劉佳奇,李 麗,楊紅紅,孫 敏,馮漢青，2

(1. 西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，甘肅蘭州 730070；2. 西北師范大學(xué)新農(nóng)村發(fā)展研究院，甘肅蘭州 730070)

據(jù)聯(lián)合國糧食安全署報(bào)告，世界上鹽漬化的土地面積約8.31×10hm，而我國鹽漬化土地有約3.6×10hm，主要分布在西北、東北和華北的干旱、半干旱地區(qū)。小麥?zhǔn)鞘澜绶秶鷥?nèi)廣泛種植的糧食作物之一，在我國常年種植面積和產(chǎn)量約占我國糧食總面積和總產(chǎn)量的25%和22%左右，小麥產(chǎn)量與我國糧食安全息息相關(guān)。相關(guān)研究表明，土壤中的鹽能夠影響種子萌發(fā)，引起植物體生理功能紊亂，導(dǎo)致植物幼苗生長減緩；損害葉綠體結(jié)構(gòu)，使葉綠素含量和氣孔導(dǎo)度降低，造成植物光合效率和蒸騰作用下降，最終造成小麥減產(chǎn)。因此，尋找增強(qiáng)小麥的耐鹽性方法，對其增產(chǎn)、增收具有重要意義。

褪黑素(melatonin，MT)是一種在動(dòng)植物中廣泛存在的小分子物質(zhì)，為色氨酸吲哚類衍生物，具有很強(qiáng)的抗氧化作用，能促進(jìn)植物側(cè)根的生長，延緩葉片衰老。褪黑素可通過增強(qiáng)抗氧化作用等途徑增強(qiáng)植物對干旱、鹽害、重金屬、高溫、冷害等多種逆境的抗性。研究表明，外源褪黑素能夠調(diào)節(jié)番茄的種子萌發(fā)和生長發(fā)育；緩解干旱脅迫對番茄幼苗光合性能的抑制，加強(qiáng)光合運(yùn)轉(zhuǎn)效率；顯著緩解硝基苯酚脅迫對水稻幼苗生長、葉片PS Ⅱ光化學(xué)效率等產(chǎn)生的影響，提高水稻幼苗對硝基苯酚脅迫的適應(yīng)性。有關(guān)外源褪黑素對小麥耐鹽脅迫的效應(yīng)鮮見報(bào)道。

本試驗(yàn)擬分析鹽脅迫對小麥種子萌發(fā)系數(shù)、幼根干重、鮮重、根長和幼根細(xì)胞死亡水平等指標(biāo)的影響，探究在鹽脅迫下施用不同濃度褪黑素對小麥種子萌發(fā)和幼苗生理特性的效應(yīng)，為鹽堿地小麥的栽培提供借鑒和參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為春小麥綿雜麥168。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

培養(yǎng)液設(shè)置7個(gè)處理，分別為蒸餾水(CK)，100 mmol·LNaCl溶液(T)，T+5 μmol·L褪黑素溶液(T5)，T+50 μmol·L褪黑素溶液(T50)，T+100 μmol·L褪黑素溶液(T100)，T+150 μmol·L褪黑素溶液(T150)，T+250 μmol·L褪黑素溶液(T250)。選取大小均勻、顆粒飽滿的小麥種子，用0.1%的次氯酸鈉消毒10 min，蒸餾水沖洗3～4次；在培養(yǎng)皿底部鋪墊用以上處理液充分浸濕的雙層濾紙，每皿均勻擺放已消毒的100粒小麥種子，每個(gè)處理重復(fù)4次；于恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行種子萌發(fā)和幼苗試驗(yàn)，溫度為25 ℃，光照周期為 16 h光照/8 h黑暗，相對濕度70%。每日補(bǔ)充相應(yīng)處理溶液以保持培養(yǎng)皿中濾紙的濕度。

1.3 測定項(xiàng)目與方法

1.3.1 種子萌發(fā)指標(biāo)測定

培養(yǎng)2 d后開始統(tǒng)計(jì)小麥的發(fā)芽種子數(shù)(以胚根為種子長度的二倍左右為發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn))，每天統(tǒng)計(jì)一次，到第6 d為止。計(jì)算發(fā)芽率、發(fā)芽勢和相對耐鹽指數(shù)。

發(fā)芽勢=(日發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù))×100%；

發(fā)芽率=(6 d發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù))×100%；

相對耐鹽指數(shù)=(處理組發(fā)芽率/對照組發(fā)芽率)×100%。

1.3.2 幼苗生長指標(biāo)測定

取培養(yǎng)4 d的小麥6株，用蒸餾水沖洗3～4次幼根；用吸水紙將表面水分吸干；測量小麥幼根和胚芽鞘長度；將幼苗分為根和地上部并分別稱鮮重；將其放入70 ℃的烘箱中24 h，烘干并稱重。重復(fù)4次。

1.3.3 葉綠素?zé)晒鈪?shù)和葉綠素含量的測定

將培養(yǎng)7 d的小麥幼苗取出。參照Flexas等和Hazrati等的方法，使用葉綠素?zé)晒獬上駜x(ImagePAM)測定小麥幼苗的葉綠素?zé)晒鈪?shù)。具體測定步驟如下：連接儀器，儀器正常運(yùn)行后測得暗適應(yīng)狀態(tài)的初始熒光()和最大熒光()，當(dāng)所測材料在作用光下的實(shí)時(shí)熒光(Fs)達(dá)到穩(wěn)態(tài)(20 s)后打開飽和脈沖光，測得最大熒光(')，再打開遠(yuǎn)紅外光，測最小熒光(')。測量結(jié)束后導(dǎo)出參數(shù)(光化學(xué)淬滅系數(shù))、ETR(PS Ⅱ光合電子傳遞速率)、NPQ和(非光化學(xué)淬滅系數(shù))，并計(jì)算/(PS Ⅱ最大光化學(xué)量子產(chǎn)量)。

取培養(yǎng)7 d的小麥葉片，剪碎，放入研缽中，加入3 mL 80%( V/V) 的丙酮，研成勻漿，倒入5 mL離心管中，離心后，于 663 nm 和 645 nm 下測定吸光值，計(jì)算葉綠素含量。

1.3.4 根細(xì)胞死亡水平測定

根據(jù)Hung等的方法進(jìn)行。將培養(yǎng)4 d的小麥幼根用蒸餾水清洗3～4次，室溫下浸泡于0.25%的伊文思藍(lán)染液中15 min；用蒸餾水反復(fù)清洗表面的伊文思藍(lán)染液至去除表面染料；將幼根切碎，放入5 mL 50%的甲醇和1%十二烷基磺酸鈉(SDS)的混合提取液中，50 ℃水浴1 h；檢測提取液在595 nm處的吸光值，以此來代表細(xì)胞死亡程度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2019和SPSS 25.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和作圖；采用ANOVA和Duncan法進(jìn)行方差分析和差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 褪黑素對鹽脅迫小麥萌發(fā)指標(biāo)的影響

由圖1可見，鹽脅迫(T)下，小麥種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率和發(fā)芽期相對耐鹽指數(shù)均較CK顯著降低。施用褪黑素可在不同程度上提高鹽脅迫下小麥種子萌發(fā)指標(biāo)，T100處理的發(fā)芽勢、發(fā)芽率和發(fā)芽期相對耐鹽指數(shù)較T處理顯著提高，分別提高了35.8%、7.8%、7.8%；表明添加100 μmol·L褪黑素能夠有效緩解鹽脅迫對小麥種子萌發(fā)的抑制作用。

圖柱上不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。

2.2 褪黑素對鹽脅迫小麥幼苗生長指標(biāo)的影響

由圖2可知，在100 mmol·LNaCl脅迫(T)下，小麥幼苗的生長受到了明顯的抑制，與CK相比，小麥的根長、胚芽鞘長、根的鮮重和干重均顯著降低。

與T處理相比，T5、T50、T100、T150處理的小麥根長顯著增加，分別增加了37.5%、33.8%、54.2%、61.7%，T250與T處理無顯著差異(圖2A)；T5、T50、T100、T150處理的胚芽鞘長顯著增加，分別增加了22.4%、25.7%、36.5%、 42.8%、21.7%(圖2B)。褪黑素濃度為150 μmol·L時(shí)對鹽脅迫引起的小麥根長和胚芽鞘抑制作用的緩解效果最佳。

與T處理組相比，T5、T50、T100、T150、T250處理根鮮重分別增加了41.1%、40.7%、77.4%、69.7%、19.3%(圖2C)；根干重分別增加了40.9%、47.3%、54.3%、60.2%、32.6%(圖2D)，差異均顯著。褪黑素濃度為100～150 μmol·L對鹽脅迫引起的小麥根鮮重和干重抑制作用的緩解程度最明顯。

從圖2E可以看出，與T處理相比，T5、T50、T100、T150、T250處理地上部干重分別增加了46.7%、47.3%、55.8%、48.9%、44.8%，差異均顯著。褪黑素濃度為100 μmol·L對鹽脅迫導(dǎo)致的小麥地上部干重抑制的緩解作用最顯著。

圖2 褪黑素對小麥幼苗生長的影響

2.3 褪黑素對鹽脅迫下葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

由圖3A、3B可以看出，相較于CK，100 mmol·LNaCl處理下小麥幼苗葉片和ETR顯著降低，分別減小了52.3%和35.4%。相較于T處理，T5、T50、T100、T150、T250處理的值分別增加29.1%、30.5%、47.4%、 48.1%和43.8%，ETR值分別增加13.3%、 22.7%、27.7%、28.9%和21.2%。結(jié)果表明，褪黑素能顯著緩解鹽脅迫下小麥幼苗葉片和ETR的下降，濃度為100～250 μmol·L時(shí)效果最好。

光化學(xué)淬滅系數(shù)和非光化學(xué)淬滅系數(shù)存在此消彼長的相互競爭關(guān)系。由圖3C、3D可以看出，在NaCl處理下，伴隨著小麥幼苗葉片的降低，NPQ和顯著升高。相較于T處理，加入5、50、100、150、250 μmol·L褪黑素均使NPQ和顯著降低。由圖3E可以看出，相較于CK，T處理下，小麥幼苗葉片/顯著降低，相較于T處理，加入不同濃度褪黑素后均使得小麥幼苗葉片的/顯著升高。

圖3 褪黑素對小麥幼苗葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

2.4 褪黑素對鹽脅迫下葉片葉綠素含量的影響

由圖4可知，相較于CK，T處理下小麥幼苗葉片的葉綠素含量顯著下降(16.5%)。T150處理葉綠素含量較T處理提高了10.7%，表明添加150 μmol·L褪黑素可顯著促進(jìn)鹽脅迫下葉綠素的合成，其他濃度對葉綠素合成的促進(jìn)作用不顯著。

圖4 褪黑素對小麥幼苗葉片葉綠素含量的影響

2.5 鹽脅迫下褪黑素對小麥幼根細(xì)胞死亡的 影響

如圖5所示，與CK相比，T處理下小麥幼根細(xì)胞死亡水平顯著升高(36.2%)。與T處理相比，T100、T150和T250處理后根細(xì)胞死亡水平顯著降低，分別降低9.2%、7.0%和11.4%，T5和T50處理相較T處理無顯著差異。結(jié)果表明，外源褪黑素在100～250 μmol·L時(shí)能夠有效緩解鹽脅迫對小麥幼根細(xì)胞的損傷。

圖5 褪黑素對小麥幼根細(xì)胞死亡的影響

3 討 論

種子萌發(fā)是植物能夠生長的首要條件。本研究結(jié)果表明，100 mmol·LNaCl處理對小麥種子的萌發(fā)具有明顯的抑制作用，而適宜濃度的褪黑素對鹽脅迫下小麥種子的萌發(fā)具有一定緩解作用。這與張 娜等發(fā)現(xiàn)的在鹽脅迫下施加褪黑素能夠顯著提高狼尾草種子的發(fā)芽勢和發(fā)芽率的報(bào)道的結(jié)果一致。褪黑素的這種作用可能與褪黑素能夠解除鹽脅迫對種子萌發(fā)過程中的關(guān)鍵酶和滲透性物質(zhì)的抑制作用有關(guān)，但具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

生物量是植物在逆境環(huán)境下生長發(fā)育的關(guān)鍵指標(biāo)。施加褪黑素能夠使小麥苗期生物量相關(guān)指標(biāo)得以升高。這與在燕麥以及在扁穗雀麥中的研究結(jié)果一致。植物生長過程中的物質(zhì)積累主要是通過光合作用以及根系對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。鹽脅迫通過影響光合及根系細(xì)胞活力而抑制植物的生長。因此，研究褪黑素對鹽脅迫下植物光合和細(xì)胞活力的效應(yīng)有重要 意義。

PS Ⅱ是逆境脅迫下光合機(jī)構(gòu)受到損傷的原初位點(diǎn)之一，其光化學(xué)水平的變化代表著逆境中植物光合作用的變化。而葉綠素?zé)晒鈪?shù)作為反映PS Ⅱ光化學(xué)活性的靈敏探針，能夠準(zhǔn)確的反應(yīng)逆境對PS Ⅱ的影響。本研究發(fā)現(xiàn)，100 mmol·LNaCl處理下，小麥葉片、ETR和/顯著下降，和NPQ顯著升高，表明在鹽脅迫下小麥葉片光合電子傳遞受阻，對光能的吸收和運(yùn)行效率降低，光合色素將光能轉(zhuǎn)化為化學(xué)能的能力降低，以非輻射形式損耗的能量增加；而加入褪黑素能夠顯著緩解、ETR和/的下降、和NPQ的升高，這表明褪黑素能夠維持鹽脅迫下PS Ⅱ的光化學(xué)活性，促進(jìn)PS Ⅱ?qū)⒐饽苻D(zhuǎn)變成化學(xué)能，進(jìn)而有效的緩解鹽脅迫對PS Ⅱ的抑制作用，提高小麥的耐鹽性。這與王芳等發(fā)現(xiàn)外源褪黑素能夠改善鹽脅迫下玉米幼苗的光合作用相一致。

在一定程度上葉綠素含量直接反應(yīng)光合作用的強(qiáng)弱。大量研究表明，NaCl脅迫對植物生長和生理特性產(chǎn)生負(fù)面影響，導(dǎo)致淺綠色癥狀，幼苗生長發(fā)育遲緩，損傷葉綠體的超微結(jié)構(gòu)，葉綠素含量降低，而且鹽脅迫后葉綠體會(huì)產(chǎn)生大量的ROS，使葉綠體蛋白合成受阻，從而影響葉綠體的發(fā)育和光合作用。本研究發(fā)現(xiàn)，褪黑素濃度150 μmol·L時(shí)顯著緩解了NaCl處理下葉綠素含量的降低。推測這是由于褪黑素促進(jìn)葉片光合作用所致，葉綠素?zé)晒鈪?shù)的改變可能與葉綠素含量變化密切相關(guān)。100 mmol·LNaCl能夠顯著地?fù)p傷小麥幼根細(xì)胞，而褪黑素濃度達(dá)到100 μmol·L以上時(shí)能夠顯著緩解鹽脅迫對小麥幼根細(xì)胞的損傷，提示了褪黑素能夠保護(hù)小麥的幼根細(xì)胞。Liang等研究也表明，褪黑素能夠有效減輕細(xì)胞損傷，從而延緩水稻葉片損傷，提高水稻的耐鹽性。

在小麥幼苗生長過程中，根系是最先接觸到鹽脅迫的器官，鹽脅迫導(dǎo)致小麥幼根細(xì)胞死亡水平上升，影響小麥幼苗對水分和物質(zhì)的吸收和運(yùn)輸能力。隨著過多的鹽離子進(jìn)入到小麥葉片中，光化學(xué)反應(yīng)也受到抑制，進(jìn)而減少在植物進(jìn)行光合作用的能力，導(dǎo)致小麥的生長和物質(zhì)積累受到了抑制。研究表明，褪黑素具有延阻細(xì)胞死亡、調(diào)節(jié)離子平衡、調(diào)控多種抗鹽相關(guān)基因表達(dá)的功能。推測褪黑素可能通過多種方式降低了鹽脅迫對于小麥生長、葉綠素合成、光合和細(xì)胞活力的不利影響，提高了小麥對于鹽脅迫的抗性。

綜上，100 mmol·LNaCl脅迫會(huì)顯著抑制小麥種子萌發(fā)和幼苗生長，降低小麥葉片葉綠素含量和光合效率，損傷幼根細(xì)胞；適宜濃度的褪黑素處理可有效緩解鹽脅迫對小麥生長抑制和細(xì)胞損傷程度，以100～150 μmol·L褪黑素的緩解效果最為明顯。因此，施加外源褪黑素有望成為緩解鹽脅迫對小麥不利影響的有效方法，但其具體作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。