鄭 旭 饒志勇 孟春顏 李 玥 張 薇 郭永鵬 吳 迪 王志祥*

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，鄭州 450002；2.晨光生物科技集團(tuán)股份有限公司，邯鄲 057250)

現(xiàn)代集約化養(yǎng)殖方式極大地提高了畜牧業(yè)生產(chǎn)效率，但是也帶來(lái)了很多動(dòng)物健康問(wèn)題。肉雞因具有代謝旺盛、抗應(yīng)激能力較差等特點(diǎn)，在高度規(guī)模化養(yǎng)殖條件下極易遭受外界環(huán)境及病原微生物的刺激，導(dǎo)致自由基過(guò)量產(chǎn)生，造成氧化損傷，使其生長(zhǎng)性能及畜產(chǎn)品品質(zhì)受到嚴(yán)重影響[1-2]。此外，畜禽飼糧中通常使用大量油脂來(lái)滿足其較高的能量需求，但是油脂中的多不飽和脂肪酸極易氧化酸敗，并同時(shí)引起飼糧中蛋白質(zhì)和維生素的氧化損傷，導(dǎo)致養(yǎng)分溶解度和可消化性降低，飼糧品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值下降。不僅如此，畜禽采食氧化飼糧還會(huì)影響其消化吸收過(guò)程，降低機(jī)體免疫和抗氧化能力，影響健康生長(zhǎng)[3-4]。因此，適量使用抗氧化添加劑來(lái)保障飼糧品質(zhì)，提高畜禽抗氧化能力，使其生長(zhǎng)潛能得到最大限度地發(fā)揮是提高畜牧業(yè)經(jīng)濟(jì)效益的關(guān)鍵[5]。

近年來(lái)，隨著傳統(tǒng)合成抗氧化劑效率低、毒副作用強(qiáng)等缺點(diǎn)不斷顯現(xiàn)[6]，研發(fā)安全高效無(wú)毒的天然抗氧化劑已成為飼料行業(yè)的熱點(diǎn)問(wèn)題[7]。研究表明，黃酮類化合物具備抗氧化、降血脂、抗腫瘤以及改善腸道菌群等[8-11]多種生物學(xué)功能，在食品、藥物等領(lǐng)域均表現(xiàn)出了良好的作用效果[12]。畜禽飼糧中使用黃酮類飼料添加劑可以有效改善機(jī)體氧化還原狀態(tài)[13]，在一定程度上緩解氧化損傷[14]，促進(jìn)畜禽健康生長(zhǎng)[15]。槲皮萬(wàn)壽菊素(quercetagetin)化學(xué)名稱為3,3,4,5,6,7-六羥基黃酮(化學(xué)式為C15H10O8)，是提取自萬(wàn)壽菊的主要活性成分之一，屬于黃酮類化合物中的黃酮醇類[16]。槲皮萬(wàn)壽菊素的體外抗氧化試驗(yàn)證實(shí)其具有較強(qiáng)的清除2,2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基(DPPH)、2,2′-聯(lián)氨-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺鹽(ABTS)和羥基自由基(·OH)的能力[17-18]，且關(guān)于其對(duì)肉雞生長(zhǎng)性能和免疫功能的影響已有部分報(bào)道，但其對(duì)肉雞抗氧化能力及作用機(jī)制的研究還較少。因此，本試驗(yàn)旨在探究槲皮萬(wàn)壽菊素對(duì)肉雞生長(zhǎng)性能、養(yǎng)分表觀消化率和抗氧化能力的影響，以期為天然抗氧化劑的研發(fā)和槲皮萬(wàn)壽菊素在肉雞養(yǎng)殖中的合理應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物和試驗(yàn)材料

試驗(yàn)動(dòng)物：愛(ài)拔益加(AA)肉雞，購(gòu)自河南田中禾農(nóng)牧有限公司。

試驗(yàn)材料：槲皮萬(wàn)壽菊素，主要功能成分含量為81.88%，由河北某生物科技集團(tuán)股份有限公司提供，以粉劑的形式拌料添加。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)選用480只健康1日齡AA肉雞，隨機(jī)分為4個(gè)組，每組6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)20只雞。對(duì)照組飼喂玉米-豆粕型基礎(chǔ)飼糧，試驗(yàn)組飼喂在基礎(chǔ)飼糧中分別添加10、50和100 mg/kg槲皮萬(wàn)壽菊素的試驗(yàn)飼糧。試驗(yàn)期42 d，分為前期1～21日齡和后期22～42日齡?；A(chǔ)飼糧為參照AA肉雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)配制的粉狀配合飼料，其組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)前對(duì)雞舍及器具進(jìn)行消毒處理。飼養(yǎng)過(guò)程采用3層立體籠養(yǎng)，試驗(yàn)期間所有雞只自由采食和飲水。雞舍采用鍋爐控溫，自然光照加人工補(bǔ)光，相對(duì)濕度為50%～60%，自然通風(fēng)結(jié)合縱向負(fù)壓通風(fēng)，定期打掃雞舍，常規(guī)防疫和免疫。每天觀察記錄試驗(yàn)雞采食、飲水及健康狀況，及時(shí)記錄試驗(yàn)雞死淘情況及耗料量。

1.4 樣品采集

在試驗(yàn)的第22天和第43天，從每個(gè)重復(fù)中選取1只接近平均體重的健康雞，進(jìn)行翅靜脈采血，靜置4 h，3 600 r/min離心10 min制備血清，-80 ℃凍存。其中，第43天采血后再進(jìn)行頸靜脈放血處死，解剖得到肝臟、胸肌樣品，-80 ℃凍存，測(cè)定前使用勻漿機(jī)制備肝臟、胸肌勻漿液備用。

1.5 指標(biāo)測(cè)定及方法

1.5.1 生長(zhǎng)性能

試驗(yàn)第21天和第42天20：00開(kāi)始禁食，自由飲水，分別在第1、22和43天對(duì)肉雞以重復(fù)為單位稱重，準(zhǔn)確記錄肉雞體重及耗料量。

1.5.2 養(yǎng)分表觀消化率

采用全收糞法，每個(gè)重復(fù)隨機(jī)挑選2只接近平均體重的健康雞，收集試驗(yàn)第38～41天全部排泄物稱重，并準(zhǔn)確記錄期間采食量。收集糞樣后加入10%硫酸溶液混勻，并在60～65 ℃烘干至恒重，自然狀態(tài)下回潮24 h，稱重記錄，粉碎后過(guò)40目篩備用。飼糧和糞樣中粗蛋白質(zhì)含量采用凱氏定氮法測(cè)定，粗脂肪含量采用乙醚浸提法測(cè)定，鈣含量采用乙二胺四乙酸二鈉絡(luò)合滴定法測(cè)定，磷含量采用鉬黃比色法測(cè)定。

1.5.3 抗氧化能力

采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒測(cè)定血清、肝臟和胸肌總抗氧化能力(T-AOC)和超氧化物岐化酶(SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)活性以及丙二醛(MDA)含量，測(cè)定時(shí)嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.5.4 肝臟和胸肌核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)/抗氧化反應(yīng)元件(ARE)信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)

采用Trizol法提取肝臟和胸肌中的總RNA，按照TaKaRa Prime ScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)說(shuō)明書(shū)制備cDNA，采用TaKaRa TB Green?Premix Ex TaqTMⅡ說(shuō)明書(shū)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司設(shè)計(jì)合成，選用三磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)參基因，根據(jù)2-ΔΔCt法對(duì)定量結(jié)果進(jìn)行計(jì)算分析。引物序列見(jiàn)表2。

表2 引物序列

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，并用Duncan氏法進(jìn)行多重比較，同時(shí)對(duì)槲皮萬(wàn)壽菊素添加水平與效應(yīng)進(jìn)行回歸分析。結(jié)果數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，以P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼糧中添加槲皮萬(wàn)壽菊素對(duì)肉雞生長(zhǎng)性能的影響

由表3可知，與對(duì)照組相比，50和100 mg/kg槲皮萬(wàn)壽菊素添加組肉雞42日齡體重顯著提高(P<0.05)。1～21日齡，與對(duì)照組相比，50和100 mg/kg槲皮萬(wàn)壽菊素添加組料重比(F/G)顯著降低(P<0.05)。22～42日齡，與對(duì)照組相比，50和100 mg/kg槲皮萬(wàn)壽菊素添加組F/G顯著降低(P<0.05)。1～42日齡，與對(duì)照組相比，50和100 mg/kg槲皮萬(wàn)壽菊素添加組肉雞平均日增重(ADG)顯著提高(P<0.05)，平均日采食量(ADFI)和F/G均顯著降低(P<0.05)。各組肉雞其他生長(zhǎng)性能指標(biāo)之間無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表3 飼糧中添加槲皮萬(wàn)壽菊素對(duì)肉雞生長(zhǎng)性能的影響

由表4可知，對(duì)生長(zhǎng)性能相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行二次曲線擬合，以42日齡體重、22～42日齡和1～42日齡ADG以及各階段F/G為依據(jù)，肉雞飼糧中槲皮萬(wàn)壽菊素的適宜添加水平為64.91～68.42 mg/kg。

表4 基于回歸模型對(duì)肉雞飼糧中槲皮萬(wàn)壽菊素適宜添加水平的估算

2.2 飼糧中添加槲皮萬(wàn)壽菊素對(duì)肉雞養(yǎng)分表觀消化率的影響

由表5可知，與對(duì)照組相比，50 mg/kg槲皮萬(wàn)壽菊素添加組肉雞粗蛋白質(zhì)表觀消化率顯著提高(P<0.05)，10 mg/kg槲皮萬(wàn)壽菊素添加組肉雞粗脂肪表觀消化率顯著提高(P<0.05)。各組肉雞鈣、磷和粗灰分表觀消化率之間均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

表5 飼糧中添加槲皮萬(wàn)壽菊素對(duì)肉雞養(yǎng)分表觀消化率的影響

2.3 飼糧中添加槲皮萬(wàn)壽菊素對(duì)肉雞抗氧化能力的影響

2.3.1 飼糧中添加槲皮萬(wàn)壽菊素對(duì)肉雞血清抗氧化指標(biāo)的影響

由表6可知，21日齡時(shí)，與對(duì)照組相比，50和100 mg/kg槲皮萬(wàn)壽菊素添加組肉雞血清GSH-Px活性顯著提高(P<0.05)；此外，飼糧中添加不同水平槲皮萬(wàn)壽菊素對(duì)肉雞血清MDA含量、T-AOC以及SOD活性均無(wú)顯著影響(P>0.05)。42日齡時(shí)，與對(duì)照組相比，10、50和100 mg/kg槲皮萬(wàn)壽菊素添加組肉雞血清GSH-Px活性均顯著提高(P<0.05)，各組肉雞血清T-AOC、SOD活性和MDA含量之間均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

表6 飼糧中添加槲皮萬(wàn)壽菊素對(duì)肉雞血清抗氧化指標(biāo)的影響

2.3.2 飼糧中添加槲皮萬(wàn)壽菊素對(duì)肉雞組織抗氧化指標(biāo)的影響

由表7可知，與對(duì)照組相比，10和50 mg/kg槲皮萬(wàn)壽菊素添加組肉雞肝臟GSH-Px活性顯著提高(P<0.05)；但各組肉雞肝臟T-AOC、MDA含量和SOD活性之間均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。與對(duì)照組相比，10 mg/kg槲皮萬(wàn)壽菊素添加組肉雞胸肌T-AOC和SOD活性顯著提高(P<0.05)；但各組肉雞胸肌MDA含量和GSH-Px活性之間均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

表7 飼糧中添加槲皮萬(wàn)壽菊素對(duì)肉雞組織抗氧化指標(biāo)的影響

2.4 飼糧中添加槲皮萬(wàn)壽菊素對(duì)肉雞Nrf2/ARE信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)的影響

2.4.1 飼糧中添加槲皮萬(wàn)壽菊素對(duì)肉雞肝臟Nrf2/ARE信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)的影響

由圖1可知，與對(duì)照組相比，50 mg/kg槲皮萬(wàn)壽菊素添加組肉雞肝臟Nrf2的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著提高(P<0.05)，10、50和100 mg/kg槲皮萬(wàn)壽菊素添加組肉雞肝臟谷胱甘肽過(guò)氧化物酶1(GPX1)的mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著提高(P<0.05)；各組肉雞肝臟超氧化物歧化酶1(SOD1)和谷氨酸半胱氨酸連接酶調(diào)節(jié)亞基(GCLm)的mRNA相對(duì)表達(dá)量之間無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

2.4.2 飼糧中添加槲皮萬(wàn)壽菊素對(duì)肉雞胸肌Nrf2/ARE信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)的影響

由圖2可知，與對(duì)照組相比，10、50和100 mg/kg槲皮萬(wàn)壽菊素添加組肉雞胸肌Nrf2和GPX1的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著提高(P<0.05)，50 mg/kg槲皮萬(wàn)壽菊素添加組肉雞胸肌GCLm的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著提高(P<0.05)；各組肉雞胸肌SOD1的mRNA相對(duì)表達(dá)量之間無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

3 討 論

3.1 飼糧中添加槲皮萬(wàn)壽菊素對(duì)肉雞生長(zhǎng)性能的影響

研究表明，黃酮類化合物可以促進(jìn)生長(zhǎng)激素的生成和釋放[19]，促進(jìn)畜禽對(duì)養(yǎng)分的消化吸收[20]，在肉雞飼糧中使用可以改善其生長(zhǎng)性能[21]。Ouyang等[22]在飼糧中添加15 mg/kg苜蓿黃酮提高了AA肉雞ADG。Goliomytis等[23]研究表明，飼糧添加0.5～1.0 g/kg槲皮素對(duì)肉雞ADG和ADFI無(wú)顯著影響，但是F/G與對(duì)照組相比有所下降。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在基礎(chǔ)飼糧中添加不同水平槲皮萬(wàn)壽菊素同樣提高了肉雞生長(zhǎng)性能，其中飼糧添加50和100 mg/kg槲皮萬(wàn)壽菊素顯著提高了肉雞1～42日齡ADG，并顯著降低了各階段F/G；另外，本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，50和100 mg/kg槲皮萬(wàn)壽菊素添加組肉雞1～42日齡ADFI較對(duì)照組顯著下降，此現(xiàn)象在Yang等[24]、李麗平等[25]的試驗(yàn)中也存在，初步分析可能是黃酮類化合物氣味酸澀，適口性較差，導(dǎo)致肉雞采食量略有下降[26]。但是，由于黃酮類化合物的體外抗氧化功能可以有效減緩飼糧中油脂和蛋白質(zhì)的氧化程度，提高飼糧質(zhì)量，在一定程度上可以促進(jìn)肉雞采食后養(yǎng)分的吸收利用，所以最終反而促進(jìn)了肉雞生長(zhǎng)[27]。

數(shù)據(jù)柱標(biāo)注不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)。下圖同。

3.2 飼糧中添加槲皮萬(wàn)壽菊素對(duì)肉雞養(yǎng)分表觀消化率的影響

黃酮類化合物具有良好的廣譜抗菌性，可調(diào)控腸道微生物的分布[28]，通過(guò)促進(jìn)有益菌群的繁殖抑制有害菌群的生長(zhǎng)，進(jìn)而改善消化道內(nèi)環(huán)境，促進(jìn)消化酶的分泌[29]，最終提高畜禽對(duì)飼糧中養(yǎng)分的吸收利用。王盛楠[30]研究表明，飼糧中添加0.02%槲皮素可顯著提高AA肉雞蛋白質(zhì)表觀消化率和胃蛋白酶活性，促進(jìn)胸肌中蛋白質(zhì)沉積。李垚等[31]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧添加0.1%和0.2%沙棘黃酮顯著提高了飼糧蛋白質(zhì)利用率，從而提升肉雞胴體品質(zhì)，并顯著改善肉品質(zhì)。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在肉雞飼糧中添加10和50 mg/kg槲皮萬(wàn)壽菊素也分別顯著提高了粗脂肪和粗蛋白質(zhì)的表觀消化率。其中，飼糧粗蛋白質(zhì)表觀消化率的提高一方面可以節(jié)省飼糧成本，緩解糧食資源緊缺問(wèn)題；另一方面可以促進(jìn)畜禽體內(nèi)蛋白質(zhì)的沉積，改善肉品質(zhì)[32-33]。結(jié)合肉雞生長(zhǎng)情況分析發(fā)現(xiàn)，槲皮萬(wàn)壽菊素對(duì)飼糧中粗蛋白質(zhì)和粗脂肪表觀消化率的改善作用可能也是肉雞生長(zhǎng)性能有所提高的原因之一。

3.3 飼糧中添加槲皮萬(wàn)壽菊素對(duì)肉雞抗氧化能力的影響

氧化還原狀態(tài)在很大程度上可以反映機(jī)體的健康狀況，畜禽體內(nèi)通常存在多種抗氧化酶來(lái)調(diào)節(jié)氧化還原平衡[34-36]。多項(xiàng)研究表明，黃酮類化合物可通過(guò)激活抗氧化系統(tǒng)來(lái)提高抗氧化酶活性[37]，緩解氧化應(yīng)激[38]，提高機(jī)體抗氧化能力。丘富安等[39]研究發(fā)現(xiàn)，車前子黃酮可以顯著提高環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激蛋雞的血清T-AOC以及SOD、GSH-Px和過(guò)氧化氫酶(CAT)活性，并顯著降低血清MDA含量。張毅峰[40]研究表明，飼糧中添加3.75 mg/kg槲皮萬(wàn)壽菊素顯著提高了肉雞42日齡血清SOD和GSH-Px活性以及T-AOC，顯著降低了血清MDA含量。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在肉雞飼糧中添加10、50和100 mg/kg槲皮萬(wàn)壽菊素也不同程度提高了血清和肝臟GSH-Px活性，并提高了胸肌T-AOC和SOD活性，說(shuō)明飼糧添加槲皮萬(wàn)壽菊素可以提高組織抗氧化酶活性，同時(shí)減少脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物生成，從而增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力，為畜禽生長(zhǎng)發(fā)育提供更加健康的環(huán)境。同時(shí)，肌肉抗氧化性能的提升也會(huì)緩解組織中蛋白質(zhì)、核酸等大分子物質(zhì)的氧化損傷，減少過(guò)氧化產(chǎn)物堆積對(duì)組織形態(tài)功能的破壞，使肉品質(zhì)有所改善，貨架期得到延長(zhǎng)。

圖2 飼糧中添加槲皮萬(wàn)壽菊素對(duì)肉雞胸肌Nrf2/ARE信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)的影響

Nrf2/ARE信號(hào)通路是至今為止發(fā)現(xiàn)的最為重要的抗氧化和防御信號(hào)通路，可調(diào)控下游二相解毒酶(GCLm)和抗氧化酶(SOD1、GPX1)基因表達(dá)，從而提高機(jī)體清除自由基的能力[41]，調(diào)節(jié)機(jī)體氧化還原平衡。Nrf2是調(diào)控動(dòng)物體內(nèi)抗氧化等保護(hù)機(jī)制的重要核轉(zhuǎn)錄因子，Nrf2核轉(zhuǎn)位可激活Nrf2/ARE信號(hào)通路[42]。SOD1和GPX1是通路下游重要的抗氧化酶，直接參與機(jī)體氧化還原反應(yīng)；GCLm對(duì)非酶抗氧化物谷胱甘肽(GSH)的合成起到重要作用。劉佳人等[43]研究表明，蒲公英黃酮能夠顯著上調(diào)小鼠血清和肝臟中抗氧化基因SOD1、超氧化物歧化酶2(SOD2)、GPX1和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶4(GPX4)的mRNA表達(dá)量。Ishfaq等[44]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧添加450 mg/kg黃芩苷顯著提高了肉雞脾臟Nrf2的mRNA和蛋白表達(dá)水平，激活了Nrf2/ARE信號(hào)通路。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在飼糧中添加10、50和100 mg/kg槲皮萬(wàn)壽菊素不同程度提高了肉雞肝臟和胸肌中Nrf2、GPX1和GCLm的mRNA相對(duì)表達(dá)量，這與機(jī)體抗氧化酶活性升高的趨勢(shì)是一致的，說(shuō)明肉雞飼糧中添加槲皮萬(wàn)壽菊素可以通過(guò)上調(diào)組織Nrf2/ARE信號(hào)通路相關(guān)抗氧化基因的表達(dá)水平，以提高抗氧化酶活性，從而增強(qiáng)機(jī)體抵御氧化應(yīng)激的能力。此外，對(duì)機(jī)體氧化還原狀態(tài)的調(diào)節(jié)作用可能也是槲皮萬(wàn)壽菊素發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)、抗癌等其他功效的基礎(chǔ)，所以本試驗(yàn)對(duì)槲皮萬(wàn)壽菊素抗氧化功能及機(jī)制的研究也為其后續(xù)在畜牧生產(chǎn)領(lǐng)域的研究和應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

4 結(jié) 論

① 綜上所述，在肉雞飼糧中添加適宜水平的槲皮萬(wàn)壽菊素能夠改善其生長(zhǎng)性能，提高飼糧中粗蛋白質(zhì)和粗脂肪的表觀消化率，還可以通過(guò)上調(diào)Nrf2/ARE信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)的方式提高抗氧化酶活性，增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力。

② 在本試驗(yàn)條件下，綜合考慮ADG、F/G及經(jīng)濟(jì)效益等因素，槲皮萬(wàn)壽菊素在肉雞飼糧中的適宜添加水平為64.91～68.42 mg/kg。