寧海強(qiáng)，韓玉林，趙 軍，王愛國

（1.荷蘭百測診斷公司，北京 100032；2.河南省焦作市中站區(qū)府城辦事處獸醫(yī)站；3.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院；4.河南豬拱門生物科技有限公司）

在當(dāng)前養(yǎng)豬場將非洲豬瘟和藍(lán)耳病作為防控重點(diǎn)的背景下，養(yǎng)殖者對豬偽狂犬病的重視程度有所降低，但豬偽狂犬病的防控和凈化依然是目前許多豬場面臨的一個不可忽視和回避的話題，尤其是種豬場，豬偽狂犬病陰性場仍是一塊金字招牌，不僅僅是豬群健康程度的體現(xiàn)，也是對公司實(shí)力的認(rèn)同并對企業(yè)形象有所提升；從另一個角度來講，目前豬場生物安全普遍提高，為局域乃至全國豬偽狂犬病凈化提供了絕佳的機(jī)會。在凈化道路上，如何選擇合適的能夠用于免疫評估AD-gB-ELISA的抗體試劑盒對豬群實(shí)時監(jiān)控免疫狀態(tài)和感染壓力顯得尤為重要。下面結(jié)合AD-gB-ELISA抗體試劑盒的研發(fā)背景及臨床應(yīng)用情況進(jìn)行分析。

1 AD-gB-ELISA抗體試劑盒研發(fā)背景和目的

AD-gB-ELISA 抗體試劑盒有兩種類型，一類是預(yù)警試劑盒，主要用于預(yù)警篩查；另一類是免疫評估試劑盒，主要用于疫苗免疫后的效果評估。歐美研發(fā)生產(chǎn)上市ELISA 抗體試劑盒的廠家開始于20 世紀(jì)80 年代，大多廠家成立于20世紀(jì)90年代，而在此期間甚至更早，歐美主要養(yǎng)豬國家（美國、加拿大、法國、德國、英國、荷蘭、丹麥等）早已凈化豬偽狂犬病，豬瘟、口蹄疫等傳染病同樣如此。在此地域和時代背景下，生產(chǎn)廠家研發(fā)了適用于本國動物疾病早期篩查預(yù)警的ELISA 抗體試劑盒（如AD-gB-ELISA及CSF-E2-ELISA、FMD-SP-ELISA等），類似目前我國普遍應(yīng)用的非瘟ELISA抗體試劑盒，不是用于疫苗免疫效果評估，而是用于篩查預(yù)警、早期“拔牙”，因此對試劑盒的敏感性要求較高，即由感染到抗體轉(zhuǎn)陽要早發(fā)現(xiàn)。在20 世紀(jì)90 年代后期，這些用于篩查預(yù)警的ELISA抗體試劑盒開始陸續(xù)被引進(jìn)到中國，而中國是一個采用豬偽狂犬?。òㄘi瘟、口蹄疫等）疫苗進(jìn)行免疫的國家，因此普遍存在使用篩查預(yù)警的ELISA 抗體試劑盒進(jìn)行免疫效果評估并推廣應(yīng)用的現(xiàn)象及誤區(qū)。

從整個疫病凈化角度而言，非免無疫是最終要實(shí)現(xiàn)的目的。歐美國家定期監(jiān)測豬偽狂犬病野毒感染常采用AD-gB-ELISA 試劑盒而非AD-gE-ELISA 試劑盒，主要原因是在免疫無疫到非免無疫過渡階段，部分或個別豬場出于謹(jǐn)慎考慮，不愿意停止疫苗免疫接種，因此采用AD-gB-ELISA試劑盒不僅可以監(jiān)測豬偽狂犬病野毒感染情況，同時可以調(diào)查是否進(jìn)行豬偽狂犬病疫苗免疫接種。鑒于以上原因，國外常采用AD-gB-ELISA 試劑盒進(jìn)行初篩和預(yù)警，監(jiān)督豬場停止疫苗免疫同時預(yù)警是否有ADV野毒感染存在，這是歷史原因造成的。正是由于這樣的原因，決定了國外的試劑盒首先要考慮敏感性，盡量避免漏檢，同時也要盡量避免假陰性存在。若監(jiān)測出現(xiàn)部分gB抗體陽性，就要進(jìn)行溯源，必要條件下進(jìn)行AD-gE-ELISA試劑盒抗體驗(yàn)證，甚至通過PCR 以及免疫病理等進(jìn)一步確診及驗(yàn)證。因此用于篩查預(yù)警的試劑盒在我國現(xiàn)場推廣應(yīng)用過程中，必然會呈現(xiàn)抗體陽性率很高甚至極高情況出現(xiàn)。陽性率和保護(hù)率是兩個不同的概念，陽性率不代表保護(hù)力也不代表保護(hù)率，因此部分豬群存在抗體陽性率高但保護(hù)率、保護(hù)力低下的現(xiàn)象，這也是造成這么多年豬偽狂犬病頻發(fā)、野毒gE 抗體陽性率居高不下的一個原因和誤區(qū)。

2 AD-gB-ELISA抗體試劑盒的差異化

眾所周知，豬偽狂犬病疫苗免疫后效果評價(jià)的黃金標(biāo)準(zhǔn)是中和抗體（VN）（豬瘟、口蹄疫等疫苗同樣如此），但該方法不易操作且較費(fèi)時間，因此未被普遍采用。當(dāng)前多采用操作簡便，快速，可用于大量樣本檢測的ELISA試劑盒。作為代替檢測方法，要求結(jié)果與中和抗體之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。那么目前市售的進(jìn)口、國產(chǎn)AD-gB-ELISA 抗體試劑盒檢測數(shù)值與中和抗體是否呈線性關(guān)系（結(jié)果數(shù)值能否代表或反映中和抗體水平）、線性系數(shù)高低如何？我們通過購買強(qiáng)陽性已知中和抗體水平的高免標(biāo)準(zhǔn)血清（購自中監(jiān)所）或豬場自制內(nèi)控高免血清，對高免血清倍比稀釋為8～10 份，采用不同廠家AD-gB-ELISA 試劑盒對稀釋不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)血清進(jìn)行抗體檢測，將結(jié)果導(dǎo)入EXCEL 表中制作線性圖表，進(jìn)而清晰直觀呈現(xiàn)出不同廠家試劑盒檢測結(jié)果的線性關(guān)系。在進(jìn)行對比實(shí)驗(yàn)過程中，可以對每份稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)血清平行檢測5 次，進(jìn)行重復(fù)性分析即穩(wěn)定性分析。具體案例如表1、圖1 所示。

表1 強(qiáng)陽性血清不同試劑盒檢測結(jié)果

圖1 不同廠家試劑盒檢測數(shù)據(jù)回歸方程

從表1、圖1可以得出以下分析，僅供參考。

A試劑盒（荷蘭）所檢測的S/P值與中和抗體線性關(guān)系高達(dá)R2=0.9431，幾乎接近完美（R2=1代表完全線性關(guān)系），表明A型試劑盒所檢測的S/P值能夠真實(shí)差異化地評價(jià)疫苗免疫效果，因所檢測的S/P值與中和抗體有一一對應(yīng)的線性關(guān)系；其他三種試劑盒與中和抗體的線性關(guān)系相對差些，尤其是C試劑盒（法國），線性關(guān)系最差，試劑盒檢測結(jié)果無法差異化評價(jià)血清抗體水平，即無法準(zhǔn)確評價(jià)豬群疫苗免疫效果。

從圖1 中可看出，B 試劑盒（美國）和D 試劑盒（美國）在線性關(guān)系方面，兩者試劑盒無顯著差別，當(dāng)中和抗體水平處于中低水平時（即稀釋倍數(shù)較高的階段，即24～27 范圍），線性關(guān)系較好；當(dāng)中和抗體水平處于中高水平時（稀釋倍數(shù)較低的階段，即20～23 范圍），線性關(guān)系較差，幾乎成了一條平行線。當(dāng)豬群豬偽狂犬病疫苗免疫效果較差或一般時，用這兩個試劑盒所檢測的S/N值能夠反映疫苗免疫的真實(shí)效果（所檢測的S/N值與中和抗體呈現(xiàn)一一對應(yīng)的線性關(guān)系），但當(dāng)豬群豬偽狂犬病疫苗處于高效免疫的時候（即產(chǎn)生的中和抗體水平較高），則用這兩個試劑盒所檢測的S/N值很難反映疫苗的真實(shí)免疫效果。而C試劑盒更差，中和抗體處于低中高任何階段均不能真實(shí)呈現(xiàn)/代表/反映疫苗的免疫效果。

當(dāng)中和抗體水平處于中、高水平時（即稀釋倍數(shù)較低階段），B、C、D三個試劑盒所檢測的S/N值均較為聚集，尤其高中和抗體水平時，則聚集更為嚴(yán)重（所檢測的S/N 值均在0.0～0.1范圍），顯示離散度非常低即均勻度非常高的一種假象，這就是阻斷型/競爭型ELISA 抗體試劑盒掩蓋真實(shí)結(jié)果的“地板”現(xiàn)象，即到達(dá)一定水平時，再高的中和抗體所檢測的S/N值不再發(fā)生變化；而A試劑盒（荷蘭）因與中和抗體呈線性關(guān)系，所以檢測值相對均勻分散即離散度較高是真實(shí)結(jié)果的展現(xiàn)。

當(dāng)一個國家或地區(qū)或豬場非免凈化豬偽狂犬病情況下，B/C/D 三家gB-ELISA 抗體試劑盒用作篩查（即預(yù)警）則是比較好的選擇，尤其C 試劑盒更好（敏感性最強(qiáng)），而A型試劑盒用作篩查用即預(yù)警用則稍遜色。

在亞洲尤其中國均為豬偽狂犬病疫苗免疫國家，基本不存在抗體陰性豬只，采用特定豬偽狂犬病gB 抗體試劑盒所檢測的結(jié)果呈現(xiàn)陰性，實(shí)際上是一種假陰性（非真正抗體陰性豬），僅為母源抗體降低到一定滴度而免疫的免疫抗體尚未升到所用特定試劑盒可以檢測到的水平。

每種ELISA 抗體試劑盒均有Cut-off 值（即陰陽分界線），但對豬偽狂犬病疫苗免疫國家而言，相對Cut-off 值則結(jié)果的解讀方案更加重要，即能夠?qū)λ鶛z測的血清結(jié)果進(jìn)行解讀，能夠說明豬群/豬只免疫效果好壞。

總之，豬偽狂犬病gB-ELISA 抗體試劑盒的選擇較為復(fù)雜，雖然市售試劑盒廠家很多，目前只有間接、阻斷和競爭性ELISA 三種方法，試劑盒質(zhì)量及穩(wěn)定性均沒有問題，關(guān)鍵是清楚檢測目的進(jìn)行針對性選擇。通過上述大型集團(tuán)中心實(shí)驗(yàn)室比對結(jié)果表明，間接法AD-gB-ELISA 抗體試劑盒更能客觀真實(shí)評價(jià)豬群豬偽狂犬病疫苗免疫效果。在進(jìn)行試劑盒比對時，除比對試劑盒的穩(wěn)定性、敏感性、特異性，更要考慮所選試劑盒能否對豬場疫苗免疫狀態(tài)進(jìn)行真實(shí)評估和客觀反映?！?/p>