王四新 季海峰 劉 輝 張董燕 王 晶 陳美霞 王雅民

(北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100097)

近幾年，我國生豬出欄體重有增加的趨勢，以前是90 kg左右出欄，現(xiàn)在是120 kg左右出欄。學(xué)者們對體重90 kg以內(nèi)的豬研究較多，而對育肥后期(體重90～120 kg)的豬研究較少。益生菌是一種能夠改善動物腸道功能、提高動物生產(chǎn)性能及健康水平的飼料添加劑。趙秀英等[1]研究顯示，給7日齡仔豬灌喂植物乳桿菌和干酪乳桿菌提高了腸道菌群多樣性，促進(jìn)了乳酸桿菌、雙歧桿菌等有益菌的增殖以及腸道短鏈脂肪酸(SCFAs)的生成。Lan等[2]在斷奶仔豬(體重7～30 kg)飼糧中添加復(fù)合芽孢桿菌和丁酸梭菌，顯著提高了仔豬的平均日增重及飼糧中干物質(zhì)、氮和總能的全消化道表觀消化率，降低了糞便中的大腸桿菌數(shù)量。劉輝等[3]在生長豬(體重23～46 kg)飼糧中添加乳酸片球菌，提高了腸道菌群多樣性，改善了消化道菌群結(jié)構(gòu)，提高了生長性能和飼料利用率，對豬群產(chǎn)生了有益作用。陳寶劍等[4]分析了不同發(fā)育階段豬的腸道菌群情況，發(fā)現(xiàn)斷奶后隨著日齡的不斷增加，腸道菌群結(jié)構(gòu)趨于穩(wěn)定。Wang等[5]的研究發(fā)現(xiàn)，育肥豬的腸道菌群多樣性與母豬相似。有關(guān)益生菌的研究在仔豬、保育豬和生長豬上較多，而在育肥豬上尤其是育肥后期的研究較少，缺乏相關(guān)數(shù)據(jù)。為此，本項目組根據(jù)生豬產(chǎn)業(yè)發(fā)展需求，擬探討益生菌對體重90～120 kg階段育肥豬生長性能、養(yǎng)分表觀消化率、糞便菌群及短鏈脂肪酸含量的影響，旨在為育肥豬育肥后期的科學(xué)飼養(yǎng)提供科技支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗所用益生菌制劑主要成分為干酪乳桿菌(有效活菌數(shù)2×1010CFU/g)和釀酒酵母(有效活菌數(shù)2×109CFU/g)，由北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所動物營養(yǎng)研究室制備。

1.2 試驗動物、試驗飼糧及飼養(yǎng)管理

選用“長×大”二元雜交育肥豬100頭，平均體重為(92.01±0.91) kg，隨機(jī)分成2組，分別為對照組和益生菌組，每組5個重復(fù)，每個重復(fù)10頭。對照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，益生菌組飼喂在基礎(chǔ)飼糧中添加益生菌制劑的試驗飼糧，每千克試驗飼糧中干酪乳桿菌有效活菌數(shù)為2.0×109CFU、釀酒酵母有效活菌數(shù)為2.0×108CFU?；A(chǔ)飼糧參照NRC(2012)配制，其組成及營養(yǎng)水平見表1。試驗豬飼養(yǎng)在同一豬舍內(nèi)，自由采食，自由飲水，舍內(nèi)溫度22～28 ℃，相對濕度60%～80%，豬群飼養(yǎng)管理按場內(nèi)統(tǒng)一技術(shù)規(guī)程進(jìn)行，試驗期31 d。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

續(xù)表1項目 Items含量 Content蘇氨酸 Thr0.53色氨酸 Try0.16

1.3 生長性能測定

在試驗開始和結(jié)束時對試驗豬進(jìn)行空腹稱重，分別記錄為初始體重和終末體重；在試驗期內(nèi)，記錄每天的耗料量；根據(jù)記錄的數(shù)據(jù)計算平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)和料重比(F/G)。

1.4 養(yǎng)分表觀消化率測定

參照楊鳳[6]的內(nèi)源指示劑法開展消化試驗。試驗第28～30天采集飼糧樣品，連續(xù)采集3 d，以重復(fù)為單位混勻，粉碎、制樣；試驗第29～31天采集新鮮糞樣，每天上午和下午各采集1次，采集的糞樣混勻，用10%的鹽酸溶液固氮，低溫冰箱保存，連續(xù)采集3 d，然后將3 d采集的糞樣以重復(fù)為單位混勻，65 ℃烘干、粉碎、制樣。測定飼糧和糞樣中粗蛋白質(zhì)、鈣、總磷和鹽酸不溶灰分含量，計算養(yǎng)分表觀消化率:

某養(yǎng)分表觀消化率(%)=100×[1-
(A/B)×(C/D)]。

式中：A為糞中該養(yǎng)分含量；B為飼糧中該養(yǎng)分含量；C為飼糧中鹽酸不溶灰分含量；D為糞中鹽酸不溶灰分含量。

1.5 糞便樣品采集及測定

1.5.1 糞便采集

試驗結(jié)束當(dāng)天早晨采集新鮮糞樣，每個重復(fù)隨機(jī)采集2份，裝于無菌離心管中，并置于干冰中帶回實驗室后-80 ℃保存，用于糞便菌群分析和短鏈脂肪酸含量測定。試驗共采集糞便樣品20份。

1.5.2 糞便菌群分析

總DNA提取、PCR產(chǎn)物純化參照王四新[7]的方法進(jìn)行。純化后的PCR產(chǎn)物樣品送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行環(huán)境微生物測序，比對數(shù)據(jù)庫為細(xì)菌16S rRNA數(shù)據(jù)庫。菌群分析在美吉I-Sanger云平臺上完成。

1.5.3 糞便中短鏈脂肪酸含量與組成分析

使用安捷倫氣相色譜儀GC-6890對短鏈脂肪酸含量與組成進(jìn)行分析，具體參照王四新[7]的方法進(jìn)行。

1.6 數(shù)據(jù)處理

育肥豬育肥后期生長性能、養(yǎng)分表觀消化率、短鏈脂肪酸含量結(jié)果用平均值和均值標(biāo)準(zhǔn)誤(SEM)表示，數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2016初步處理后，采用SPSS 19.0軟件中的獨立樣本t檢驗方法進(jìn)行分析，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 育肥豬育肥后期的生長性能和養(yǎng)分表觀消化率

由表2可知，與對照組相比，益生菌組育肥豬的平均日增重提高了9.42%(P<0.05)，料重比降低了6.90%(P>0.05)。

表2 益生菌對育肥豬育肥后期生長性能的影響

由表3可知，與對照組相比，添加益生菌制劑后，育肥豬的鈣和總磷表觀消化率顯著提高(P<0.05)，粗蛋白質(zhì)表觀消化率也有所提高，但提高程度不顯著(P>0.05)。

表3 益生菌對育肥豬育肥后期養(yǎng)分表觀消化率的影響(干物質(zhì)基礎(chǔ))

2.2 育肥豬育肥后期的糞便菌群Alpha多樣性和組成

2.2.1 糞便菌群Alpha多樣性

由表4可知，益生菌組育肥豬糞便菌群的Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)、ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)以及覆蓋度與對照組相比均無顯著差異(P>0.05)。

2.2.2 糞便菌群組成

由圖1、圖2可知，在門分類水平上，對照組和益生菌組育肥豬糞便中共有菌門有16個，沒有獨有菌門；2組均以厚壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌門(Bacteroidota)為優(yōu)勢菌門，其次是螺旋體門(Spirochaetota)。在屬分類水平上，對照組和益生菌組育肥豬糞便中分別有241和247個菌屬，2組共有菌屬為232個，獨有菌屬分別為9和15個，但相對豐度較低；相對豐度大于1%的菌屬分別有15和16個，相對豐度總和分別為82.02%和80.04%；2組相對豐度較高的菌屬有狹義梭菌屬1(Clostridium_sensu_stricto_1)、鏈球菌屬(Streptocossus)、Terrisporobacter、密螺旋體屬(Treponema)和乳桿菌屬(Lactobacillus)。

表4 育肥豬育肥后期糞便菌群Alpha多樣性

與對照組相比，在門和屬分類水平上，益生菌組育肥豬糞便中高豐度菌群如厚壁菌門的相對豐度降低(83.35% vs. 81.47%)，擬桿菌門的相對豐度增加(10.37% vs. 12.19%)，但均未達(dá)到顯著水平(P>0.05)；而低豐度菌群普氏菌屬(Prevotella，1.237% vs. 2.057%)、Alloprevotella(0.329% vs. 0.656%)、考拉桿菌屬(Phascolarctobacterium，0.293% vs. 0.705%)、糞球菌屬(Coprococcus，0.194% vs. 0.258%)、脫硫弧菌屬(Desulfovibrio，0.056% vs. 0.129%)、糞桿菌屬(Faecalibacterium，0.040% vs. 0.191%)、丁酸球菌屬(Butyricicoccus，0.021% vs. 0.121%)和琥珀酸弧菌屬(Succinivibrio，0.007% vs. 0.013%)等的相對豐度顯著增加(P<0.05，圖3)，未標(biāo)記顫螺菌科(norank_f_Oscillospiraceae，0.289% vs. 0.168%)、惰性真桿菌群(Eubacterium_siraeum_group，0.153% vs. 0.079%)、Anaeroplasma(0.019% vs. 0.007%)和短優(yōu)桿菌群(Eubacterium_brachy_group，0.013% vs. 0.005%)等的相對豐度顯著降低(P<0.05，圖3)。

C為對照組，P為益生菌組。下圖同。

2.3 育肥豬育肥后期糞便中短鏈脂肪酸含量與組成

由表5可知，與對照組相比，益生菌組育肥豬糞便中除甲酸含量有所降低外，總短鏈脂肪酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、異丁酸和異戊酸含量均提高，其中總短鏈脂肪酸、丙酸和戊酸含量與對照組的差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)。

對照組育肥豬糞便中甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、異丁酸和異戊酸占短鏈脂肪酸總量的摩爾百分比分別為0.6%、64.8%、21.3%、8.9%、1.1%、1.9%、1.5%，益生菌組則分別為0.5%、60.7%、22.7%、11.0%、1.5%、2.1%、1.8%。由圖4可知，與對照組相比，益生菌組糞便短鏈脂肪酸中乙酸比例顯著降低(P<0.05)，丙酸和丁酸比例有所升高(P>0.05)，戊酸比例顯著升高(P<0.05)。

3 討 論

3.1 益生菌對育肥豬育肥后期生長性能和養(yǎng)分表觀消化率的影響

益生菌影響飼糧中營養(yǎng)成分的利用率及飼料轉(zhuǎn)化率，調(diào)控動物的生長。據(jù)報道，乳酸菌可在動物腸道內(nèi)定植，形成腸道屏障，分泌細(xì)菌素和有機(jī)酸等活性代謝產(chǎn)物，抑制病原菌的生長，減少腸道疾病發(fā)生，促進(jìn)腸道健康，提高動物生長性能[9-10]。有研究表明，干酪乳桿菌對酸、膽鹽有較好的耐受性，產(chǎn)酸和抑制有害菌能力強(qiáng)，能夠顯著增加仔豬小腸絨毛高度及絨毛高度與隱窩深度的比值，顯著提高腸道蛋白酶活性和仔豬日增重，顯著降低仔豬的腹瀉率和死亡率，能有效維護(hù)仔豬腸道健康，促進(jìn)腸道發(fā)育[11-13]。王四新等[14-15]在體重7～18 kg和62～94 kg的北京黑豬飼糧中添加干酪乳桿菌，改善了腸道菌群結(jié)構(gòu)，顯著提高了豬的ADG，降低了F/G。釀酒酵母本身含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素和微量元素，其通過發(fā)酵飼料可以產(chǎn)生β-葡聚糖、甘露聚糖、酶等多種營養(yǎng)物質(zhì)，可為動物補(bǔ)充營養(yǎng)，改善動物胃腸道的生態(tài)環(huán)境，提高飼料轉(zhuǎn)化率[16-17]。Jiang等[18]在早期斷奶仔豬飼糧中添加釀酒酵母，促進(jìn)了仔豬小腸發(fā)育，提高了飼料轉(zhuǎn)化率和健康水平。Rai等[19]給2.5～3月齡的斷奶仔豬飼喂添加釀酒酵母的飼糧提高了雜交豬的ADG。Garcia等[20]在飼糧中添加釀酒酵母RC016促進(jìn)了斷奶仔豬的生長，改善了腸道免疫系統(tǒng)。本研究在育肥豬育肥后期(90～120 kg階段)飼喂含益生菌(干酪乳桿菌和釀酒酵母)的試驗飼糧，取得與上述研究基本一致的結(jié)果，說明益生菌對育肥豬育肥后期的生長性能仍有改善作用。

Firmicutes:厚壁菌門；Bacteroidota:擬桿菌門；Spirochaetota:螺旋體門；Others:其他；Clostridium_sensu_stricto_1:狹義梭菌屬1；Streptococcus:鏈球菌屬；Treponema:密螺旋體屬；Lactobacillus:乳桿菌屬；unclassified_f_Lachnospiraceae:未分類毛螺旋菌科；Prevotella：普氏菌屬；Christensenellaceae_R-7_group:克里斯滕森菌科R-7群；Rikenellaceae_RC9_gut_group：理研菌科RC9腸道群；NK4A214_group：NK4A214群；Lachnospiraceae_XPB1014_group：毛螺菌科XPB1014群；Prevotellaceae_UCG-003：普雷沃氏菌科UCG-003；Prevotellaceae_UCG-001：普雷沃氏菌科UCG-001；Prevotellaceae_NK3B31_group：普雷沃氏菌科NK3B31群。

“*”表示組間差異顯著(P<0.05)。下圖同。

表5 育肥豬育肥后期糞便中短鏈脂肪酸含量

圖4 糞便中短鏈脂肪酸組成

養(yǎng)分表觀消化率是評定飼糧營養(yǎng)價值的重要指標(biāo)。提高營養(yǎng)物質(zhì)消化率，可以減少養(yǎng)分排泄，對于綠色養(yǎng)殖有重要意義。通常情況下，飼糧中45%～60%的氮、50%～80%的鈣與磷會排出體外[21]。研究發(fā)現(xiàn)，益生菌進(jìn)入腸道發(fā)酵產(chǎn)生乳酸、消化酶等物質(zhì)，促進(jìn)腸道營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收[22]。侯改鳳[23]給體重65～92 kg階段的“杜×長×大”育肥豬飼喂德氏乳桿菌，生長性能得到改善，試驗前期和中期粗蛋白質(zhì)、粗脂肪和能量表觀消化率顯著提高。楊東吉等[24]研究了釀酒酵母培養(yǎng)物對體重8～25 kg階段斷奶仔豬養(yǎng)分表觀消化率的影響，發(fā)現(xiàn)釀酒酵母培養(yǎng)物顯著提高了斷奶仔豬的粗蛋白質(zhì)、粗脂肪和磷的表觀消化率。張紫微等[25]研究了復(fù)合益生菌制劑(含枯草芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和酵母菌等)對210日齡、體重84～104 kg階段的杜陸二元雜交育肥豬的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)試驗組的磷表觀消化率顯著高于對照組，粗蛋白質(zhì)和鈣表觀消化率略高于對照組，但未達(dá)到顯著水平。本試驗結(jié)果顯示，在飼糧中添加含有干酪乳桿菌和釀酒酵母的益生菌制劑后，提高了體重92～121 kg階段的“長×大”二元雜交育肥豬的粗蛋白質(zhì)表觀消化率，顯著提高了鈣和總磷表觀消化率，與上述報道結(jié)果類似。而程皇座等[26]在體重74～108 kg階段的“長×大”雜交育肥豬基礎(chǔ)飼糧中添加含乳酸菌、枯草芽孢桿菌和酵母菌的益生菌制劑后發(fā)現(xiàn)，其對生長性能和養(yǎng)分表觀消化率的作用效果不明顯。本試驗結(jié)果與程皇座等[26]的研究結(jié)果存在差異，其可能是飼用益生菌的菌種或菌種組合不同、飼糧組成或營養(yǎng)水平不同以及養(yǎng)殖環(huán)境不同等造成的，具體原因還需要進(jìn)一步精準(zhǔn)研究與分析。

3.2 益生菌對育肥豬育肥后期糞便菌群Alpha多樣性和組成的影響

腸道菌群數(shù)量龐大、復(fù)雜多樣，對宿主腸道結(jié)構(gòu)功能、營養(yǎng)物質(zhì)代謝、機(jī)體免疫調(diào)節(jié)等具有重要影響。Zhao等[27]研究了1、2、3和6月齡長白豬糞便菌群及6月齡長白豬腸道菌群情況，發(fā)現(xiàn)糞便中菌群與大腸中菌群有顯著的相似性，平均相似度為0.75，能夠間接反映腸道菌群狀況。本研究分析了育肥豬育肥后期糞便菌群的豐富度和多樣性，發(fā)現(xiàn)益生菌組與對照組育肥豬糞便菌群的Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)、ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)等Alpha多樣性指數(shù)均差異不顯著。而劉輝等[3]在體重23～46 kg階段生長豬飼糧中添加乳酸片球菌，顯著增加了生長豬糞便菌群的Shannon指數(shù)、ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)，提高了生長豬腸道菌群的物種豐富度和多樣性。本研究結(jié)果與劉輝等[3]的研究結(jié)果有所不同，這可能是因為育肥豬育肥后期的腸道菌群比體重23～46 kg階段生長豬更加穩(wěn)定，說明隨著豬日齡增大，體重增加，益生菌對腸道菌群多樣性的影響變小。

在菌群組成方面，對照組和益生菌組育肥豬糞便中均以厚壁菌門和擬桿菌門為優(yōu)勢菌門，狹義梭菌屬1、鏈球菌屬、Terrisporobacter、密螺旋體屬和乳桿菌屬等為優(yōu)勢菌屬。從門和屬分類水平上比較，發(fā)現(xiàn)益生菌降低了育肥豬糞便中厚壁菌門的相對豐度，提高了擬桿菌門的相對豐度，與張陽等[28]的研究結(jié)果基本一致。而在低豐度菌群中，益生菌組普氏菌屬、Alloprevotella、考拉桿菌屬、糞球菌屬、脫硫弧菌屬、糞桿菌屬、丁酸球菌屬和琥珀酸弧菌屬的相對豐度較對照組顯著增加，未標(biāo)記顫螺菌科、惰性真桿菌群、Anaeroplasma和短優(yōu)桿菌群的相對豐度較對照組顯著降低。普氏菌屬可降解纖維素，與糞便中短鏈脂肪酸含量的增加相關(guān)[29]。糞球菌屬、糞桿菌屬和丁酸球菌屬等是丁酸鹽產(chǎn)生菌[30]，對動物健康有益[31]。這些變化表明益生菌能夠促進(jìn)育肥豬育肥后期腸道中產(chǎn)短鏈脂肪酸菌群的增殖，有利于腸道內(nèi)環(huán)境的改善，也表明益生菌對育肥豬生長性能和養(yǎng)分表觀消化率的影響可能與腸道菌群變化有關(guān)。

3.3 益生菌對育肥豬育肥后期糞便中短鏈脂肪酸含量與組成的影響

益生菌通過爭奪營養(yǎng)、產(chǎn)生代謝產(chǎn)物和時空占位效應(yīng)等調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)和穩(wěn)態(tài)，促進(jìn)動物腸道健康[8]。短鏈脂肪酸是腸道菌群發(fā)酵未消化的食物成分產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，包括甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、異丁酸和異戊酸等，在調(diào)節(jié)宿主能量代謝、免疫和腸道健康等方面發(fā)揮著重要作用。丁酸是腸上皮細(xì)胞重要的能量來源；丙酸被肝臟吸收，參與糖異生并抑制膽固醇合成；乙酸是膽固醇合成的主要底物，大部分被吸收入血液而進(jìn)入肝臟代謝，作為周邊組織的能源[32]。張陽等[28]在體重33～116 kg階段生長育肥豬飼糧中添加復(fù)合益生菌(枯草芽孢桿菌、嗜乳酸桿菌和屎腸球菌)后發(fā)現(xiàn)，糞便中乙酸和丙酸含量極顯著降低，丁酸含量顯著降低，其分析糞便中菌群結(jié)構(gòu)時發(fā)現(xiàn)梭菌屬、乳桿菌屬等短鏈脂肪酸產(chǎn)生菌的相對豐度降低。本試驗結(jié)果顯示，育肥豬育肥后期糞便中短鏈脂肪酸以乙酸為主，其次是丙酸和丁酸，飼喂含益生菌(干酪乳桿菌和釀酒酵母)制劑的飼糧后，除甲酸含量降低外，其他短鏈脂肪酸含量均得到提高。這與菌群分析結(jié)果一致，說明腸道中產(chǎn)短鏈脂肪酸菌群的增殖是短鏈脂肪酸含量增加的主要因素。Schwiertz等[33]和Rahat-Rozenbloom等[34]比較了胖人和瘦人結(jié)腸及糞便中短鏈脂肪酸含量，發(fā)現(xiàn)胖人結(jié)腸和糞便中短鏈脂肪酸含量高于瘦人，過多的短鏈脂肪酸增加了結(jié)腸的能量供應(yīng)，會導(dǎo)致體重增加。

4 結(jié) 論

在育肥豬育肥后期(體重90～120 kg階段)飼糧中添加含有干酪乳桿菌和釀酒酵母的益生菌制劑，可提高平均日增重和鈣、磷表觀消化率，影響糞便中部分低豐度菌群的相對豐度，增加糞便中普氏菌屬、糞球菌屬、糞桿菌屬和丁酸球菌屬等產(chǎn)短鏈脂肪酸菌群的相對豐度以及丙酸、戊酸和總短鏈脂肪酸的含量。