張希太,肖磊,董策,路其祥

（邯鄲市農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)研究室,河北 邯鄲 056001）

基因突變育種是小麥遺傳改良、種質(zhì)資源創(chuàng)新與新品種培育的重要途徑,是對常規(guī)雜交育種技術(shù)的重要補充和不可缺少的育種手段.化學誘變技術(shù)具有成本低廉、使用方便、誘變作用專一等特點[1],化學誘變劑及誘變方法的選擇對化學誘變的成功與否至關(guān)重要.近半個世紀以來,各國學者曾試用許多化學物質(zhì)來篩選有效低毒的化學誘變劑[1].博萊霉素（Zeocin）是世界衛(wèi)生組織確定的用于治療部分癌癥腫瘤的抗生素,其治療原理與我國的平陽霉素基本相同,都是通過干擾阻止腫瘤細胞的DNA 復(fù)制來達到抑制腫瘤生長目的.平陽霉素是中國醫(yī)學科學院抗菌素研究所與華北制藥廠從浙江省平陽縣采集的土壤中分離培養(yǎng)出的一種輪支鏈霉菌變種（Str.Verticillusvar Pinyanagensis n.var）產(chǎn)生的由10 余種成分復(fù)合而成的抗生素,經(jīng)藥物分析研究,平陽霉素中因含有博萊霉素的A2、A5、B2成分而在臨床上具有治療癌癥腫瘤的效果[2-3].

在平陽霉素的應(yīng)用過程中,我國科技工作者又發(fā)現(xiàn)了它對微生物、哺乳類動物、植物的染色體都有強烈的誘變作用,并逐漸應(yīng)用于部分植物的誘變育種[4-6].樸鐵夫等[7]1998 年開始平陽霉素誘變小麥的研究.前人用平陽霉素誘變小麥的方法主要有以下幾種:種子處理法,1994 年和1998 年樸鐵夫等在20 ℃下,先將“吉麥2 號”小麥種子用自來水浸泡12 h 后,再在質(zhì)量濃度分別為10 μg/mL、30μg/mL、50μg/mL 劑量的平陽霉素溶液中浸泡12 h,然后水洗2 h,晾干后進行播種[8-9],研究了平陽霉素質(zhì)量濃度對M1 代根長、根數(shù)、苗高、出苗率、根尖細胞染色體畸形率及M2 代突變率的影響并和EMS 誘變作比較.花粉管通道法,1997 年孫德全等[10]、2011 年張希太等[11]在小麥揚花期利用花粉管通道將平陽霉素溶液滲透到“龍輻麥3 號”“豫麥66”的胚囊誘變合子或幼胚.孫德全試驗表明,平陽霉素有較強的誘變效應(yīng),不同質(zhì)量濃度處理對小麥的誘變效果不同,75μg/mL 時變異率較大并獲得了一些優(yōu)異突變株.張希太試驗表明,平陽霉素能夠使小麥在株高、蠟質(zhì)層、芒型、穗型、葉綠素含量、生育期等方面產(chǎn)生變異,在0~50μg/mL 質(zhì)量濃度范圍內(nèi),隨著平陽霉素質(zhì)量濃度的提高對小麥的誘變效應(yīng)增強,選出了2 個變異種質(zhì)系并對誘變母體材料和變異種質(zhì)系的基因組DNA 進行了SSR 分子標記檢測與分析,在變異種質(zhì)系基因組中檢出了豐富的變異位點.培養(yǎng)基添加法,1998 年顧德峰等[12]將平陽霉素添加入小麥幼胚離體培養(yǎng)的培養(yǎng)基中,研究了平陽霉素對小麥幼胚愈傷組織發(fā)生及其植株再生的影響.結(jié)果表明:在20℃下,采用不同質(zhì)量濃度的平陽霉素處理幼胚長度為1.0～1.5 mm 的幼嫩麥粒8 h,然后用蒸餾水洗凈,在超凈工作臺上用升汞滅菌后剝?nèi)?.0～1.5 mm 的幼胚接種到MS+2,4-D 2mg/L+NAA 0.5mg/L+CH 200mg/L 固體培養(yǎng)基上,形成愈傷組織,愈傷組織在MS+KT 0.2 mg/mL 的培養(yǎng)基上分化出幼苗,10～40μg/mL 的平陽霉素可作為對小麥幼胚外植體離體培養(yǎng)時的適宜誘變濃度.穗莖注射法,1999 年孫德全等[13]研究了在小麥開花期將不同質(zhì)量濃度的平陽霉素溶液通過穗莖注入小麥“龍輻麥3 號”體內(nèi)的誘變方法.結(jié)果表明:“龍輻麥3 號”在株高、穗長、小穗數(shù)、主穗粒數(shù)、千粒質(zhì)量等方面發(fā)生變異,M1代隨平陽霉素質(zhì)量濃度的提高生理損傷加大,100μg/mL的平陽霉素處理M2代變異率較大.葉脈注射法,2002 年張秋英等[14]在小麥孕穗初期對“晉麥2148”“福繁17”和“綿陽35”進行葉脈注射平陽霉素溶液的誘變研究.結(jié)果表明:在3 個品種的M2代均出現(xiàn)了明顯的矮稈、熟期、籽粒顏色等性狀變異;這些變異在不同遺傳背景的品種處理中出現(xiàn)的類型不同,頻率也有差異;經(jīng)M2代選擇后,在M3代絕大多數(shù)變異株系的穗長、穗粒數(shù)、千粒質(zhì)量等變異性狀已能穩(wěn)定遺傳,而有部分株系的株高和熟期兩個變異性狀仍在分離.分蘗節(jié)（生長點）注射法,2011 年張希太等[15]在小麥苗起身后拔節(jié)之前將0~50μg/mL 不同質(zhì)量濃度的鹽酸平陽霉素溶液通過葉鞘注射到小麥品種“蘭考矮早8”的生長點（分蘗節(jié)）部位,對平陽霉素的誘變效果進行了研究.其后代在株高、蠟質(zhì)層、芒型、穗型、葉綠素、生育期等幾個方面發(fā)生大量變異,通過對變異后代的系統(tǒng)選擇得到了pyms-6、pyms-2 兩個種質(zhì)系.通過對“蘭考矮早8”及兩個種質(zhì)系pyms-6、pyms-2 基因組DNA 的SSR 分子標記檢測,在變異種質(zhì)系基因組中檢出了豐富的突變位點.

平陽霉素用于誘變育種已多有報道,然而未見博萊霉素應(yīng)有于誘變育種的研究.本研究進行了“小麥種子在不同質(zhì)量濃度的博萊霉素溶液中萌發(fā)生長”的誘變方法,對“濟麥22”種子進行誘變處理,直至對照處理培養(yǎng)皿苗長成2 葉幼苗止.每天利用不同質(zhì)量濃度的博萊霉素溶液進行誘變研究,旨在探討博萊霉素對小麥是否有誘變效應(yīng)及合適的誘變劑量和誘變方法.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

誘變的母體材料為“濟麥22”種子,取自于邯鄲市農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)研究室的育種試驗材料圃;誘變用的博萊霉素試劑從賽默飛世爾科技（中國）有限公司購買.

1.2 誘變方法

1.2.1 誘變適期 為了使誘變后的培養(yǎng)皿苗盡快在試驗田中移栽,誘變時期一般選在秋季小麥大田播種前一個月（9 月份）進行.

1.2.2 博萊霉素的處理質(zhì)量濃度 用無菌自來水配制0 mg/mL、1 mg/mL、5 mg/mL、10 mg/mL、25 mg/mL、50 mg/mL、100 mg/mL 不同質(zhì)量濃度的博來霉素溶液.

1.2.3 誘變材料的準備 選取籽粒飽滿、完整、健康無病害的“濟麥22”種子,先用自來水沖洗去表面的灰塵,然后浸入1 mg/mL 質(zhì)量濃度的升汞（HgCl2）溶液滅菌8~10 min,用無菌水反復(fù)沖洗滅菌后的種子5~6次備用;將21 套培養(yǎng)皿用無離子水煮沸滅菌后備用,分別在培養(yǎng)皿中均勻放入滅菌后的“濟麥22”種子100 粒.

1.2.4 博萊霉素的處理方法 每天上午8:00 在培養(yǎng)皿中加入不同質(zhì)量濃度的博萊霉素溶液5 mL,至液面埋沒種子的一半為宜,每個博萊霉素質(zhì)量濃度處理重復(fù)3 次.從第二天起每天上午8:00 觀察培養(yǎng)皿中的博來霉素溶液量,如發(fā)現(xiàn)溶液量減少及時補足相應(yīng)質(zhì)量濃度的博來霉素溶液;種子萌發(fā)長成的幼苗頂培養(yǎng)皿蓋時,去掉該處理的培養(yǎng)皿蓋.為防止去掉蓋后培養(yǎng)皿中的水分過度蒸發(fā)造成博來霉素溶液質(zhì)量濃度出現(xiàn)偏差,將去蓋后的培養(yǎng)皿移入玻璃罩室內(nèi)培養(yǎng)或用相應(yīng)規(guī)格的燒杯罩住培養(yǎng),對于去掉蓋的處理每天除上午8:00 觀察是否需要補充相應(yīng)質(zhì)量濃度的博來霉素溶液外,其他時間應(yīng)多次觀察培養(yǎng)皿中的博來霉素溶液，若發(fā)現(xiàn)因蒸發(fā)導致溶液量減少及時用無菌水補足.

1.2.5 調(diào)查項目 調(diào)查各處理的始發(fā)芽時間、每天的發(fā)芽率、成苗率、苗情等指標,至0 mg/mL 質(zhì)量濃度處理的麥苗長成2 葉期時止.

1.3 大田種植與后代變異情況統(tǒng)計

1.3.1 M0代的移栽方法 各博萊霉素質(zhì)量濃度處理的培養(yǎng)皿苗為M0代（誘變零代）.誘變結(jié)束后,如果已到了冬小麥的播種季節(jié)（10 月10 日左右）,即可將M0代培養(yǎng)皿苗直接按處理移栽入試驗田中,移栽后及時澆水保證成活;如果還未到冬小麥的播種季節(jié),也可將M0代培養(yǎng)皿苗按博萊霉素質(zhì)量濃度處理先移栽入營養(yǎng)缽中,放在陰涼處保存,到冬小麥播種季節(jié)后再移栽入試驗田中.

1.3.2 M0代麥苗大田移栽成活率與生長情況調(diào)查 在M0代的整個生育期,除調(diào)查移栽成活率外還調(diào)查各博萊霉素質(zhì)量濃度處理植株的生長異常情況,包括M0代麥苗植株生長異常類型、異常株率等.

1.3.3 M0代的收獲與M1代的播種 第二年小麥成熟后,按不同的博萊霉素質(zhì)量濃度處理收獲并脫粒保存M0代種子;當年秋季冬小麥播種時,將各博萊霉素質(zhì)量濃度處理的M0種子單穴單粒播種形成M1代群體,每處理播種不少于3 000 株.并以同樣的方法播種對照種子.

1.3.4 M1代群體的變異情況統(tǒng)計 從M1代群體植株出苗到小麥成熟,整個生育期調(diào)查統(tǒng)計各博萊霉素質(zhì)量濃度處理出現(xiàn)的變異性狀類型、數(shù)量及變異率等.

2 結(jié)果與分析

2.1 各博萊霉素質(zhì)量濃度處理培養(yǎng)皿種子的發(fā)芽生長情況

各博萊霉素質(zhì)量濃度處理種子的發(fā)芽及生長情況見表1.

表1 各博萊霉素質(zhì)量濃度處理種子的發(fā)芽及生長情況Tab.1 Germination and growth of seeds treated with Bleomycin in each concentrations

由表1 可以看出,隨著博來霉素處理質(zhì)量濃度的提高,“濟麥22”種子的發(fā)芽時間推遲,發(fā)芽率降低.當博來霉素處理質(zhì)量濃度為100 mg/mL 時“濟麥22”種子不能萌發(fā),僅有部分種子的種胚膨大脹破種皮,隨后在種皮的破裂處形成類似愈傷組織的塊狀物.低質(zhì)量濃度的博來霉素溶液對“濟麥22”種子的發(fā)芽抑制作用較小,1 mg/mL 的博來霉素溶液僅使“濟麥22”種子的發(fā)芽速度略微減慢,最終發(fā)芽率仍為100%,質(zhì)量濃度為5 mg/mL、10 mg/mL 的博來霉素溶液使“濟麥22”種子的發(fā)芽速度進一步減慢,最終發(fā)芽率為97.67%、95.33%,對發(fā)芽率的影響較小.高質(zhì)量濃度的博來霉素溶液對萌發(fā)后的小麥幼苗的生長有較強的抑制作用, 10 mg/mL、25 mg/mL、50 mg/mL 的博來霉素溶液處理的“濟麥22”種子,在12 d 時同時達到了最大發(fā)芽率,但到15 d 時都未能長成二葉期幼苗,幼苗的平均株高僅為4.5 cm、3.1 cm、2.2 cm 都低于對照株高4.6 cm.較低質(zhì)量濃度的博來霉素溶液對萌發(fā)后的小麥幼苗的生長有促進作用,1 mg/mL、5 mg/mL 的博來霉素溶液處理的“濟麥22”種子雖然達到最高發(fā)芽率的時間較對照晚,但是15 d時的幼苗高度為5.3 cm、6.7 cm都高于對照,其中質(zhì)量濃度為5 mg/mL 的博來霉素溶液對種子萌發(fā)后的幼苗促進生長作用最強.

2.2 博來霉素誘變處理M0 代麥苗的大田移栽成活及生長情況

各博來霉素質(zhì)量濃度誘變處理M0代麥苗移栽成活率及生長異常株率見表2.

表2 各博來霉素溶液質(zhì)量濃度誘變處理M0 代麥苗移栽成活率及生長異常株率Tab.2 The survival rate and abnormal growth rate of M0 generation wheat seedlings treated by various Bleomycin concentrations

由表2 可以看出,高質(zhì)量濃度的博來霉素溶液誘變小麥種子,對M0代麥苗都有一定生理損傷,具體表現(xiàn)為:部分小麥植株生長畸形,葉片扭曲,抽穗畸形等;部分小麥植株生長停止,不能拔節(jié),不能抽穗,形成小老苗;部分小麥植株出現(xiàn)花葉;還有部分M0代苗出現(xiàn)白化、黃化而死亡.本試驗用質(zhì)量濃度為1 mg/mL、5 mg/mL 的博來霉素質(zhì)量溶液處理的M0代苗中未發(fā)現(xiàn)因生理損傷而造成的植株生長異常;用質(zhì)量濃度為10 mg/mL、25 mg/mL、50 mg/mL 的博來霉素溶液處理的M0代苗中都不同程度的出現(xiàn)了因生理損傷而造成的生長異常植株.隨著博來霉素溶液質(zhì)量濃度的提高M0代植株的生理損傷加重,生長異常植株率也提高,極端異常植株（小老苗、白化株、黃化株）也出現(xiàn).

博來霉素誘變處理的M0代植株都是由正常的原母體細胞和發(fā)生各種基因突變細胞形成的嵌合體.當博來霉素質(zhì)量濃度較低時發(fā)生基因突變細胞占比低,植株的生長表現(xiàn)由占絕大多數(shù)正常的原母體細胞決定,所以未明顯表現(xiàn)出生長異常;當博來霉素質(zhì)量濃度較高時發(fā)生各種基因突變的細胞占比高,且隨著博來霉素質(zhì)量濃度的提高發(fā)生基因突變細胞占比也提高,因此M0代植株在生長過程中出現(xiàn)生長異常的幾率增加.

2.3 博來霉素誘變處理M1 代變異類型及變異率的統(tǒng)計

各博來霉素誘變各處理M1代變異類型及變異率的統(tǒng)計表見表3.

由表3 可以看出,不同質(zhì)量濃度的博來霉素溶液誘變處理“濟麥22”種子,在M1 代中均能產(chǎn)生可遺傳的變異,隨著博來霉素質(zhì)量濃度的提高性狀變異類型越豐富,變異頻率也越高.本試驗采用25 mg/mL博來霉素質(zhì)量濃度誘變處理的“濟麥22”種子接近半致死劑量,M1代群體中性狀變異類型豐富,有益變異頻率較高,因此,在采用“小麥種子在博來霉素溶液中萌發(fā)生長”的誘變方法進行誘變時,宜采用的博來霉素溶液質(zhì)量濃度為25 mg/mL.

表3 各博來霉素誘變各處理M1 代變異類型及變異率的統(tǒng)計表Tab.3 Statistical table of variation type and variation rate of M1generation treated with Bleomycin concentration mutation

3 結(jié)論與討論

本研究證實了博來霉素對小麥具有誘變效應(yīng),能夠誘導小麥產(chǎn)生可遺傳的變異.M1代群體田間變異類型及變異率調(diào)查數(shù)據(jù)表明,博來霉素質(zhì)量濃度的提高,M1代性狀變異類型豐富,變異頻率也越高.這是因為在M0代小麥胚細胞的分裂DNA 復(fù)制合成過程中,博來霉素與鐵的復(fù)合物嵌入小麥胚細胞DNA,引起DNA 單鏈和雙鏈斷裂，在小麥細胞DNA 自我修復(fù)的過程中發(fā)生基因突變造成的.

本試驗采用的“小麥種子在博來霉素溶液中萌發(fā)生長”的誘變方法切實可行.與文獻[7-15]平陽霉素誘變小麥的各種方法相比,本誘變方法對M0代細胞誘變時間長,M0代細胞被誘變的代數(shù)多,在M0代這種由基因突變細胞和正常細胞構(gòu)成的嵌合體中基因突變細胞所占的比例較大,基因突變細胞形成生殖細胞將突變基因遺傳給M1代個體的幾率也大.

采用“小麥種子在博來霉素溶液中萌發(fā)生長”的誘變方法進行誘變時,宜采用博來霉素溶液質(zhì)量濃度為25 mg/mL.此時“濟麥22”種子的成苗率為53.33%,接近化學誘變的半致死劑量.小麥種子和幼苗對博來霉素的耐受力強,本試驗“濟麥22”種子能夠在50 mg/mL 質(zhì)量濃度的博來霉素溶液中萌發(fā),幼苗還能夠在50 mg/mL 質(zhì)量濃度的博來霉素溶液中長時間生長;總結(jié)現(xiàn)有文獻[7-15],在應(yīng)用平陽霉素誘變小麥時一般使用的質(zhì)量濃度都在微克每毫升級別，誘變時間也只有短短幾個小時，說明平陽霉素對小麥的生理損傷較大,分析其原因可能是平陽霉素中所含有的博來霉素以外的抗生素成分對小麥的生理損傷大,致使不能使用高劑量的平陽霉素對小麥進行化學誘變.

博來霉素和平陽霉素是類似藥物[2-3],二者都應(yīng)用于臨床,通過干擾抑制腫瘤細胞DNA 合成來阻止癌細胞的增殖,它們這種干擾抑制細胞DNA 合成的特性還能應(yīng)用于植物的化學誘變.利用博萊霉素進行化學誘變創(chuàng)制小麥新種質(zhì)資源和新品種培育是一條高效途徑,博來霉素誘變和常規(guī)育種技術(shù)相結(jié)合可以拓寬基因變異范圍,加速育種進程,提高育種效率.