馮秀晶 ， 辛 秀 ， 黃 靜 ， 趙玉博 ， 劉敬軒 ， 唐琦超

(1.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院動物科技學(xué)院 ， 吉林 吉林 132101 ； 2.預(yù)防獸醫(yī)學(xué)吉林省重點實驗室 ， 吉林 吉林 132101)

目前獸醫(yī)臨床常見的子宮蓄膿、深層膿皮癥或嚴(yán)重外科感染等，因感染較嚴(yán)重或者治療不及時等原因，常常會繼發(fā)膿毒癥，導(dǎo)致動物多器官功能障礙，甚至死亡[1]。膿毒癥的發(fā)病率和病死率都極高，一項研究表明，伴有器官衰竭的膿毒癥的犬的發(fā)病率和病死率分別高達70%和47%[2-3]。脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)作為內(nèi)毒素的主要成分，廣泛用于在動物模型中復(fù)制試驗性膿毒癥誘導(dǎo)的多器官損傷[4]，其中腎臟是其主要損傷的靶器官。目前獸醫(yī)臨床尚未開發(fā)出針對膿毒癥致急性腎損傷(Acute kidney injury,AKI)的有效治療藥物和干預(yù)措施。綠原酸(Chlorogenic acid，CGA)是杜仲、金銀花、綠咖啡豆等眾多中草藥的活性成分之一，具有良好的抗腫瘤、抗氧化、抗炎等功效[5]。有研究表明，CGA作為金銀花提取物的主要抗炎成分，可通過抑制機體炎癥反應(yīng)，改善LPS誘導(dǎo)的小鼠內(nèi)毒素血癥及其導(dǎo)致的肺損傷[6-7]，也可提高盲腸結(jié)扎和穿孔誘導(dǎo)的膿毒癥大鼠的存活率。此外，CGA還可通過激活核因子E2相關(guān)因子2(Nuclear factor E2 related factor 2,Nrf2)信號通路，改善機體氧化應(yīng)激反應(yīng)，減少炎癥因子及自由基生成，減輕膿毒癥大鼠炎癥反應(yīng)[8]。但對于CGA是否能夠?qū)δ摱景Y致AKI發(fā)揮保護作用仍未可知。因此，本試驗建立大鼠膿毒癥致AKI模型，應(yīng)用CGA進行干預(yù)，探究CGA對膿毒癥致AKI的保護作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與飼養(yǎng) 40只健康成年雄性SD大鼠，體重220～250 g，購自吉林大學(xué)實驗動物中心。大鼠飼養(yǎng)在標(biāo)準(zhǔn)實驗室中，保持通風(fēng)良好，溫度控制在 22～24 ℃，相對濕度保持在45%～55%，自由采食飲水，所有大鼠在試驗前適應(yīng)環(huán)境1周。

1.2 主要試劑 脂多糖(LPS)，購自Sigma-Aldrich公司；綠原酸(CGA)，購自Sigma-Aldrich公司；腎損傷分子1(Kidney injury molecule 1，KIM-1)、中性粒細胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白(Neutrophil gelatinase-associated lipocalin，NGAL)、腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細胞介素6(Interleukin 6，IL-6)、白細胞介素1β(Interleukin 1β，IL-1β)、白細胞介素18(Interleukin 18，IL-18)、活性氧(Reactive oxygen species，ROS)、丙二醛(Malondialdehyde，MDA)和超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)試劑盒，均購自南京建成生物工程研究所；甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)、增殖細胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen，PCNA)、血紅素氧合酶1(Heme oxygenase-1，HO-1)、醌氧化還原酶1(Quinone oxidoreductase 1，NQO1)抗體，均購自沈陽萬類生物科技有限公司；核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)抗體，購自Santa Cruz公司；4%多聚甲醛、BCA試劑盒和RIPA裂解液，均購自上海碧云天生物科技有限公司。

1.3 儀器設(shè)備 RM2245半自動輪轉(zhuǎn)式切片機，購自德國Leica公司；SK210生物顯微鏡，購自麥克奧迪實業(yè)集團有限公司；1-14K高速低溫離心機，購自Sigma公司；VERSA max酶標(biāo)儀，購自美國Molecular Devices公司；SCIENTZ-48L組織研磨儀，購自寧波新芝生物科技股份有限公司；Tocan恒溫搖床，購自上海領(lǐng)成生物科技有限公司；PHS-3C型自動pH計，購自上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；YXQ-50S11高壓蒸汽滅菌器，購自上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；通用型電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀，均購自美國Bio-Rad公司；Chemi XT4化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)，購自基因有限公司。

1.4 試驗分組及處理 將40只健康成年雄性SD大鼠隨機分為5個組，分別為對照組(CON組)、綠原酸組(CGA組)、模型組(LPS組)、綠原酸干預(yù)組(CGA+LPS組)和Nrf2抑制劑組(ML385+CGA+LPS組)，每組8只。CON組不做任何處理；CGA組腹腔注射CGA[20 mg/(kg·bw)，溶于無菌生理鹽水]；LPS組腹腔注射LPS[10 mg/(kg·bw)，溶于無菌生理鹽水]；CGA+LPS組腹腔注射CGA[20 mg/(kg·bw)]，1 h后腹腔注射LPS[10 mg/(kg·bw)]；ML385+CGA+LPS組腹腔注射ML385[Nrf2抑制劑，30 mg/(kg·bw)]，30 min后其余處理同CGA+LPS組。

1.5 樣品收集與處理 大鼠腹腔注射LPS 4 h后，使用異氟醚麻醉，通過膀胱采集尿液樣本、心臟采集血液樣本，將尿液和血液樣本放在室溫靜置30 min后，4 ℃條件下3 000 r/min離心10 min，吸取上清液，用于腎臟功能和血清炎癥因子檢測；取左側(cè)腎臟組織，放入4%多聚甲醛溶液中固定，用于蘇木精-伊紅(H.E.)染色和免疫組化試驗；取右側(cè)腎臟組織，放入-80 ℃保存，用于氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測和Western blot試驗。

1.6 大鼠腎臟功能檢測 使用全自動生化分析儀測定血清尿素氮(Urea nitrogen,BUN)和肌酐(Creatinine,Cre)的水平。按照ELISA試劑盒說明書操作，測定尿液中KIM-1和NGAL的水平。

1.7 大鼠血清炎癥因子檢測 按照ELISA試劑盒說明書操作，測定大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-18水平。

1.8 大鼠腎臟H.E.染色 腎臟在4%多聚甲醛溶液中至少固定24 h后，在梯度乙醇中進行脫水，二甲苯透明后，進行石蠟包埋、切片、染色，光學(xué)顯微鏡對腎臟切片進行觀察。參照參考文獻[9]方法，使用0～4分制對腎皮質(zhì)腎小管損傷程度進行分級：0=正常；1=輕度損傷(<25%)；2=中度損傷(25%～50%)；3=嚴(yán)重損傷(50%～75%)；4=更嚴(yán)重損傷(>75%)。

1.9 大鼠腎臟氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測 根據(jù)試劑盒說明書操作，檢測腎臟組織ROS、MDA含量和SOD活性。

1.10 Western blot法檢測蛋白表達量 稱取100 mg大鼠腎臟組織，加入RIPA裂解液后，勻漿取上清液備用，進行蛋白濃度測定(BCA法)，向蛋白樣本中按比例加入蛋白上樣緩沖液和稀釋液，充分混勻，在金屬浴中煮沸10 min，室溫冷卻后存儲于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｍㄟ^制備分離膠和濃縮膠、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育(Nrf2、HO-1和NQO1)、二抗孵育、洗膜、滴加ECL發(fā)光液后，進行化學(xué)發(fā)光檢測。

1.11 免疫組化法檢測Nrf2細胞核易位情況 腎臟組織蠟塊用二甲苯脫蠟，不同濃度乙醇水化，3% H2O2孵育封閉。在室溫下與山羊血清孵育后，將Nrf2抗體加入封閉液中，4 ℃過夜孵育后，與相應(yīng)二抗結(jié)合，在37 ℃孵育30 min，用DAB洗滌和顯色。切片用蘇木精復(fù)染，使用光學(xué)顯微鏡觀察染色切片。

2 結(jié)果

2.1 CGA對LPS致AKI大鼠腎臟功能的影響 大鼠腎臟功能檢測結(jié)果見圖1，與CON組相比，LPS組血清BUN和Cre水平、尿液KIM-1和NGAL水平極顯著升高(P<0.01)；與LPS組相比，CGA+LPS組血清BUN和Cre水平、尿液KIM-1和NGAL水平極顯著降低(P<0.01)；與CGA+LPS組相比，ML385+CGA+LPS組上述4個指標(biāo)水平極顯著升高(P<0.01)；CON組與CGA組相比，上述4個指標(biāo)無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。

圖1 各組大鼠腎臟功能檢測Fig.1 Kidney function of rats in each group與CON組相比，* ：差異顯著(P < 0.05)，** ：差異極顯著(P<0.01)；與LPS組相比，##：差異極顯著(P<0.01)；與CGA+LPS組相比，&&：差異極顯著(P<0.01)；下同Compared with the CON group, * : significant difference(P < 0.05), ** : extremely significant difference(P<0.01); Compared with the LPS group, ##: extremely significant difference(P<0.01); Compared with the CGA+LPS group, &&: extremely significant difference(P<0.01). The same as below

2.2 CGA對LPS致AKI大鼠血清炎癥因子的影響 大鼠血清炎癥因子檢測結(jié)果見圖2，與CON組相比，LPS組血清TNF-α、IL-6、IL-18和IL-1β水平極顯著升高(P<0.01)；與LPS組相比，CGA+LPS組血清TNF-α、IL-6、IL-18和IL-1β水平極顯著降低(P<0.01)；與CGA+LPS組相比，ML385+CGA+LPS組上述4個指標(biāo)的水平被明顯逆轉(zhuǎn)，極顯著升高(P<0.01)；CON組與CGA組相比，上述4個指標(biāo)無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。

圖2 各組大鼠血清炎癥因子檢測Fig.2 Serum inflammatory factors of rats in each group

2.3 CGA對LPS致AKI大鼠腎臟組織顯微結(jié)構(gòu)的影響 對腎臟組織進行病理組織學(xué)觀察，結(jié)果見封二圖3A，CON組和CGA組腎小管和腎小球結(jié)構(gòu)均正常；LPS組腎小管出現(xiàn)嚴(yán)重的擴張或腫脹、空泡變性、炎性細胞浸潤、腎小管局灶性壞死等明顯的病理變化；CGA+LPS組可見腎小管損傷減輕，表現(xiàn)為腎小管輕度擴張，少量炎癥細胞浸潤；ML385+CGA+LPS組明顯逆轉(zhuǎn)了CGA的保護作用，病理變化同LPS組。大鼠腎組織病理學(xué)損傷評分結(jié)果見封二圖3B，與CON組相比，LPS組腎小管損傷評分極顯著升高(P<0.01)；與LPS組相比，CGA+LPS組腎小管損傷評分極顯著降低(P<0.01)；與CGA+LPS組相比，ML385+CGA+LPS組腎小管損傷評分極顯著升高(P<0.01)。

2.4 CGA對LPS致AKI大鼠腎臟氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響 大鼠腎臟氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測結(jié)果見封二圖4，與CON組相比，LPS組ROS、MDA水平極顯著升高(P<0.01)，SOD活性極顯著降低(P<0.01)，CGA+LPS組MDA水平顯著升高(P<0.05)；與LPS組相比，CGA+LPS組ROS、MDA水平極顯著降低(P<0.01)，SOD活性極顯著升高(P<0.01)；與CGA+LPS組相比，ML385+CGA+LPS組ROS、MDA水平極顯著升高(P<0.01)，SOD活性極顯著降低(P<0.01)。

2.5 CGA對LPS致AKI大鼠Nrf2/HO-1通路蛋白表達的影響 Western blot結(jié)果見封三圖5，與CON組相比，LPS組N-Nrf2蛋白表達量顯著升高(P<0.05)，其余蛋白表達量差異不顯著(P>0.05)，CGA+LPS組N-Nrf2、T-Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表達量極顯著升高(P<0.01)；與LPS組相比，CGA+LPS組N-Nrf2、T-Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表達量極顯著升高(P<0.01)；與CGA+LPS組相比，ML385+CGA+LPS組N-Nrf2、T-Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表達量極顯著降低(P<0.01)。

2.6 CGA對LPS致AKI大鼠Nrf2表達的影響 免疫組化檢測結(jié)果見圖6，與CON組相比，LPS組Nrf2細胞核易位差異不顯著(P>0.05)，CGA+LPS組Nrf2細胞核易位情況極顯著升高(P<0.01)；與LPS組相比，CGA+LPS組Nrf2細胞核易位情況極顯著升高(P<0.01)；與CGA+LPS組相比，ML385+CGA+LPS組Nrf2細胞核易位情況極顯著降低(P<0.01)。

圖6 各組大鼠腎臟Nrf2免疫組化染色Fig.6 Nrf2 immunohistochemical staining of rat kidneys in each group

3 討論

內(nèi)毒素是導(dǎo)致膿毒癥的常見原因[10]。LPS作為內(nèi)毒素的主要成分，已被報道參與膿毒癥的病理過程[11]。因此，根據(jù)先前的研究結(jié)果[12]，本試驗通過腹腔注射LPS[10 mg/(kg·bw)]4 h，建立大鼠膿毒癥模型。此外，大量動物模型的相關(guān)研究已經(jīng)證明CGA 對腎功能存在有益影響[13-14]。BUN和Cre是腎損傷的常規(guī)和關(guān)鍵標(biāo)志物，而KIM-1和NGAL被確定為AKI的生物標(biāo)志物。本試驗發(fā)現(xiàn)，CGA顯著減弱了LPS誘導(dǎo)的上述4種標(biāo)志物的產(chǎn)生，表明CGA對LPS誘導(dǎo)的腎損傷具有顯著的改善作用。此外，CGA干預(yù)顯著減輕了LPS誘導(dǎo)的腎臟顯微結(jié)構(gòu)損傷。因此，本試驗結(jié)果證實，CGA對 LPS誘導(dǎo)的大鼠AKI具有顯著的保護作用。

以往研究表明，炎癥反應(yīng)在膿毒癥致AKI的起始和延伸階段都發(fā)揮著重要的作用，炎癥因子如TNF-α、IL-6、IL-1等分泌增加均可促進AKI的發(fā)生發(fā)展[15-16]。這與本試驗結(jié)果相一致，LPS組血清TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-18水平顯著升高，表明炎癥反應(yīng)是膿毒癥致AKI的主要致病機制。CGA預(yù)處理后顯著降低了TNF-α、IL-6、IL-18和IL-1β水平，這與之前的結(jié)果一致[17]，表明CGA介導(dǎo)的炎癥抑制在緩解LPS誘導(dǎo)的AKI中發(fā)揮重要作用。以上結(jié)果表明，炎癥反應(yīng)在LPS致AKI的過程中發(fā)揮著重要的作用，因此，抑制機體炎癥反應(yīng)可能是多種藥物防治膿毒癥致AKI的關(guān)鍵作用靶點。

ROS誘導(dǎo)的氧化損傷可促進AKI的發(fā)生發(fā)展。CGA預(yù)處理可以減輕大鼠腎臟損傷和氧化炎癥[18]。本試驗分析了腎臟氧化應(yīng)激標(biāo)志物ROS和MDA的含量以及抗氧化劑SOD的活性。與對炎癥標(biāo)志物的影響一致，CGA治療逆轉(zhuǎn)了LPS誘導(dǎo)的ROS和MDA水平的增加以及SOD活性的降低，表明CGA在減少LPS誘導(dǎo)的氧化損傷方面發(fā)揮著重要作用。因此推測CGA可通過調(diào)節(jié)氧化和抗氧化狀態(tài)之間的平衡，從而保護腎臟組織免受氧化應(yīng)激引起的損傷。

綠原酸(CGA)廣泛存在于多種植物中，是許多中藥材和中成藥的主要有效成分之一，具有抗炎、抗氧化、抗菌、抗病毒等多種藥用功效。有研究表明，CGA對盲腸結(jié)扎穿刺法(CLP)誘導(dǎo)的小鼠膿毒癥死亡率和多器官損傷具有顯著的保護作用[19]。本試驗發(fā)現(xiàn)，CGA顯著改善了膿毒癥大鼠腎臟功能，恢復(fù)腎臟器質(zhì)性損傷。此外，有研究表明CGA可通過抑制TLR4/NF-κB信號通路，降低TNF-α、IL-1β和IL-6水平，從而減輕LPS誘導(dǎo)的AKI[20]。本試驗結(jié)果表明，CGA顯著抑制LPS誘導(dǎo)的TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-18的產(chǎn)生，表明抑制這些炎癥因子的釋放是CGA對LPS誘導(dǎo)的AKI的保護機制之一。

為進一步探究CGA對機體炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激抑制作用的具體機制，本試驗檢測了CGA對Nrf2信號通路及其下游HO-1和NQO1蛋白表達的影響。研究表明，CGA可以通過調(diào)節(jié)Nrf2/HO-1信號通路和NF-κB途徑來抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，從而預(yù)防糖尿病性腎病[21]。此外，CGA可能通過增強Nrf2介導(dǎo)的抗氧化途徑和抑制NLRP3炎性小體激活來預(yù)防四氯化碳誘導(dǎo)的急性肝損傷[22]。CGA通過Nrf2/HO-1通路對血管衰老發(fā)揮保護作用[23]。本試驗結(jié)果顯示，CGA顯著提高了Nrf2的表達，誘導(dǎo)Nrf2的核易位增多，并增加了下游HO-1和NQO1蛋白的表達。本試驗表明，CGA對LPS導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激的抑制作用可能是通過調(diào)節(jié)Nrf2/HO-1途徑發(fā)揮的。為進一步驗證該猜想，本試驗應(yīng)用了Nrf2抑制劑ML385，結(jié)果表明，CGA對機體炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激的抑制作用完全被ML385逆轉(zhuǎn)，表明CGA對LPS導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激的抑制作用是通過激活Nrf2信號通路實現(xiàn)的。

綜上所述，CGA通過激活Nrf2信號通路，促進Nrf2核易位及下游靶蛋白HO-1和NQO1表達，抑制機體炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，阻斷下游炎癥級聯(lián)瀑布反應(yīng)和氧化損傷，從而對LPS誘導(dǎo)的AKI發(fā)揮保護作用。本試驗為CGA在臨床上預(yù)防和/或治療膿毒癥致AKI提供理論依據(jù)及試驗基礎(chǔ)，并完善了CGA的藥理作用分子機制。