安 沙 賈友剛 周 櫻 呂尊周 郭 爽 許崇偉 張前防 燕 磊* 周桂蓮*

(1.山東新希望六和集團有限公司，青島 266061；2.新希望六和股份有限公司，農(nóng)業(yè)部飼料及畜禽產(chǎn)品質(zhì)量安全控制重點實驗室，成都 610101；3.武漢新華揚生物股份有限公司，武漢 430206；4.萊陽六和飼料有限公司，萊陽 265200)

抗生素的耐藥性問題在肉雞生產(chǎn)中日益嚴重，歐盟已全面禁止使用抗生素，我國于2020年7月1日起，禁止飼料生產(chǎn)企業(yè)生產(chǎn)含有促生長類藥物飼料添加劑(中藥類除外)的商品飼料。因此，尋找一種安全、環(huán)保型抗生素替代品成為目前研究的熱門。酵母多肽是以優(yōu)質(zhì)鮮酵母為原料，利用生物方法降解酵母蛋白，去除酵母壁及大分子蛋白質(zhì)而制成的肽類產(chǎn)品，含有動物機體必需的8種氨基酸，是優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)來源，同時還含有多種生物活性物質(zhì)，具有多種益生功效。酵母多肽易被腸道吸收，其在胃腸運轉(zhuǎn)和吸收率方面均優(yōu)于氨基酸[1]，同時作為生物活性肽在機體內(nèi)發(fā)揮一定的生物學(xué)效應(yīng)。研究表明，生物活性肽在調(diào)節(jié)機體消化代謝、增強機體免疫、調(diào)節(jié)機體內(nèi)分泌等方面具有重要作用，應(yīng)用到動物生產(chǎn)中有助于改善動物健康、優(yōu)化動物生長性能，且安全高效，是一類理想的抗生素替代品[2]。目前，酵母多肽的應(yīng)用多集中在食品領(lǐng)域，在肉禽上的應(yīng)用研究大多停留在生長性能上，對于腸道健康的影響及機制的研究較少。因此，本試驗通過研究酵母多肽對肉雞生長性能、胴體組成和腸道微生物的影響，篩選較好的抗生素替代品，為無抗飼糧的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

酵母多肽由武漢某生物股份有限公司提供，氨基酸序列為TITLEVESSDTIDNVK。抗生素為維吉尼亞霉素，有效成分含量為50%。

1.2 試驗動物與設(shè)計

選取1日齡健康的羅斯308肉公雞540只，隨機分成3個組，每組6個重復(fù)，每個重復(fù)30只?？瞻讓φ战M飼喂基礎(chǔ)飼糧，抗生素組在基礎(chǔ)飼糧中添加20 g/t維吉尼亞霉素，酵母多肽組在基礎(chǔ)飼糧中添加200 g/t酵母多肽。試驗期37 d。

1.3 試驗飼糧

基礎(chǔ)飼糧參照育種公司推薦標準及NRC(1994)標準配制。飼糧分為1～14日齡、15～24日齡和25～37日齡3個階段飼喂，1～14日齡飼喂破碎料，15～24日齡和25～37日齡飼喂顆粒料。基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎(chǔ))

1.4 飼養(yǎng)管理

試驗雞采用3層籠養(yǎng)，自由采食和飲水，每日觀察雞群健康情況與精神狀況。采用整舍育雛，最初進雛時舍溫為32 ℃，以后每周降低2 ℃，直到26 ℃為止。按正常免疫程序進行免疫。飼養(yǎng)管理參照《羅斯308肉雞飼養(yǎng)管理手冊》執(zhí)行。

1.5 測定指標與方法

1.5.1 生長性能指標

分別在14、24和37日齡對各重復(fù)試驗雞進行空腹稱重并統(tǒng)計采食量，以重復(fù)為單位計算平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)、料重比(F/G)和成活率。

1.5.2 胴體組成指標

肉雞38日齡時，每組以重復(fù)為單位選擇接近平均體重的10只雞，稱重后屠宰，剝離腹脂(包括腹部和肌胃周圍的所有脂肪)、胸肌、腿肌、肌胃、腺胃并稱重，計算胸肌率、腿肌率、肌胃率、腺胃率，計算公式如下：

胸肌率(%)=(雙側(cè)胸肌重/活雞重)×100；
腿肌率(%)=(雙側(cè)腿肌重/活雞重)×100；
肌胃率(%)=(肌胃重/活雞重)×100；
腺胃率(%)=(腺胃重/活雞重)×100。

1.5.3 免疫器官指數(shù)

肉雞38日齡時，每組以重復(fù)為單位選擇接近平均體重的10只雞，稱重后屠宰，取法氏囊、脾臟稱重，計算免疫器官指數(shù)，計算公式如下：

免疫器官指數(shù)(g/kg)=免疫器官
重量(g)/活雞重(kg)。

1.5.4 腸道微生物指標

肉雞38日齡時，每組以重復(fù)為單位選擇接近平均體重的8只雞。處死后迅速拋開腹腔，取出胃腸道，置于冰上，然后用無菌棉線結(jié)扎消化道各段，分離十二指腸、空腸、回腸。立即在冰上無菌條件下取回腸中段食糜，液氮速凍后，用作腸道微生物區(qū)系定性、定量分析。

使用基因組DNA提取試劑盒說明書提取回腸食糜中微生物的DNA。用NanoDrop 2000超微量紫外分光光度計測定DNA樣本的濃度，同時利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA樣本的純度。以上述提取好的基因組DNA為模板進行PCR擴增，并對其產(chǎn)物進行純化、定量和均一化形成測序文庫。將混合好的文庫稀釋定量后用Illumina-MiSeq測序儀進行測定，對序列信息進行操作分類單元(operational taxonomic unit，OTU)、多樣性及差異性分析。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件中one-way ANOVA方法進行分析，若組間差異顯著，則用Duncan氏多重比較法進行檢驗。結(jié)果以平均值和均值標準誤(SEM)表示，P<0.05為差異顯著，0.05

2 結(jié)果與分析

2.1 飼糧中添加酵母多肽對肉雞生長性能的影響

由表2可見，各組之間肉雞生長性能無顯著差異(P>0.05)。與空白對照組相比，酵母多肽組肉雞14、24、37日齡體重分別提高了1.01%、2.20%和1.20%，1～14日齡、15～24日齡、1～37日齡平均日增重分別提高了1.25%、2.17%和1.27%。

表2 飼糧中添加酵母多肽對肉雞生長性能的影響

續(xù)表2項目Items日齡Days of age空白對照組Blank control group抗生素組Antibiotic group酵母多肽組Yeast polypeptides groupSEMP值P-value平均日增重ADG/(g/d)1～1432.132.032.50.20 0.63 15～2482.884.684.60.85 0.62 25～37103.2106.7102.81.63 0.60 1～3770.672.571.50.60 0.47 料重比F/G1～141.1471.1441.1470.010.82 15～241.3291.3171.3290.01 0.65 25～371.6851.6501.7220.02 0.24 1～371.4821.4601.4900.01 0.21 成活率Survival rate/%1～14100.099.5100.00.18 0.39 15～24100.099.598.90.300.34 25～3798.9100.099.40.310.36 1～3798.998.998.30.48 0.87

2.2 飼糧中添加酵母多肽對肉雞胴體組成和免疫器官指數(shù)的影響

由表3可見，各組之間肉雞胴體組成和免疫器官指數(shù)無顯著差異(P>0.05)。

2.3 飼糧中添加酵母多肽對肉雞回腸微生物的影響

2.3.1 對肉雞回腸微生物區(qū)系的影響

如圖1所示，本試驗中，3組所獨有的OTU分別為496、1 240和329個，其中3組共有OTU為229個。如圖2所示，Specaccum物種累積曲線已到達平臺期，說明測序深度足夠。

2.3.2 對肉雞回腸微生物α多樣性的影響

如圖3所示，各組之間回腸微生物Chao1、Observed_species、Shannon、Pielou_e和Simpson指數(shù)均無顯著差異(P>0.05)。

表3 飼糧中添加酵母多肽對肉雞胴體組成和免疫器官指數(shù)的影響

A：空白對照組 blank control group；B：抗生素組 antibiotic group；I：酵母多肽組 yeast polypeptides group。下圖同 the same as below.

圖2 Specaccum物種累積曲線

圖3 飼糧中添加酵母多肽對肉雞回腸微生物α多樣性的影響

2.3.3 對肉雞回腸微生物β多樣性的影響

非量度多維尺度(nonmetric multidimensional scaling，NMDS)分析與主坐標分析(principal coordinates analysis，PCoA)結(jié)果如圖4所示，不同組的肉雞菌群結(jié)構(gòu)出現(xiàn)了一定差異。NMDS結(jié)果的應(yīng)力值(stress)越小越好，一般認為當該值小于0.2時，NMDS分析的結(jié)果較可靠。本試驗中，NMDS分析的應(yīng)力值為0.165，表明NMDS分析結(jié)果可信，抗生素組與其他2組之間生物群落的差異略大。

如圖5所示，PCA圖中，每個點代表一個樣本，不同顏色的點代表不同樣本，2點在坐標軸上的投影距離越近，表明這2個樣本之間的物種豐度組成在相應(yīng)維度中越相似，本試驗中，抗生素組與其他2組之間的相似度最低。

圖4 微生物NMDS分析圖

2.3.4 對肉雞回腸門和屬水平微生物相對豐度的影響

由表4可見，在門水平上，肉雞回腸微生物中相對豐度最高的4個門類分別為厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門和放線菌門。與空白對照組相比，抗生素組肉雞回腸厚壁菌門相對豐度有降低的趨勢(P=0.06)，變形菌門相對豐度有升高的趨勢(P=0.09)。酵母多肽組肉雞回腸厚壁菌門相對豐度最高(99.55%)，變形菌門相對豐度最低(0.35%)。各組之間肉雞回腸擬桿菌門和放線菌門相對豐度無顯著差異(P>0.05)。

圖5 微生物PCoA圖

由表5可見，與空白對照組相比，抗生素組肉雞回腸乳桿菌屬相對豐度顯著降低(P<0.05)，酵母多肽組肉雞回腸乳桿菌屬相對豐度有所提高(P>0.05)。與抗生素組相比，酵母多肽組肉雞回腸腸桿菌屬相對豐度有降低的趨勢(P=0.06)，肉雞回腸葡萄球菌屬相對豐度顯著降低(P<0.05)。各組之間肉雞回腸Candidatusarthromitus、不動桿菌屬和腸球菌屬并無顯著差異(P>0.05)。

3 討 論

3.1 飼糧中添加酵母多肽對肉雞生長性能的影響

生物活性肽作為蛋白質(zhì)類物質(zhì)，可以直接為動物機體提供生長發(fā)育所需的氨基酸，同時由于其吸收轉(zhuǎn)化速率快、抗原性小，營養(yǎng)價值尚在游離氨基酸和完整蛋白質(zhì)之上，作為添加劑使用，有助于促進動物生長。研究表明，飼糧中添加大豆活性肽[3-6]、棉籽生物活性肽[7]均能夠改善肉雞飼料轉(zhuǎn)化率。飼糧中添加抗菌多肽能夠顯著提高肉雞平均日增重、平均日采食量和飼料轉(zhuǎn)化率，改善肉雞生長性能[8～11]。劉斌等[12]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加生物活性肽顯著提高了肉雞平均日增重，顯著降低了料重比。丁修良等[13]研究表明，飼糧中添加300 mg/kg抗菌肽顯著提高了肉雞平均日增重，顯著降低了料重比；而飼糧中添加150 mg/kg抗菌肽未顯著改善肉雞平均日增重和料重比。本研究結(jié)果顯示，飼糧中添加酵母多肽一定程度上提高了肉仔雞的平均日增重和平均日采食量，但差異不顯著，對肉雞料重比無顯著影響，與前人的研究結(jié)果存在一些差異，這種差異可能是由多肽的種類、添加劑量、肉雞品種、養(yǎng)殖模式差異等因素造成的。

表4 飼糧中添加酵母多肽對肉雞回腸門水平微生物相對豐度的影響

表5 飼糧中添加酵母多肽對肉雞回腸屬水平微生物相對豐度的影響

3.2 飼糧中添加酵母多肽對肉雞胴體組成和免疫器官指數(shù)的影響

屠宰性能是反映肉用畜禽產(chǎn)肉性能的重要指標，包括全凈膛率、半凈膛率、胸肌率、腿肌率等。湯偉桐等[14]、黃冠慶等[15]研究表明，飼糧中添加功能性小肽物質(zhì)能有效改善肉仔雞的屠宰率、胸肌率、腿肌率，原因可能是功能肽在一定程度上有助于調(diào)節(jié)營養(yǎng)物質(zhì)在肌肉內(nèi)的沉積。本研究結(jié)果顯示，飼糧中添加酵母多肽對肉雞胸肌率、腿肌率、腺胃率和肌胃率無顯著影響。但宋士剛等[16]、穆洋[17]的研究結(jié)果顯示，飼糧中添加不同的抗菌肽產(chǎn)品均能顯著提高肉仔雞屠宰率、半凈膛率、腹脂率、胸肌率，可能是因為生物活性肽的組成不同，對動物機體肌肉沉積的效果不同。本試驗研究還發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加酵母多肽對肉雞脾臟和法氏囊指數(shù)無顯著影響，這可能是酵母多肽的刺激不足以影響免疫器官相對重量的改變。

3.3 飼糧中添加酵母多肽對肉雞腸道微生物的影響

腸道是營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的主要場所，腸道菌群由大量的微生物組成，是一個自我穩(wěn)定的平衡區(qū)系。腸道內(nèi)有害菌的增殖會破壞腸道微生態(tài)平衡，產(chǎn)生大量毒性物質(zhì)，影響動物的營養(yǎng)消化、代謝、免疫和健康，造成動物生長性能的下降。厚壁菌門多數(shù)為革蘭氏陽性，具有細胞壁的結(jié)構(gòu)。本試驗結(jié)果表明，酵母多肽組肉雞回腸厚壁菌門相對豐度最高，與崔宇擎等[18]研究結(jié)果一致。變形菌門成員為革蘭氏陰性菌，其中包括很多病原菌，如大腸桿菌、沙門氏菌、霍亂弧菌、幽門螺桿菌等。腸桿菌屬細菌是腸道的正常菌群，其中臨床分離率較高的有產(chǎn)氣腸桿菌、坂崎腸桿菌等。葡萄球菌屬多數(shù)為非致病菌，少數(shù)可導(dǎo)致疾病，葡萄球菌是最常見的化膿性球菌。Xie等[19]研究表明，飼糧中添加抗菌多肽可以提高肉雞回腸微生物豐富度和多樣性，且能提高變形菌門相對豐度，降低擬桿菌門相對豐度。于曦[20]研究發(fā)現(xiàn)，給沙門氏菌感染肉雞飼喂含抗菌多肽飼糧后，會提高感染雛雞屬水平的物種多樣性，同時能夠抑制沙門菌感染后毛螺菌科、瘤胃球菌屬、糞芽孢菌屬、腸桿菌科等細菌的變化趨勢，維持腸道內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。Choi等[21]、姚遠等[22]研究表明，飼糧中添加60 mg/kg抗菌多肽能有效降低肉雞腸道內(nèi)有害微生物數(shù)量。王帥[23]研究表明，酵母多肽聯(lián)合益生菌飼喂大鼠，能夠顯著增加腸道中羅斯氏菌屬和多氏擬桿菌屬相對豐度，減少黏液性細菌的相對含量。Wang等[24]研究表明，飼糧中添加畢赤酵母發(fā)酵產(chǎn)物提純的活性多肽能降低肉雞回腸大腸桿菌和腸球菌相對豐度。丁修良等[13]研究表明，發(fā)酵產(chǎn)物抗菌肽Sublancin能夠顯著減少肉雞盲腸中大腸桿菌數(shù)量。同樣，本研究所用酵母多肽為提純后單一抗菌多肽，能夠降低腸道變形菌門、腸桿菌屬和葡萄球菌屬相對豐度，提高厚壁菌門和乳桿菌屬相對豐度，進一步證實了抗菌多肽能優(yōu)化動物腸道菌群結(jié)構(gòu)，維持腸道健康。其作用機制可能與抗菌多肽本身有一定的殺滅病原菌作用有關(guān)，抗菌肽可通過在細菌細胞膜表面形成通道，選擇性地破壞細胞膜，而達到抑菌殺菌的效果[25]。另外，抗菌多肽能提高有益菌如乳桿菌的豐富度，一方面這些有益菌在能量代謝中起著至關(guān)重要的作用和免疫功能，從而維持機體的健康[26]；另一方面有益菌有助于清除多藥耐藥腸桿菌科細菌如大腸桿菌、沙門氏菌及金黃色葡萄球菌的定植[27]，從而抑制有害菌的增殖，進一步優(yōu)化腸道菌群結(jié)構(gòu)。

4 結(jié) 論

① 飼糧中添加酵母多肽對肉雞生長性能、胴體組成和免疫器官指數(shù)的影響不顯著。

② 飼糧中添加酵母多肽能降低肉雞回腸變形菌門、腸桿菌屬和葡萄球菌屬相對豐度，提高回腸厚壁菌門和乳桿菌屬相對豐度，改善腸道微生物菌群組成。