳酸菌對(duì)大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌均具有抑制作用。雷曉青等[18]評(píng)價(jià)3株乳酸菌的抑菌性能，發(fā)現(xiàn)3株乳酸菌對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均具有抑制作用。此外，已有研究發(fā)現(xiàn)，在大多數(shù)菌株中觀察到的抗菌活性來(lái)自發(fā)酵代謝的最終產(chǎn)物[20]，包括有機(jī)酸、細(xì)菌素[21-22]和過(guò)氧化氫，但乳酸菌產(chǎn)生積累過(guò)氧化氫依賴于環(huán)境中較高的氧濃度及較低溫度。本研究中，菌株GQ-3-2、GQ-3-29、GQ-5-4對(duì)沙門氏菌、金黃色葡萄球菌及大腸桿菌均具有抑制作用，可做為候選菌株用于青貯發(fā)酵。這些菌株的抑菌性能除了與產(chǎn)生的有機(jī)酸有關(guān)外，也可能存在其他化合物參與，有待后續(xù)進(jìn)一步研究 。

3.5 乳酸菌候選菌株之間拮抗性評(píng)價(jià)

本研究中分別從生長(zhǎng)及產(chǎn)酸性能、耐酸性能以及抑菌性能等方面評(píng)價(jià)篩選后，確定GQ-3-2、GQ-3-29、GQ-5-4、Y-3-15和GQ-3-21作為候選菌株用于后期構(gòu)樹(shù)青貯飼料發(fā)酵。但是，不同菌株之間的合理配伍是優(yōu)化發(fā)酵飼料品質(zhì)的前提與關(guān)鍵[17]。因此，為了進(jìn)一步確定候選菌株糞腸球菌Y-3-15及布氏乳桿菌GQ-3-21與植物乳桿菌GQ-3-2、GQ-3-29、GQ-5-4之間無(wú)拮抗作用、不會(huì)互相抑制生長(zhǎng)，本研究進(jìn)行菌株拮抗性試驗(yàn)，結(jié)果顯示各菌株之間不存在抑制作用，可以作為復(fù)合制劑的備用菌株。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)研究成功篩選出5株優(yōu)良發(fā)酵乳酸菌，其中3株植物乳桿菌、1株糞腸球菌、1株布氏乳桿菌，且菌株之間無(wú)拮抗作用，可為下一步乳酸菌復(fù)合制劑的制作和應(yīng)用提供理論依據(jù)，為開(kāi)發(fā)構(gòu)樹(shù)青貯用乳酸菌提供試驗(yàn)材料。