楊雨，陳瑞玨，陳綺瑩，馮軍，程昊，孔紅星

(1.廣西糖資源綠色加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西科技大學(xué) 生物與化學(xué)工程學(xué)院，廣西 柳州 545006；2.廣西科技大學(xué) 醫(yī)學(xué)部，廣西 柳州 545000；3.省部共建藥用資源化學(xué)與藥物分子工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西師范大學(xué)，廣西 桂林 541004)

氧氟沙星(Ofloxacin)被廣泛應(yīng)用于臨床用藥中，但由于濫用導(dǎo)致相關(guān)致病菌耐藥性的產(chǎn)生[1-2]。常用檢測(cè)方法有液相色譜[3]、液質(zhì)聯(lián)用[4]和電化學(xué)分析法等[5]，雖有較高的靈敏度，但仍存在處理復(fù)雜等不足。而表面增強(qiáng)拉曼散射(SERS)具有靈敏快速等優(yōu)點(diǎn)[6]。金屬有機(jī)框架(MOFs)因其可調(diào)孔徑、吸附性好等特點(diǎn)倍受青睞[7-8]。據(jù)報(bào)道MIL-100(Fe)具有SERS活性[9]，但效果卻差強(qiáng)人意。因此拓展MOFs在SERS基底中的應(yīng)用意義重大。

本項(xiàng)工作中，制備了新型SERS基底Fe3O4@Au@MIL-100(Fe)，其具有如下優(yōu)勢(shì)：①Fe3O4磁性內(nèi)核可以簡(jiǎn)化材料制備和檢測(cè)步驟；②大量的AuNPs可以提高檢測(cè)靈敏度；③MIL-100(Fe)比表面積大且吸附性能好，在穩(wěn)定內(nèi)部AuNPs的同時(shí)富集待測(cè)物，產(chǎn)生強(qiáng)的SERS信號(hào)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

氧氟沙星(OFLX，98%)；六水合氯化鐵(FeCl3·6H2O)、乙二醇、氯金酸(HAuCl4·4H2O，99.9%)、L-抗壞血酸(AA，99%)、三水合乙酸鈉(Na Ac)、氨水28%(NH3·H2O)、1,3,5-苯三甲酸(H3BTC，98%)、3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES，99%)、硫代乙醇酸(TGA)均為分析純；聚乙二醇4000，化學(xué)純；聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，保證試劑；實(shí)驗(yàn)用水均為實(shí)驗(yàn)室自制純化水。

JEOL JEM 2-100透射電子顯微鏡；Bruker D8A A25 X射線衍射儀；XploRA PLUS激光共聚焦拉曼光譜儀；ASAP-2460全自動(dòng)快速比表面儀；EVOLUTION 220紫外可見分光光度計(jì)；MPMS-VSM和MPMS-XL MPMS磁學(xué)測(cè)量系統(tǒng)。

1.2 Fe3O4@Au@MIL-100(Fe)的制備

1.2.1 Fe3O4的制備 采用溶劑熱法[10]合成了Fe3O4磁納米粒子。磁力攪拌下，將FeCl3·6H2O (3.46 g)加入乙二醇(70 mL)，然后快速加入NaAc (4.618 g)。攪拌30 min后，將混合物分散到四氟乙烯內(nèi)襯的不銹鋼高壓釜中，在200 ℃下加熱10 h，用磁鐵分離制備的Fe3O4納米粒子，分別用超純水和乙醇交替清洗3次。再在60 ℃下真空干燥2 h。

1.2.2 Fe3O4@Au的制備 采用種子介導(dǎo)法[11-12]合成Fe3O4@Au復(fù)合材料。首先，F(xiàn)e3O4顆粒(60 mg)分散在APTES(300 mL，質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%)的溶液中，攪拌24 h。另外，取45 mL水加入NaOH(1.5 mL，0.2 mol/L)和1 mL四羥甲基氯化磷攪拌3 min，再加入HAuCl4(270 μL，187 mmol/L)制備金種子溶液，隨后，將Fe3O4納米粒子分散到金種子懸浮液中攪拌5 h，用磁鐵分離制備的Fe3O4@Au納米粒子，用水洗滌。隨后，將制備的Fe3O4@Au納米粒子(50 mg)分散在蒸餾水(40 mL)中，將HAuCl4(4 mL，質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%)水溶液和氨水溶液(12 mL，質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%)依次加入上述懸浮液中。然后，注入AA溶液(32 mL，10 mmol/L)來(lái)減少Au種子上的HAuCl4。在4.5 h后，用蒸餾水和乙醇清洗，然后在60 ℃下真空干燥12 h。

1.2.3 Fe3O4@Au@MIL-100(Fe)的制備[13]將Fe3O4@Au納米粒子(0.10 g)分散到TGA(20 mL，0.58 mmol/L)的乙醇溶液中，搖動(dòng)24 h制備TGA功能化的Fe3O4@Au納米粒子。將產(chǎn)品磁分離，用乙醇清洗3次。然后，將TGA功能化的Fe3O4@Au納米粒子(0.1 g)分散在FeCl3·6H2O乙醇溶液(5 mL，10 mmol/L)中超聲15 min，用磁鐵分離后再分散在1,3,5-苯三羧酸(5 mL，10 mmol/L)的乙醇溶液中，超聲分散30 min得到第一層MIL-100(Fe)，循環(huán)此步驟1次，3次，5次從而獲得不同厚度的MOFs層。合成的磁性Fe3O4@Au@MIL-100(Fe)納米粒子在磁富集下用乙醇清洗3次，在 80 ℃下真空干燥。

1.3 樣品制備及拉曼光譜采集

室溫下精確稱取3.61 mg氧氟沙星標(biāo)準(zhǔn)品，加入鹽酸水溶液(pH=6.8)溶解定容至10 mL，配制成10-3mol/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，并逐級(jí)稀釋至所需濃度，待用。氧氟沙星滴眼液樣品的制備，取100 μL樣品用鹽酸水溶液(pH=6.8)定容至100 mL，待用。

取50 μL Fe3O4@Au@MIL-100(Fe)和50 μL不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣品溶液超聲混合30 min后，用移液槍吸取50 μL混合物滴在潔凈的硅片上，同時(shí)用磁鐵富集，室溫晾干，每個(gè)樣品采集3次拉曼光譜。光譜參數(shù)：波長(zhǎng)為638 nm，積分時(shí)間為10 s，平均次數(shù)為1次。

2 結(jié)果與討論

2.1 Fe3O4@Au@MIL-100(Fe)的表征

圖1a～1e分別為Fe3O4、Fe3O4@Au、Fe3O4@Au@MIL-100(Fe)[一層，三層，五層]的TEM圖。

由圖1a可知，F(xiàn)e3O4形貌良好，粒徑均一；圖1b顯示金納米粒子均勻地附著在Fe3O4納米球表面，可初步證明Fe3O4@Au制備成功；圖1c為Fe3O4@Au@MIL-100(Fe)一層的TEM圖，可以發(fā)現(xiàn)部分 Fe3O4@Au生長(zhǎng)了MOFs，分布不均勻；圖1d 為Fe3O4@Au@MIL-100(Fe)三層的TEM圖，可知在Fe3O4@Au外覆蓋了一層薄膜，與圖1c相比，MIL-100(Fe)厚度更均勻且全部生長(zhǎng)在了Fe3O4@Au的表面；圖1e為Fe3O4@Au@MIL-100(Fe)五層的TEM圖，與圖1d相比，區(qū)別并不明顯。

圖1 Fe3O4(a)、Fe3O4@Au(b)、Fe3O4@Au@MIL-100(Fe)[一層(c)，三層(d)，五層(e)]的TEM圖Fig.1 The images of TEM (a)Fe3O4;(b)Fe3O4@Au；Fe3O4@Au@MIL-100(Fe)[One layer(c),Three layers(d),Five layers(e)]

Fe3O4，F(xiàn)e3O4@Au和Fe3O4@Au@MIL-100(Fe)的XRD表征見圖2。

圖2 Fe3O4，F(xiàn)e3O4@Au和Fe3O4@Au@MIL-100(Fe)的XRD譜圖Fig.2 XRD spectra of Fe3O4,Fe3O4@Au and Fe3O4@Au@MIL-100 (Fe)

由圖2可知，F(xiàn)e3O4的XRD圖譜曲線在18.3，30.3，35.6，43.3，53.6，57.4，62.9°的衍射峰分別對(duì)應(yīng)磁性Fe3O4的(111)，(220)，(311)，(400)，(422)，(511)和(440)晶面[14]。與Fe3O4的圖譜相比，F(xiàn)e3O4@Au上出現(xiàn)了幾個(gè)新的衍射峰，38.2°，44.3°，64.6°和77.6°，這些峰對(duì)應(yīng)Au納米粒子(111)，(200)，(220)和(311)的立方晶面，這證明了Au納米粒子成功地沉積在了Fe3O4上[15]。此外，F(xiàn)e3O4@Au@MIL-100(Fe)的衍射圖譜與Fe3O4@Au的高度吻合，且沒有出現(xiàn)新的衍射峰，這可能是由于MIL-100(Fe)生長(zhǎng)得太薄導(dǎo)致的，同時(shí)也說(shuō)明MIL-100(Fe)的覆蓋沒有破壞Fe3O4@Au的晶型結(jié)構(gòu)。

圖3A為所制備的Fe3O4，F(xiàn)e3O4@Au@MIL-100(Fe)磁滯回線，在-3 000～3 000 Oe磁場(chǎng)范圍內(nèi)，F(xiàn)e3O4、Fe3O4@Au@MIL-100(Fe)獲得的磁化強(qiáng)度分別75.14，41.48 emu/g，都表現(xiàn)出超順磁性粒子的特征，如很小的滯后、剩磁和矯頑力。AuNPs和MIL-100(Fe)都是非磁性材料，隨著它們的包裹，磁性強(qiáng)度有所降低，但Fe3O4@Au@MIL-100(Fe)仍表現(xiàn)出強(qiáng)磁性，表明該材料適于樣品磁分離及富集。紫外光譜圖顯示(圖3B)，F(xiàn)e3O4沒有明顯的吸收峰，F(xiàn)e3O4@AuNPs在569 nm處有明顯的吸收峰，說(shuō)明AuNPs成功地沉積在了Fe3O4表面，F(xiàn)e3O4@Au @MIL-100(Fe)[一層(c)，三層(d)，五層(e)]分別在在538，527，524 nm處有吸收峰，與Fe3O4@Au相比，發(fā)生了藍(lán)移，可能是由于MOFs的包覆導(dǎo)致內(nèi)部AuNPs的電子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化[16]。

圖3 Fe3O4，F(xiàn)e3O4@Au@MIL-100(Fe)磁滯回線(A)及Fe3O4 (a)，F(xiàn)e3O4@Au (b),Fe3O4@Au@MIL-100(Fe)[一層(c)，三層(d)，五層(e)]的紫外-可見吸收光譜圖(B)Fig.3 Fe3O4,Fe3O4@Au@MIL-100(Fe) hysteresis loop(A) and UV-visible absorption spectrum(B)

另外，也采用氮?dú)馕矫摳綄?shí)驗(yàn)對(duì)Fe3O4@Au@MIL-100(Fe)的比表面積進(jìn)行了考察。測(cè)量之前需先將Fe3O4@Au@MIL-100(Fe)在160 ℃下真空脫氣處理6 h，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖4。

圖4 Fe3O4@Au@MIL-100(Fe)的氮?dú)馕降葴鼐€Fig.4 Nitrogen adsorption isotherm of Fe3O4@Au@MIL-100 (Fe)

由圖4可知，F(xiàn)e3O4@Au@MIL-100(Fe)的比表面積為128.9 m2/g，表明Fe3O4@Au@MIL-100(Fe)比表面積大,保持了較強(qiáng)的吸附能力，從而起到富集待測(cè)物濃度的作用。結(jié)合TEM，XRD,VSM和UV-vis表征結(jié)果，可證明已成功制備了Fe3O4@Au@MIL-100(Fe)復(fù)合材料。

2.2 Fe3O4@Au@MIL-100(Fe)的SERS性能

分析

圖6為1 416 cm-1處10-3mol/L氧氟沙星溶液的峰強(qiáng)圖?？梢灾庇^的發(fā)現(xiàn)，包裹了MOFs之后的SERS基底的拉曼信號(hào)強(qiáng)度明顯高于Fe3O4@Au。且包覆三層的拉曼信號(hào)明顯高于包覆一層的拉曼信號(hào)，結(jié)合TEM圖可知，可能是由于包覆一層的MOFs分布不均勻，導(dǎo)致富集待測(cè)物能力有所減弱。雖然包覆五層的拉曼信號(hào)略強(qiáng)于包覆三層的，但效果并不明顯。因此，本實(shí)驗(yàn)后續(xù)工作所用的SERS基底MOFs厚度皆為三層。

圖5 拉曼光譜圖Fig.5 SERS spectrum a.10-3 mol/L氧氟沙星鹽酸溶液；b.Fe3O4@Au@MIL-100(Fe)；c.Fe3O4@Au基底上的10-3 mol/L氧氟沙星鹽酸溶液;Fe3O4@Au@MIL-100(Fe)[一層(d)、三層(e)、五層(f)]底上的10-3 mol/L氧氟沙星鹽酸溶液

圖6 1 416 cm-1處10-3 mol/L氧氟沙星溶液的峰強(qiáng)圖Fig.6 Peak intensity map of 10-3mol/L ofloxacin solution at 1 416 cm-1c.Fe3O4@Au;Fe3O4@Au@MIL-100(Fe)[一層(d)、三層(e)、五層(f)]

2.3 Fe3O4@Au@MIL-100(Fe)基底均一性及穩(wěn)

定性考察

除高的靈敏度外，F(xiàn)e3O4@Au@MIL-100(Fe)還表現(xiàn)出良好的均一性與穩(wěn)定性。圖7a為10-7mol/L 氧氟沙星樣品隨機(jī)選取11個(gè)點(diǎn)的SERS光譜圖。氧氟沙星在1 416 cm-1處SERS峰的RSD為10.8%，表明該基底有良好的均一性，這是由于Fe3O4磁性內(nèi)核在外加磁場(chǎng)的條件下使熱點(diǎn)密集且均勻所引起的。

圖7 10-7 mol/L氧氟沙星溶液的SERS光譜圖(a)和1 416 cm-1處10-7 mol/L氧氟沙星溶液的峰強(qiáng)圖(b)Fig.7 SERS spectrum of 10-7mol/L ofloxacin solution (a)peak intensity map of 10-7mol/L ofloxacin solution at 1 416 cm-1 (b)

圖7b為10-7mol/L氧氟沙星在4 ℃條件下保存不同時(shí)間的Fe3O4@Au@MIL-100(Fe)基底上1 416 cm-1處SERS峰的強(qiáng)度圖，可知，該基底在3個(gè)月內(nèi)使用，可以獲得較好的定量結(jié)果，穩(wěn)定性較好，這主要?dú)w功于AuNPs密集且均勻的分布在Fe3O4表面，形成SERS增強(qiáng)熱點(diǎn)，MOF殼的覆蓋使其更加穩(wěn)定。這也為氧氟沙星的定量檢測(cè)提供了強(qiáng)有力的依據(jù)。

2.4 Fe3O4@Au@MIL-100(Fe)基底對(duì)氧氟沙星

靈敏度的考察

不同濃度氧氟沙星溶液的SERS光譜圖和濃度與拉曼峰強(qiáng)度的線性關(guān)系圖見圖8。

圖8 不同濃度氧氟沙星溶液的SERS光譜圖(a)和濃度與拉曼峰強(qiáng)度的線性關(guān)系圖(b)Fig.8 SERS spectra of ofloxacin solutions with different concentrations(a);The linear relationship between concentration and Raman peak intensity (b)

由圖8a可知，F(xiàn)e3O4@Au@MIL-100(Fe)對(duì)氧氟沙星的檢測(cè)限(S/N≥3)可達(dá)10-10mol/L，并且，在10-9～10-4mol/L的濃度線性范圍內(nèi)(圖8b)，SERS信號(hào)強(qiáng)度氧氟沙星濃度的對(duì)數(shù)呈良好的線性關(guān)系，線性方程為Y=523.4X+5 069，r=0.994。表明可以通過測(cè)量拉曼的特征峰強(qiáng)度來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)氧氟沙星的定量檢測(cè)。

2.5 樣品分析

為考察Fe3O4@Au@MIL-100(Fe)基底的實(shí)用性，本實(shí)驗(yàn)將該基底用于市售氧氟沙星滴眼液中氧氟沙星含量的檢測(cè)并進(jìn)行加標(biāo)回收。將制備好的氧氟沙星滴眼液進(jìn)行SERS檢測(cè)(圖9)，代入線性回歸方程可得該滴眼液中氧氟沙星濃度為7.42×10-7mol/L，即含量約為3 mg/mL，與標(biāo)示量相符。之后進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見表1，回收率在97.1%～106.5%，表明該方法可用于氧氟沙星的定量檢測(cè)。

圖9 拉曼光譜圖(A)和1 416 cm-1處樣品及加標(biāo)樣品峰強(qiáng)圖(B)Fig.9 Raman spectra(A);Peak intensity graphs of samples and spiked samples at 1 416 cm-1(B)a.未加標(biāo)樣品；b.加標(biāo)1.5×10-6 mol/L；c.加標(biāo)8.5×10-6mol/L；d.加標(biāo)1.5×10-5 mol/L

表1 滴眼液樣品中氧氟沙星含量的測(cè)定(n=3)

3 結(jié)論

本文合成的新型SERS基底Fe3O4@Au@MIL-100(Fe)，該基底的Fe3O4磁性內(nèi)核具有快速分離富集的能力，豐富均勻的金納米粒子具有增強(qiáng)拉曼信號(hào)的作用，表面生長(zhǎng)的MIL-100(Fe)具有良好的吸附能力，同時(shí)探討了MOFs層厚度對(duì)SERS性能的影響。最終，以Fe3O4@Au@MIL-100(Fe)[三層]為SERS基底，應(yīng)用于滴眼液中氧氟沙星含量測(cè)定。結(jié)果表明Fe3O4@Au@MIL-100(Fe) SERS基底，具有靈敏度高、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，氧氟沙星檢測(cè)限低至10-10mol/L。該方法為氟喹諾酮類抗生素快速準(zhǔn)確的SERS檢測(cè)奠定了基礎(chǔ)。