常珍惜,杜曉華,賈文慶,朱小佩,穆金艷,劉會(huì)超

（河南科技學(xué)院園藝園林學(xué)院,河南 新鄉(xiāng) 453003）

三色堇（Viola ×wittrockiana）是堇菜科堇菜屬的一、二年生草本花卉,其品種繁多、色彩鮮艷、花期較長(zhǎng),素有“花壇皇后”的美譽(yù)[1],自20 世紀(jì)八十年代以來(lái),逐漸成為我國(guó)城鄉(xiāng)重要的花壇和盆栽花卉之一.在我國(guó)長(zhǎng)江流域,三色堇主要應(yīng)用于秋、冬、春三季,而在我國(guó)北方,由于冬季氣溫較低,三色堇一般需要設(shè)施保護(hù),春季才能應(yīng)用于室外[2].研究三色堇資源的耐寒性,發(fā)掘耐寒三色堇種質(zhì)資源,培育耐寒三色堇品種,對(duì)于解決三色堇在我國(guó)北方冬季越冬,豐富我國(guó)寒冷季節(jié)可應(yīng)用的室外花卉具有重要意義.

前人研究表明,低溫會(huì)給植物造成一定的脅迫和傷害,這些傷害體現(xiàn)在多個(gè)方面,其中細(xì)胞膜的傷害可用丙二醛含量變化、細(xì)胞相對(duì)電導(dǎo)率等來(lái)表征,其也可作為植物抗寒性鑒定的依據(jù)[3].植物在受到低溫脅迫時(shí),機(jī)體內(nèi)可啟動(dòng)一系列生理生化反應(yīng)來(lái)降低低溫造成的傷害[4],包括滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的變化以及抗氧化系統(tǒng)的變化.植物體內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì),主要是有機(jī)小分子,如可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸等[5].楊克彬等[6]研究發(fā)現(xiàn),7 個(gè)切花紅掌在6 ℃低溫下,隨著低溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng),各品種的相對(duì)電導(dǎo)率、丙二醛及滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量逐漸上升,抗氧化酶呈現(xiàn)先升后降的結(jié)果.劉冰等[7]比較了3 種杜鵑花材料在杭州自然低溫后,測(cè)定部分生理指標(biāo),結(jié)果表明:杜鵑花的抗寒性與蔗糖、可溶性蛋白、脯氨酸及丙二醛含量密切相關(guān);許瑛等[8]在秋冬季自然環(huán)境下,通過(guò)測(cè)定8 個(gè)菊花品種的抗寒性,試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)8 種菊花的半致死溫度隨馴化溫度降低而降低,并驗(yàn)證生長(zhǎng)恢復(fù)試驗(yàn)同半致死溫度結(jié)果一致,結(jié)果表明半致死溫度可以作為評(píng)價(jià)菊花抗寒性的重要指標(biāo)之一.

有關(guān)三色堇耐寒性研究,羅玉蘭研究了低溫下1 個(gè)本地三色堇品種與1 個(gè)荷蘭三色堇品種的相對(duì)電導(dǎo)率及膜損傷率等指標(biāo)的變化,發(fā)現(xiàn)本地三色堇抗寒性低于荷蘭三色堇品種[9];齊陽(yáng)陽(yáng)等[10]通過(guò)對(duì)三色堇進(jìn)行-5 ℃低溫脅迫發(fā)現(xiàn),其可溶性糖、脯氨酸含量呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì).但上述研究?jī)H從生理層面進(jìn)行研究,缺乏植株直觀表現(xiàn).本研究以9 種三色堇優(yōu)良自交系為材料,研究低溫脅迫下三色堇滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)及膜系統(tǒng)指標(biāo)的變化,結(jié)合田間耐寒性調(diào)查,探討三色堇在低溫下的生理響應(yīng)以及與耐寒性的關(guān)系,為三色堇抗寒材料的篩選及耐寒新品種的選育提供理論參考.

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為河南科技學(xué)院三色堇課題組多年選育的9 份三色堇自交系,材料基本情況詳見(jiàn)表1.

表1 供試的9 份三色堇自交系材料Tab.1 The nine inbred lines of pansies in this study

試驗(yàn)用苗為2020 年10 月上旬播種,幼苗長(zhǎng)到7~8 片真葉時(shí),將其分為兩部分.一部分幼苗移栽至大田進(jìn)行田間抗寒性試驗(yàn),每品種栽植50 株,株行距30 cm×30 cm,田間溫度測(cè)定采用溫濕度記錄儀;另一部分幼苗（每品種10 株）在人工氣候箱內(nèi)20 ℃下恒溫培養(yǎng)24 h 后,進(jìn)行人工模擬低溫處理,溫度每1 h降低1 ℃,待溫度降至0 ℃時(shí),培養(yǎng)24 h,光照強(qiáng)度10 000 lx,晝夜光照時(shí)間12 h/12 h,每株取1~2 片葉測(cè)定生理生化指標(biāo).

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 三色堇田間抗寒性調(diào)查與冷害指數(shù)測(cè)定 依據(jù)新鄉(xiāng)市氣象局預(yù)報(bào)結(jié)合田間電子溫度計(jì)測(cè)定,2020年12 月25 日至26 日,為試驗(yàn)區(qū)冬季最低氣溫（-2 ℃~ -8 ℃）.低溫脅迫24 h 后,對(duì)三色堇進(jìn)行冷害調(diào)查.

三色堇田間冷害癥狀調(diào)查分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合劉旭梅等[11]、李剛等[12]以及齊陽(yáng)陽(yáng)等[13]在杜鵑、常綠樹(shù)種幼苗、大花三色堇等低溫脅迫后,研究文獻(xiàn)制定冷害分級(jí).

冷害分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)具體如下:

一級(jí):植株正常無(wú)凍害;

二級(jí):葉片呈現(xiàn)皺縮,有失綠;

三級(jí):葉片皺縮小于50%,綠色較多;

四級(jí):葉片皺縮大于50%,綠色較少;

五級(jí):葉片皺縮,有壞死斑塊,整體萎蔫;

六級(jí):植株干枯.

冷害指數(shù)計(jì)算公式（1）

式（1）中：S 為每一冷害級(jí)的苗數(shù),每材料調(diào)查30 株.

1.2.2 生理生化指標(biāo)測(cè)定 采用Yayin1661 葉綠素?zé)晒鈨x測(cè)定各材料葉綠素?zé)晒鈪?shù)[14],采用電導(dǎo)法測(cè)定相對(duì)電導(dǎo)率[15],采用茚三酮比色法測(cè)定游離脯氨酸含量[14-15],采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定可溶性蛋白含量[15],采用苯酚比色法測(cè)定可溶性糖含量[15],采用硫代巴比妥酸法測(cè)定丙二醛含量[15],所有指標(biāo)的測(cè)定均重復(fù)3 次.

1.2.3 抗寒性綜合評(píng)價(jià) 參照龍海濤等[16],付晴晴等[17]的方法,用隸屬函數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差系數(shù)權(quán)重法進(jìn)行9 個(gè)三色堇自交系抗寒性的綜合評(píng)價(jià).具體計(jì)算公式如下

根據(jù)單一性狀耐寒系數(shù),使用SPSS 軟件分析得出各綜合指標(biāo)主成分測(cè)定值CI（Xj）;

隸屬函數(shù)分析

式（3）中:U（Xj）表示j 指標(biāo)抗寒隸屬函數(shù)值,Xj表示j 指標(biāo)的測(cè)定值,Xmin表示9 種三色堇中j 指標(biāo)最小值,Xmax表示9 種三色堇中j 指標(biāo)最大值.

權(quán)重

式（4）中:Wj值表示第j 個(gè)綜合指標(biāo)在所有綜合指標(biāo)中的重要程度,Pj為各綜合指標(biāo)的貢獻(xiàn)率.

綜合評(píng)價(jià)

式（5）中:D 值為9 份三色堇材料在低溫脅迫條件下,各生理指標(biāo)所得的抗寒性綜合評(píng)價(jià)值.

1.2.4 數(shù)據(jù)分析方法 采用Excel 2003 軟件整理數(shù)據(jù),并計(jì)算三色堇各指標(biāo)隸屬函數(shù)值和綜合評(píng)價(jià)值等,利用DPS 7.5 和SPSS 25.0 軟件數(shù)據(jù)處理系統(tǒng),對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和方差分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 自然低溫下9 份三色堇材料的冷害指數(shù)

供試的9 份三色堇材料冷害調(diào)查表見(jiàn)表2.

表2 供試的9 份三色堇材料冷害調(diào)查表Tab.2 Cold damage of 9 inbred lines of pansies 株

由表2 可以看出,9 份三色堇材料中EWO-1 一級(jí)和二級(jí)植株達(dá)20 株,所占比例最高,顯示該材料耐寒性最強(qiáng);其次是EYO-3 一級(jí)和二級(jí)植株為11 株;達(dá)到四級(jí)和五級(jí)標(biāo)準(zhǔn)最多的是DSRFY-1-2、DPLS-2-1、XXL-YB-1-1-1-2,分別為14 株、10 株及8 株.

供試的9 份三色堇材料進(jìn)行大田耐寒性分析如圖1 所示.

圖1 三色堇材料冷害指數(shù)測(cè)定Fig.1 Chilling injury index of each material after lowtemperature stress

如圖1 可知,低溫對(duì)9 種三色堇材料造成不同程度的傷害,其冷害指數(shù)在0.39~0.55 之間.9 份材料中,EWO-1 的冷害指數(shù)值最低,為0.39,其次為EYO-3,為0.42,冷害指數(shù)值最高的為DSRFY-1-2 材料,達(dá)到0.55.反映出EWO-1 的耐寒性最強(qiáng),其次是EYO-3,最不耐寒材料為DSRFY-1-2.

2.2 低溫脅迫下9 份三色堇自交系生理生化指標(biāo)的變化

低溫脅迫下對(duì)三色堇生理生化指標(biāo)的影響如圖2 所示.

圖2 低溫脅迫三色堇生理生化指標(biāo)的影響Fig.2 Effects of lowtemperature on some physiological and biochemical indexes of pansies

由圖2-a 可知, 同對(duì)照相比,0 ℃處理后各材料可溶性糖含量增加, 除EWO-1 和JB-1-1-5 兩個(gè)材料,另外7 種材料與對(duì)照相比,存在顯著性差異（P＜0.05,下同）,其中增加最多材料為DSRAB-1-4B,增長(zhǎng)了74.76%.由圖2-b 可知, 低溫脅迫導(dǎo)致不同三色堇材料可溶性蛋白含量出現(xiàn)一定程度上升或下降趨勢(shì).除DPLS-2-1 外,低溫處理使其他8 份三色堇材料可溶性蛋白含量與對(duì)照相比呈現(xiàn)出顯著性差異.其中E01-1、EYO-3、PXP-BT-D-1-1-1-B 的可溶性蛋白含量上升,上升最大為EYO-3 材料,比對(duì)照上升了4.28 mg/g;另外5 個(gè)三色堇材料中可溶性蛋白下降,下降最大為DSRFY-1-2,比對(duì)照下降了6.43 mg/g.由圖2-c 可知,低溫脅迫后,9 份三色堇材料游離脯氨酸含量與對(duì)照相比均有顯著性上升,其中上升最高材料為JB-1-1-5,比對(duì)照增長(zhǎng)了346.27%,E01-1、EWO-1、EYO-3,分別增長(zhǎng)129.57%、124.6%、116.89%,增長(zhǎng)最少為DPLS-2-1 材料,增長(zhǎng)了35%.由圖2-d 可知,低溫脅迫后,9 份三色堇材料中,6 份材料丙二醛含量上升,3 種下降,差異顯著.上升最高為XXL-YB-1-1-1-2 材料,上升了0.96 μmol/g,比對(duì)照增加了126.32%,其次為PXP-BT-D-1-1-1-B 和E01-1 材料,分別提高了38.96%、24.18%.下降幅度最大材料為JB-1-1-5 和DPLS-2-1,分別下降了22.86%、20.91%.由圖2-e 可以看出,低溫脅迫后,除DPLS-2-1、DSRAB-1-2 外,其他7 份材料的葉綠素?zé)晒猓‵v/Fm）均表現(xiàn)出顯著性下降,下降幅度最大為XXL-YB-1-1-1-2 材料,下降了14.46%,下降最少為DPLS-2-1 和DSRAB-1-2 材料,均下降了1.19%.由圖2-f 可知,在低溫脅迫后,除EWO-1 和EYO-3 材料外,其他7 份三色堇材料同對(duì)照相比相對(duì)電導(dǎo)率均有顯著性上升或下降.其中DSRFY-1-2、DSRAB-1-4B、DPLS-2-1、E01-1 材料下降,分別下降了53.57%,36.36%、25%、18.52%;EWO-1、EYO-3、JB-1-1-5、PXP-BT-D-1-1-1-B、XXL-YB-1-1-1-25 上升,XXL-YB-1-1-1-2 上升最高,達(dá)到50%.

2.3 9 份三色堇自交系材料的耐寒性綜合評(píng)價(jià)

2.3.1 主成分分析6 個(gè)單項(xiàng)指標(biāo)的主成分分析結(jié)果見(jiàn)表3.

表3 低溫脅迫下2 個(gè)綜合指標(biāo)特征量及貢獻(xiàn)率Tab.3 Characteristics and contribution rate of three comprehensive indexes of pansies under lowtemperature stress

由表3 可知,6 個(gè)單項(xiàng)指標(biāo)貢獻(xiàn)率分別為:71.385%（Pj1）、21.544%（Pj2）、4.530%（Pj3）、2.150%（Pj4）、0.382%（Pj5）、0.009%（Pj6）.其中2 個(gè)主要綜合指標(biāo)（CI1、CI2）的貢獻(xiàn)率分別為71.385%、21.544%,累積貢獻(xiàn)率為92.929%,可以代表原始6 個(gè)單一評(píng)價(jià)指標(biāo),可依據(jù)這2 個(gè)綜合指標(biāo)進(jìn)行9 種三色堇材料的耐寒性評(píng)價(jià).

2.3.2 抗寒性綜合評(píng)價(jià) 9 種三色堇材料主成分綜合指標(biāo)、U（xj）、D 值及耐寒性排序見(jiàn)表4.

表4 9 種三色堇材料主成分綜合指標(biāo)、U（xj）、D 值及耐寒性排序Tab.4 Comprehensive index,U（xj）,D value and cold resistance of 9 inbred lines of pansies

由表4 可知,利用兩個(gè)主成分綜合指標(biāo)值得出隸屬函數(shù)綜合評(píng)價(jià)值（D 值）,D 值愈大其耐寒能力愈強(qiáng),故9 種三色堇材料在0 ℃脅迫下的耐寒性依次為:XXL-YB-1-1-1-2>PXP-BT-D-1-1-1-B>EWO-1>EYO-3>JB-1-1-5>E01-1>DSRAB-1-4B>DPLS-2-1>DSRFY-1-2.

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)研究表明,低溫脅迫下,9 份三色堇材料的部分生理生化指標(biāo)產(chǎn)生上升/下降的結(jié)果.抗寒性綜合評(píng)價(jià)表明,9 份材料抗寒能力由強(qiáng)到弱依次為:XXL-YB-1-1-1-2>PXP-BT-D-1-1-1-B>EWO-1>EYO-3>JB-1-1-5>E01-1>DSRAB-1-4B>DPLS-2-1>DSRFY-1-2;大田冷害調(diào)查結(jié)果9 份材料抗寒能力由強(qiáng)到弱依次為:EWO-1>EYO-3>PXP-BT-D-1-1-1-B>XXL-YB-1-1-1-2>DPLS-2-1=DSRAB-1-4B=E01-1>JB-1-1-5>DSRFY-1-2.綜合上述兩種評(píng)價(jià)方法,9 份材料中,較為耐寒材料:PXP-BT-D-1-1-1-B、EWO-1、EYO-3,不耐寒材料:JB-1-1-5 和DSRFY-1-2.

低溫處理?xiàng)l件下因植物種類不同,在低溫脅迫后,滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)變化規(guī)律有所差異.齊陽(yáng)陽(yáng)等[10]以三色堇離體葉片為試材,隨著低溫脅迫時(shí)間的增加,三色堇葉片的脯氨酸、可溶性糖含量呈現(xiàn)先升后降趨勢(shì).張雨等[18]通過(guò)對(duì)低溫脅迫下板凳果生理指標(biāo)的研究,發(fā)現(xiàn)板凳果體內(nèi)MDA、可溶性蛋白和相對(duì)電導(dǎo)率呈上升結(jié)果.何偉等[19]探索葡萄半致死低溫時(shí)發(fā)現(xiàn),葡萄隨著低溫時(shí)間的增加,可溶性糖、可溶性蛋白均先升后降,而游離脯氨酸含量呈現(xiàn)緩升緩降、MDA 呈現(xiàn)平緩上升結(jié)果.本試驗(yàn)中,低溫脅迫下9 份三色堇材料的可溶性糖含量整體提高,且DSRAB-1-4B、XXL-YB-1-1-1-2、EYO-3、E01-1、DSRFY-1-2 等5種材料顯著提高;可溶性蛋白含量4 份材料下降,5 份材料上升;游離脯氨酸含量3 份材料下降,6 份材料上升,上升的6 份材料其耐寒性也較高,與前人研究報(bào)道結(jié)果相近,這進(jìn)一步說(shuō)明低溫脅迫下,三色堇抗寒生理表現(xiàn)過(guò)程中,可溶性糖起到了更加關(guān)鍵作用,脯氨酸和可溶性蛋白也起到了一定作用.

植物體內(nèi)細(xì)胞膜起著維持其正常代謝的重要作用,當(dāng)植物受到脅迫后,細(xì)胞膜受損,透性增大,使得電解質(zhì)外滲,引起植物細(xì)胞浸提液電導(dǎo)率增大[15].本試驗(yàn)中,與對(duì)照相比,0℃處理后,9 份材料相對(duì)電導(dǎo)率值出現(xiàn)增大或減小的變化,電導(dǎo)率明顯上升的自交系XXL-YB-1-1-1-2、JB-1-1-5、EWO-1、EYO-3、PXP-BT-D-1-1-1-B 等材料,其抗寒性綜合值也較高,反之,電導(dǎo)率明顯降低的材料,其抗寒性綜合值也較低.MDA 是反映細(xì)胞膜破壞程度的另一指標(biāo),用來(lái)表現(xiàn)植物的損傷程度[20],當(dāng)植物體細(xì)胞膜受到的損傷越大,其體內(nèi)MDA 的含量就會(huì)越多[21],本試驗(yàn)結(jié)果表明,低溫脅迫后,DPLS-2-1、DSRFY-1-2、JB-1-1-5 3 種材料的MDA 值上升,表明這3 份三色堇材料細(xì)胞膜損傷較大,抗寒性低于另外6 份三色堇材料.

光合作用是維持植物正常生長(zhǎng)發(fā)育的重要因素之一,且對(duì)溫度的變化較為敏感,溫度的上升或下降會(huì)影響光合效果[22],葉綠素?zé)晒鈪?shù)是測(cè)定葉片在光合作用過(guò)程中自身對(duì)光能吸收、傳遞、耗散等光合能力的一種方法[23-25].本試驗(yàn)在低溫脅迫后得出9 種三色堇材料光合能力在0℃條件下均有下降,表示低溫一定程度抑制了光合作用,但分析表明,葉綠素?zé)晒庀禂?shù)與抗寒性貢獻(xiàn)率較小,可以不作為抗寒性指標(biāo).

劉國(guó)宇等[26]通過(guò)對(duì)3 種熱帶觀賞植物抗寒性研究發(fā)現(xiàn),可溶性糖含量、游離脯氨酸含量與植物抗寒性呈正相關(guān),結(jié)合本次試驗(yàn)結(jié)果分析發(fā)現(xiàn),印證了上述劉國(guó)宇等人試驗(yàn)結(jié)果,可溶性糖和游離脯氨酸含量低溫后呈現(xiàn)升高,是植物應(yīng)對(duì)低溫的防御反應(yīng),可能與抗寒性是正相關(guān)的,丙二醛含量以及葉綠素?zé)晒庵笖?shù)多數(shù)材料下降,可能與抗寒性成負(fù)相關(guān).