李又歡，鮑中奇*，高太平，黃建峰，王力敏，張洪霞，宋志忠,3**

杧果NFU家族基因的克隆、鑒定及其對非生物脅迫的響應(yīng)分析

李又歡1，鮑中奇1*，高太平2，黃建峰2，王力敏1，張洪霞1，宋志忠1,3**

1. 魯東大學(xué)農(nóng)林工程研究院/山東省高校作物高產(chǎn)抗逆分子模塊育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東煙臺(tái) 264025；2. 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所，海南?？?571101；3. 劍橋大學(xué)植物系，英國劍橋 CB2 3EA

從二倍體杧果‘桂熱82’中克隆和鑒定了4個(gè)Fe-S簇裝配所需的NFU支架蛋白編碼基因，命名為～。MiNFU2和MiNFU3擁有全部3個(gè)NFU蛋白典型的Motif基序，MiNFU1缺失Motif 3而MiNFU4缺失Motif 1和Motif 2；MiNFU1～MiNFU3擁有相似的三級(jí)結(jié)構(gòu)，而MiNFU4的三級(jí)結(jié)構(gòu)與其差異較大，極為獨(dú)特；13種不同科屬植物之間的NFU家族成員數(shù)目略有差異，擬南芥、鹽芥和短柄草3種一年生草本植物基因組中含有更多的支架蛋白，而非功能性支架蛋白在杧果、草莓、桃、蘋果、柑橘和葡萄等多年生果樹作物中更易發(fā)生丟失；植物NFU同源蛋白在系統(tǒng)發(fā)育樹上可以分為2個(gè)亞家族，且在遺傳進(jìn)化關(guān)系上差異較大，同為十字花科、禾本科或薔薇科植物的NFU同源蛋白分別傾向于緊密聚在一起，杧果NFU蛋白與柑橘和番茄相應(yīng)的同源蛋白緊密聚在一起；杧果NFU家族基因在不同組織/器官中的表達(dá)水平差異顯著，在所有檢測組織中的整體表達(dá)表達(dá)水平最高，其次是和，而整體表達(dá)水平最低，杧果家族基因均在幼苗葉片中的表達(dá)量最高，其次是韌皮部和盛開期花朵，在果實(shí)（幼果和熟果）中的表達(dá)水平相對較低；杧果NFU家族基因在轉(zhuǎn)錄水平對缺鐵、高鐵毒害、NaCl、PEG和低溫處理的響應(yīng)差異明顯，雖然的整體表達(dá)最低，但卻不受5種非生物脅迫的影響，和對高鐵處理最為敏感，其表達(dá)水平在‘桂熱82’幼苗全身組織均受高鐵處理的調(diào)控而顯著增加。此外，NaCl處理顯著增加在根部的表達(dá)量，缺鐵和PEG處理傾向于降低根部響應(yīng)的NFU基因的表達(dá)水平，而低溫處理傾向于降低葉片中響應(yīng)的NFU基因的表達(dá)水平。本研究為明確杧果Fe-S簇裝配分子機(jī)制提供基因資源，并為解析熱帶作物果樹鐵素營養(yǎng)和鐵代謝奠定理論基礎(chǔ)。

杧果；鐵代謝；Fe-S簇裝配機(jī)制；NFU支架蛋白；非生物脅迫

鐵（Fe）作為鐵硫蛋白和細(xì)胞色素的組成成分，參與多種代謝途徑和生命活動(dòng)，在植物生長、發(fā)育、果實(shí)品質(zhì)和產(chǎn)量方面發(fā)揮重要作用[1-3]。鐵硫蛋白（Fe-S protein）存在于植物質(zhì)體、線粒體、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核等亞細(xì)胞器官中，參與光合作用、呼吸作用、氮和硫同化、氨基酸和嘌呤代謝、植物激素合成和DNA修復(fù)等多種重要的代謝途徑和生命過程[4-11]。鐵硫簇（Fe-S cluster）是鐵硫蛋白的活性部位，其組裝過程需要多種功能性蛋白參與[4, 8-9, 11]。

前人研究表明：植物Fe-S簇裝配機(jī)制是一個(gè)高度復(fù)雜且協(xié)調(diào)有序的過程，是植物鐵代謝和鐵素營養(yǎng)的核心環(huán)節(jié)，在植物生命過程中不可或缺。一個(gè)典型的Fe-S簇裝配機(jī)制包括2個(gè)階段：第一階段，鐵和硫在支架蛋白上特異結(jié)合形成Fe-S簇，第二階段，F(xiàn)e-S簇被轉(zhuǎn)移到靶蛋白上，整個(gè)裝配過程涉及到鐵供體、硫供體、支架蛋白及轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等數(shù)十個(gè)功能蛋白參與[4-12]。NFU家族基因編碼典型的支架蛋白，在其作用下可將硫供體提供的S和鐵供體提供的Fe形成Fe-S簇，在擬南芥（）中研究較為透徹[4, 9, 13]。擬南芥中共含有5個(gè)NFU家族蛋白，其中，AtNFU1、AtNFU2和AtNFU3參與葉綠體Fe-S簇裝配機(jī)制，而AtNFU4和AtNFU5在線粒體Fe-S簇裝配中發(fā)揮作用[9, 13]；基因被敲除后導(dǎo)致植株矮化，葉片褪綠，F(xiàn)e-S蛋白活性降低[14-15]；擬南芥AtNFU2通過重組可形成一個(gè)二聚體并結(jié)合一個(gè)2Fe–2S簇，該簇在體外可轉(zhuǎn)移到載脂蛋白鐵氧還蛋白[16]。

近幾年，國內(nèi)外學(xué)者圍繞植物Fe-S簇裝配機(jī)制開展的研究主要集中在擬南芥[4, 9]、水稻（）[17]和大豆（）[18]等一年生模式植物，果樹學(xué)中Fe-S簇裝配的分子機(jī)制尚未清晰，僅在桃[19-20]和葡萄[21]中鑒定了Fe-S簇裝配機(jī)制相關(guān)的基因。然而，熱帶作物中有關(guān)鐵素營養(yǎng)和代謝的分子基礎(chǔ)研究仍為空白。

杧果（）是全球知名的熱帶果樹作物之一，在印度、中國和泰國等國家栽培面積大，深受消費(fèi)者喜愛[22]。本研究以二倍體‘桂熱82’杧果為材料，克隆杧果NFU家族基因并鑒定其生物信息學(xué)特征，明確杧果NFU家族基因在杧果不同組織/器官的組織特異性表達(dá)特征及其對缺鐵、高鐵毒害、NaCl、PEG和低溫等脅迫的響應(yīng)差異，為研究杧果Fe-S簇裝配和熱帶作物鐵素營養(yǎng)與代謝的分子機(jī)制提供基因資源和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為五年生‘桂熱82’杧果和一年生嫁接幼苗，均由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所提供。分別采集五年生‘桂熱82’杧果一年生新葉（采集時(shí)間：2019年4月1日）、新生韌皮部（采集時(shí)間：2019年4月1日）、新生根（采集時(shí)間：2019年4月1日）、盛開期花朵（采集時(shí)間：2019年4月1日，分為花瓣、花粉、花柱和花托）、幼果（采集時(shí)間：2019年5月1日）和成熟果實(shí)（采集時(shí)間：2019年8月1日）等材料，液氮冷凍后用于組織特異性表達(dá)特征分析。利用一年生‘桂熱82’嫁接幼苗，按照LIANG等[17]和SONG等[19]的方法，以1/2 MS液體培養(yǎng)基為對照，分別進(jìn)行缺鐵、50 mmol/L高鐵脅迫、4℃低溫脅迫、200 mmol/L NaCl和10% PEG6000（w/V）脅迫，處理1周后分別采集葉片、莖部和根部材料，用于轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)差異分析。

1.2 方法

1.2.1 杧果NFU家族基因克隆 以擬南芥5個(gè)NFU家族基因的氨基酸序列為參考，在WANG等[22]報(bào)道的杧果基因組數(shù)據(jù)中檢索杧果NFU家族基因，下載編碼區(qū)CDS（coding sequence）序列和氨基酸序列，檢索結(jié)果在Pfam（http://pfam. xfam.org/search）在線軟件驗(yàn)證功能結(jié)構(gòu)域。根據(jù)CDS序列設(shè)計(jì)上下游引物，提取‘桂熱82’葉片RNA，通過PrimeScriptTMRT reagent Kit 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa，大連）合成第一鏈cDNA作為模板，利用Prime STARTMHS DNA聚合酶（TaKaRa，大連）擴(kuò)增目的基因，送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序驗(yàn)證。

1.2.2 生物信息學(xué)分析 通過LIANG等[17]和GAO等[23]的方法，利用ProtParam在線軟件（http://expasy.org/tools/protparam.html）分析杧果NFU蛋白的化學(xué)公式、分子量、理論等電點(diǎn)（pI）、不穩(wěn)定性指數(shù)（insteadility index）、脂肪系數(shù)（aliphatic index）、總平均親水性GRAVE（grand average of hydropathicity）等理化性質(zhì)；運(yùn)用SignalP4.0在線軟件（http://www.cbs.dtu.dk/ services/SignalP-4.0/）預(yù)測杧果NFU蛋白的信號(hào)肽情況；利用Phyre2在線軟件（http://www. sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index）分析杧果NFU蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.2.3 系統(tǒng)發(fā)育樹分析 根據(jù)SONG等[19]和GAO等[23]的方法，利用ClustalX 2.0.13軟件對杧果（漆樹科）、白楊（，楊柳科）、番茄（，茄科）、葡萄（，葡萄科）、柑橘（，蕓香科）、擬南芥（十字花科）、鹽芥（，十字花科）、大豆（禾本科）、水稻（禾本科）、短柄草（，禾本科）、桃（，薔薇科）、蘋果（，薔薇科）和草莓（，薔薇科）13種植物NFU和ISU同源蛋白分別進(jìn)行氨基酸序列比對，利用軟件MEGA 13.0中的鄰接法（Neighbor-joining, NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，分析遺傳進(jìn)化關(guān)系。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析 利用NCBI/ Primer-BLAST在線軟件，設(shè)計(jì)杧果NFU家族基因的特異性表達(dá)引物（表1），以杧果為內(nèi)參，通過ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢測杧果NFU家族基因的組織特異性表達(dá)特征及其對脅迫處理的響應(yīng)差異，每個(gè)反應(yīng)進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。使用SYBR Green（TaKaRa，大連）熒光染料進(jìn)行PCR反應(yīng)，程序設(shè)定為：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，58℃退火34 s，40個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 s。獲得相應(yīng)的Ct值，經(jīng)內(nèi)參基因均一化處理，采用2-ΔΔCT法計(jì)算相對表達(dá)量，通過Log2法計(jì)算脅迫處理前后表達(dá)倍數(shù)的變化，以對照條件的表達(dá)值設(shè)定為1，若脅迫條件下的相對表達(dá)值<1，表示基因表達(dá)水平降低，若相對表達(dá)值>1，則表示基因表達(dá)水平上升，并通過HemI軟件繪制表達(dá)倍數(shù)變化的熱圖[17-20, 23]。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR所用的特異性引物

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用軟件SPSS 13.0（SPSS Chicago，美國）對數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析，杧果幼苗在脅迫處理與對照條件2個(gè)獨(dú)立樣品間進(jìn)行-檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 杧果NFU家族基因的鑒定與克隆

通過BLAST同源比對法，在杧果數(shù)據(jù)庫里檢索到4個(gè)潛在的NFU家族蛋白，Pfam注釋為NifU-like功能域或NFU Scaffold protein，GO分子功能注釋為Fe-S簇結(jié)合（GO：0051536），證實(shí)均為Fe-S簇裝配機(jī)制中的NFU家族基因，命名為杧果。分別下載各基因電子CDS序列，設(shè)計(jì)上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，測序驗(yàn)證后提交NCBI獲得Genbank ID（表2）。杧果NFU家族基因的登陸號(hào)、基因位置、染色體分布、CDS長度和編碼蛋白數(shù)量等信息詳見表2，4個(gè)杧果NFU家族基因分布在4條不同的染色體上，基因CDS最長，最短。

表2 杧果NFU家族基因信息

與已報(bào)道的擬南芥[4, 9]、桃[19]、水稻[17]和葡萄[21]基因組中NFU家族成員數(shù)量相比較，杧果NFU家族中缺失了NFU5支架蛋白，進(jìn)一步比對杧果、擬南芥、鹽芥、短柄草、番茄、大豆、水稻、白楊、草莓、桃、蘋果、葡萄和柑橘13種不同科屬植物基因組中NFU同源蛋白的存在情況（表3），結(jié)果發(fā)現(xiàn)擬南芥、鹽芥和短柄草3種一年生草本植物基因組中含有所有的NFU成員，其他10種植物在基因組中均缺失NFU5蛋白。此外，進(jìn)一步比對上述13種植物中同為支架蛋白的ISU家族成員存在情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)擬南芥、短柄草和鹽芥3種草本植物基因組中含有所有的ISU蛋白成員，而水稻、番茄和白楊在其基因組中缺失ISU3蛋白，杧果、草莓、蘋果、桃、葡萄和柑橘6種代表性果樹基因組中均缺失了ISU2和ISU3（表3）。

表3 13種植物NFU和ISU同源家族基因比較

2.2 杧果NFU家族蛋白的理化性質(zhì)與高級(jí)結(jié)構(gòu)分析

蛋白理化性質(zhì)分析結(jié)果可知（表4），杧果NFU家族蛋白均含有不同數(shù)量的C、H、N、O和S五大元素；除MiNFU2蛋白的等電點(diǎn)pI>7.00，其他3個(gè)成員的等電點(diǎn)pI<7.00，表明杧果NFU家族蛋白含有的酸性氨基酸較多；MiNFU1和MiNFU3的脂肪系數(shù)大于100、且GRAVY親水指數(shù)大于0，表明這2個(gè)NFU成員為疏水蛋白，其他2個(gè)成員均為親水蛋白（脂肪系數(shù)小于100，GRAVY親水指數(shù)小于0）；信號(hào)肽分析表明杧果NFU家族蛋白均不具有信號(hào)肽。此外，穩(wěn)定性分析表明杧果NFU蛋白的不穩(wěn)定性指數(shù)大于40，均為不穩(wěn)定蛋白（表4）。

Motif分析結(jié)果表明杧果NFU家族蛋白含有3個(gè)典型的Motif基序（圖1），Motif1～Motif3，其中，MiNFU2和MiNFU3擁有全部3個(gè)Motif基序，MiNFU1缺失Motif3基序而MiNFU4缺失Motif1和Motif2兩個(gè)基序（圖1A）；Motif1～ Motif3分別含有41、23和50個(gè)特征氨基酸數(shù)目（圖1B）。

蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果表明杧果Group I亞家族的3個(gè)NFU蛋白成員（MiNFU1～MiNFU3）擁有三級(jí)結(jié)構(gòu)極為相似，而屬于Group II亞家族的MiNFU4蛋白具有獨(dú)特的三級(jí)結(jié)構(gòu)，與Group I亞家族成員的三級(jí)結(jié)構(gòu)差異顯著（圖2）。

表4 杧果NFU家族蛋白理化性質(zhì)分析

圖1 杧果NFU家族蛋白Motif基序預(yù)測

圖2 杧果NFU家族蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測

2.3 植物NFU同源蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹分析

構(gòu)建杧果、擬南芥、鹽芥、短柄草、番茄、大豆、水稻、白楊、草莓、桃、蘋果、葡萄和柑橘13種植物NFU家族同源蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3），結(jié)果表明，13種植物NFU同源蛋白在系統(tǒng)發(fā)育樹中可以分為2個(gè)亞家族，其中NFU1～ NFU13同源蛋白屬于Group I，而NFU4同源蛋白屬于Group II，且在遺傳進(jìn)化關(guān)系上存在差異，水稻和短柄草2種禾本科單子葉植物NFU同源蛋白在遺傳距離上是最近的，其NFU1～NFU4同源蛋白分別兩兩緊密地聚在一起；其他11種雙子葉植物NFU同源蛋白傾向于聚在一起，其中，杧果MiNFU2和MiNFU3分別與柑橘相應(yīng)的同源蛋白兩兩緊密地聚在一起，杧果MiNFU4和番茄SlNFU4緊密聚在一起，擬南芥和鹽芥2種十字花科植物的NFU同源蛋白在遺傳距離上更為相近，其NFU1～NFU4同源蛋白分別緊密地兩兩聚在一起，草莓、桃和蘋果同屬于薔薇科植物，其NFU同源蛋白緊密的聚在一起，其NFU同源蛋白傾向于聚在一起，而大豆作為一年生草本植物，其Group I家族3個(gè)成員蛋白卻傾向于與上述多種木本植物NFU同源蛋白聚在一起。

2.4 杧果NFU家族基因組織特異性表達(dá)分析

qRT-PCR分析結(jié)果表明杧果NFU家族基因在五年生‘桂熱82’新生葉片、新生韌皮部、盛開期花朵、幼果、熟果和一年生嫁接幼苗根、莖和葉等多種組織/器官中均有表達(dá)，且相對表達(dá)量差異較大（圖4）；其中，在所有檢測組織中的整體表達(dá)水平都是最高的，其次是和，而的整體表達(dá)水平最低；特別地，杧果NFU家族基因在所有檢測組織中的表達(dá)趨勢相似，均在幼苗葉片中的表達(dá)水平最高，遠(yuǎn)高于其他檢測組織中的表達(dá)量，其次是韌皮部和盛開期花朵，在果實(shí)（幼果和熟果）中的表達(dá)水平相對較低。

圖3 13種植物NFU同源蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹

圖4 杧果NFU家族基因組織特異性表達(dá)分析

2.5 幼苗中杧果NFU家族基因?qū)Σ煌巧锩{迫的差異響應(yīng)

以‘桂熱82’杧果組培幼苗為材料，通過qRT-PCR分析杧果NFU家族基因在轉(zhuǎn)錄水平對不同非生物脅迫（包括缺鐵、高鐵毒害、低溫、PEG和NaCl處理）的響應(yīng)特征。結(jié)果表明（圖5），基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)量最易受外界非生物脅迫影響，至少在1個(gè)檢測組織部位（葉片、莖部或根部）對所有處理均有響應(yīng)，而的表達(dá)最為穩(wěn)定，均不受5種非生物脅迫的影響。具體地，杧果NFU家族基因?qū)Ω哞F毒害處理最為敏感，除外，其他3個(gè)杧果基因至少在1個(gè)檢測組織部位（葉片、莖部或根部）對高鐵處理有響應(yīng)，其中，和對高鐵處理最為敏感，其表達(dá)水平在‘桂熱82’幼苗全身組織中均受高鐵處理影響而顯著增加。在根部的表達(dá)水平也受高鐵處理的影響而顯著增強(qiáng)，且上升倍數(shù)（2.9倍）最為顯著。、和基因在根部的表達(dá)水平受缺鐵處理抑制而降低，在根部及在莖部和根部的表達(dá)水平受PEG處理抑制而降低，和基因在葉片的表達(dá)水平受低溫處理抑制而降低，而在根部的表達(dá)量受NaCl處理上調(diào)而增加。

A：幼苗葉片；B：幼苗莖部；C：幼苗根部；**表示差異極顯著。

3 討論

鐵是果樹生長發(fā)育最為重要的微量元素之一，與果樹生長、發(fā)育、果實(shí)品質(zhì)和產(chǎn)量密切相關(guān)[1-3, 24-26]。然而，相關(guān)研究集中在生理生化層面，有關(guān)果樹鐵素營養(yǎng)和鐵代謝的分子機(jī)制研究較少，杧果Fe-S簇裝配的分子機(jī)制依然未知。

植物Fe-S簇裝配機(jī)制是高度復(fù)雜但卻非常保守和穩(wěn)定的代謝過程，牽扯到數(shù)十個(gè)基因，分別在質(zhì)體、線粒體、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中發(fā)揮作用[4, 8-9]。前人研究表明擬南芥存在5個(gè)NFU家族成員[4, 9]，然而，杧果中僅檢索到4個(gè)NFU家族成員，發(fā)生丟失（表2），此外，在水稻[17]、大豆[18]和桃[19]基因組中亦發(fā)生缺失。已有研究表明擬南芥同樣編碼支架蛋白參與Fe-S簇裝配過程，其在水稻[17]、桃[19]和葡萄[21]Fe-S簇裝配機(jī)制相關(guān)基因中的的表達(dá)水平都是最高的，暗示ISU1是植物Fe-S簇裝配機(jī)制必不可少的支架蛋白，擬南芥、鹽芥、短柄草和大豆等4種一年生植物中擁有3個(gè)ISU家族成員，水稻、番茄和白楊中缺失成員，然而，草莓和多種木本果樹作物（杧果、蘋果、柑橘和桃）僅僅含有1個(gè)成員。特別地，LEON等[13]發(fā)現(xiàn)擬南芥中和基因的表達(dá)水平很低，推斷該基因可能沒有生物學(xué)功能或是假基因。為了驗(yàn)證這一推斷，本研究進(jìn)一步比對13種高等植物基因組中ISU和NFU同源蛋白的存在情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)相較于擬南芥、鹽芥和短柄草等3種草本植物，薔薇科（草莓、蘋果和桃）和蕓香科（柑橘）等多年生果樹作物均缺失ISU3、NFU4和NFU5成員（表3），這些發(fā)現(xiàn)再次暗示植物Fe-S簇裝配機(jī)制中的非功能性支架蛋白在長期進(jìn)化過程中更容易發(fā)生丟失，多年生木本植物鐵素營養(yǎng)代謝過程中可能利用更少數(shù)量的功能性支架蛋白。

盡管上述13種植物NFU同源蛋白在部分結(jié)構(gòu)域區(qū)段的氨基酸序列是高度一致的，但在系統(tǒng)發(fā)育樹遺傳進(jìn)化關(guān)系上的差異較大，共屬于同一科屬（薔薇科、禾本科或十字花科）植物的NFU同源蛋白更傾向于聚集在一起，而杧果NFU家族蛋白分別和柑橘或番茄相對應(yīng)的同源蛋白緊密地聚在一起（圖3），暗示這些同源蛋白的遺傳距離更近，在長期進(jìn)化過程中更傾向于擁有相同或相近的生物學(xué)功能。因此，研究模式作物番茄NFU功能可能為柑橘和杧果等熱帶或亞熱帶果樹作物NFU同源蛋白的生物學(xué)功能提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

生物學(xué)中，基因組織表達(dá)特征及其蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)均與基因的生物學(xué)功能密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)杧果Group I與Group II亞家族成員蛋白擁有的Motif基序和三級(jí)結(jié)構(gòu)差異都很明顯（圖1、圖2），且杧果NFU家族基因的組織特異性表達(dá)特征差異較大（圖4），且在轉(zhuǎn)錄水平對缺鐵等非生物脅迫的響應(yīng)情況差異明顯（圖5），這些結(jié)果充分表明杧果NFU家族基因在杧果不同組織或器官Fe-S簇裝配過程中可能發(fā)揮的生物學(xué)功能差異較大，仍需進(jìn)一步的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

此外，本研究表明杧果NFU家族基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)水平易受鐵素供應(yīng)條件的影響，特別是對高量鐵素的毒害處理較為敏感，不同組織部位中NFU響應(yīng)基因的表達(dá)水平傾向于受高鐵處理誘導(dǎo)而增強(qiáng)，而根中NFU響應(yīng)基因的表達(dá)水平受缺鐵抑制而顯著降低（圖5）。的整體表達(dá)水平最高，其在幼苗葉片、莖部和根部中的表達(dá)量分別約為其他基因的2～10倍，且在根部受高鐵毒害處理的誘導(dǎo)顯著增加（約2.9倍），受缺鐵處理的抑制而降低（約2.4），暗示MiNFU2是Fe-S簇裝配過程中具有較強(qiáng)活性的支架蛋白，其活性直接受外界鐵素水平的調(diào)控，這些結(jié)果與水稻[17]和大豆[13]中有關(guān)NFU基因響應(yīng)鐵素水平的報(bào)道相似。SONG等[19]發(fā)現(xiàn)桃中NFU家族基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)情況不受鐵素供應(yīng)的影響，雖然在杧果不同組織中的整體表達(dá)水平極低，但卻非常穩(wěn)定，其在轉(zhuǎn)錄水平不受本研究設(shè)定的5種非生物脅迫的影響，暗示該支架蛋白可能持續(xù)穩(wěn)地的發(fā)揮自身活性，進(jìn)而可有效地參與杧果Fe-S簇裝配過程。此外，值得注意的是，杧果是典型的熱帶果樹作物，其在溫帶和寒冷地區(qū)的生長適應(yīng)性相對很差，本研究發(fā)現(xiàn)和在葉片中的表達(dá)水平受4℃低溫處理的抑制而顯著降低，說明低溫環(huán)境可能抑制葉片中這些NFU支架蛋白的活性，一定程度上影響了葉片中Fe-S簇裝配過程，進(jìn)而引起一些必需鐵的代謝途徑或生命活動(dòng)發(fā)生變化，以適應(yīng)低溫環(huán)境的脅迫。

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Cloning and Identification of NFU Family Genes in Mango and Responsive Analysis to Abiotic Stresses

LI Youhuan1, BAO Zhongqi1*, GAO Taiping2, HUANG Jianfeng2, WANG Limin1, ZHANG Hongxia1, SONG Zhizhong1,3**

1. Engineering Research Institute of Agriculture and Forestry, Ludong University / Key Laboratory of Molecular Module-based Breeding of High Yield and Abiotic Resistant Plants in Universities of Shandong, Yantai, Shandong 264025, China; 2. Tropical Crops Genetic Resources Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Haikou, Hainan 571101, China; 3. Department of Plant Science, University of Cambridge, Cambridge, UK CB2 3EA

Four NFU family genes that involved in Fe-S cluster assembly were isolated and identified from diploid mango ‘Guire82’, which were entitledto, respectively. MiNFU2 and MiNFU3 proteins had all three typical motifs of NFU family proteins, while MiNFU1 lacks motif 3 and MiNFU4 lacks motif 1 and motif 2. MiNFU1 to MiNFU3 had a similar tertiary structure, while the tertiary structure of MiNFU4 was quite unique and different. There are slight differences in NFU family members among13 different plant families and genera. Three annual herbs of,, andcontain more scaffold proteins, while non-functional scaffold proteins are more likely to be lost in perennial fruit crops, such as mango, strawberry, peach, apple, citrus and grape. According to the phylogenetic tree, plant NFU homologous proteins can be divided into two subfamilies, which have differences in genetic and evolutionary relationships. Among them, NFU homologous proteins from,ortend to be closely clustered, respectively, and mango NFU proteins are closely clustered with the corresponding homologs of citrus and tomato. In addition, there were significant differences in the expression levels offamily genes in different tissues / organs of mango. The overall expression level ofwas the highest in all tested tissues, followed by4 and1, while the overall expression level of3 was the lowest. The expression levels offamily genes in seedling leaves were the highest, followed by phloem and full blooming flowers, while the expression levels offamily genes in fruits (young and mature fruits) was relatively low. Notably, the transcriptional responses ofNFU family genes in mango seedlings to iron depletion, high iron toxicity, NaCl, PEG and low temperature treatments were significantly different. Although the overall expression of3 was the lowest, it was not affected by all tested abiotic stresses.andwere more sensitive to high iron treatment, whose expression levels were significantly increased throughout the whole plant under high iron treatment. In addition, NaCl treatment significantly increased the expression ofin roots. Iron deficiency and PEG treatment tended to reduce the expression levels of responsiveNFUgenes in roots, while low temperature treatment were prone to reduce the expression levels ofresponsiveNFU genes in leaves. This study provides gene resources to elucidate the molecular mechanisms of Fe-S cluster assembly in mango, and lays a theoretical foundation to reveal Fe nutrition and metabolism in tropicalfruit crops.

mango; Fe metabolism; Fe-S cluster assembly machinery; NFU Scaffold protein; abiotic stress

S667.7

A

10.3969/j.issn.1000-2561.2022.07.001

2022-01-25；

2022-02-24

國家重點(diǎn)研究計(jì)劃子課題（No. 2019YFD1000504）；國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（No. 31501743，No. 31601819）。

李又歡（2000—），男，本科生，研究方向：果樹分子生物學(xué)；*同等貢獻(xiàn)作者：鮑中齊（2001—），男，本科生，研究方向：果樹分子生物學(xué)。**通信作者（Corresponding author）：宋志忠（SONG Zhizhong），E-mail：szhzh2000@163.com。