楊惠舒，湯凱璇，秦?zé)ㄓ?，徐欣欣，劉馨謠，鄭志娟

（山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟南 250355）

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品 白芷飲片（購于山東中醫(yī)藥大學(xué)校醫(yī)院中藥房，批號1904070542）干燥粉碎后過5號藥典篩。

1.1.2 試劑 蘆丁對照品（批號：202104-210421，南京源植生物科技有限公司）、無水乙醇（批號：20210506，上海國藥化學(xué)試劑）、濃鹽酸、氫氧化鈉（批號：20210102，安達實驗試劑耗材）、亞硝酸鈉、三氯化鋁、DPPH、維生素C（VC）。

1.1.3 設(shè)備 752自動紫外可見分光光度計（上海菁華科技儀器有限公司）；LDO-101-2電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海龍躍儀器設(shè)備有限公司）；qe-300多用型粉碎機（浙江屹立工貿(mào)有限公司）；TGL-16A冷凍離心機（青島正恒試驗設(shè)備有限公司）；BSA124S電子分析天平（歐萊博儀器有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 白芷總黃酮的提取

1.2.1.1 單因素實驗 在預(yù)實驗的基礎(chǔ)上，按照萃取時間（A）2.5 h、萃取溫度（B）32℃、萃取壓力（C）31 MPa的條件下進行單因素實驗，研究不同的因素條件對白芷總黃酮得率影響。

1.2.1.1.1 萃取時間 在基礎(chǔ)實驗條件的基礎(chǔ)上，精確稱取5份3 g等量白芷粉末，控制條件：萃取溫度32℃、萃取壓力31 MPa，探究超聲時間為1 h、1.5 h、2 h、2.5 h和3 h對白芷總黃酮得率的影響。

1.2.1.1.2 萃取溫度 同上控制萃取時間2.5 h、萃取壓力31 MPa的實驗條件，探究萃取溫度20℃、25℃、30℃、35℃、40℃對白芷總黃酮得率的影響。

感知機算法在線性可分情況下具有較快的訓(xùn)練速度和較高的正確率.其通過尋找超平面區(qū)分散射參數(shù)曲線.經(jīng)過多組實驗和測試，散射參數(shù)曲線經(jīng)過預(yù)處理后具有線性可分的特點，適合作為使用感知機進行二分類.

1.2.1.1.3 萃取壓力 同上控制萃取溫度32℃、萃取時間2.5 h，探究萃取壓力25 MPa、30 MPa、35 MPa、40 MPa、45 MPa對白芷總黃酮提取率的影響。

1.2.1.2 響應(yīng)面優(yōu)化 選取預(yù)實驗考察所得趨勢中對結(jié)果影響較為顯著的萃取時間、萃取溫度及萃取壓力3個條件，以白芷總黃酮含量為指標(biāo)，應(yīng)用Design-expert軟件中Box-Behnken設(shè)計方法設(shè)計3因素3水平的實驗[11]，研究各因素及各因素交互作用對白芷總黃酮含量的影響，并采用二次多項式回歸方程進行模型預(yù)測，以優(yōu)化白芷總黃酮提取工藝條件。試驗因素水平見表1。

表1 響應(yīng)面實驗因素水平設(shè)計表Table 1 Horizontal design table of response surface experimental factors

1.2.2 白芷總黃酮的含量測定

1.2.2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 取蘆丁對照品適量，精密稱定，加70%乙醇制成濃度為1.35 mg/mL的對照品儲備液。將儲備液用60%乙醇溶液稀釋得0 mg/mL、0.225 mg/mL、0.45 mg/mL、0.675 mg/mL、0.9 mg/mL、1.125 mg/mL、1.35 mg/mL的對照品溶液[7]，并統(tǒng)一滴加0.30mL5%NaNO2溶液、0.3 mL10%Al（NO3）3溶液、4mL 4%NaOH溶液，在510 nm紫外處測定吸光度[8]。

1.2.2.2 供試品溶液的制備 10.0 g白芷飲片粉末于超臨界CO2萃取釜，經(jīng)預(yù)實驗和文獻查閱參考[9]，確定條件為固定90%濃度乙醇溶液、20 L/h流量的CO2，設(shè)置不同單因素實驗的萃取溫度、萃取時間和萃取壓力進行萃取，得到待測樣品溶液[10]。

1.2.2.3 含量測定 將上述方法所得的中藥提取液與70%乙醇，按照體積比1:4配比于10 mL的比色管中作為樣液。取待測樣液和0.9 mg/mL的蘆丁對照品（參比液）各1 mL，各份按上節(jié)方法處理，測定其吸光度。代入回歸方程可得濃度數(shù)據(jù)，平行測定3次取平均值。運算后得出總黃酮得率[11]。

1.2.3 抗氧化實驗

以VC做陽性對照，配制0.03 mg/mL、0.06 mg/mL、0.09 mg/mL、0.1 mg/mL、2 mg/mL、0.15 mg/mL濃度的總黃酮提取液樣品，分別與1 mL體積、0.01 mg/mL濃度的DPPH溶液反應(yīng)，時間以30min為宜，于510 nm紫外處測定吸光度（E），檢測總黃酮的DPPH自由基清除率。清除率（D）計算公式如下：

E1：總黃酮樣品與DPPH反應(yīng)液的吸光度，E0：DPPH溶液的吸光度。

1.2.4 體外抑菌活性實驗

取兩種菌型，利用紙片法進行總黃酮的體外抑菌活性實驗。取大腸桿菌、金黃色葡萄球菌用接種環(huán)于培養(yǎng)基上劃線，將浸有不同濃度總黃酮提取液的濾紙片和無菌水濾紙片（空白對照）均勻放于培養(yǎng)基表面[12,13]，將培養(yǎng)基放于恒溫培養(yǎng)箱，一段時間后取出觀察，并確定總黃酮對不同菌種的MIC值。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 萃取時間對白芷總黃酮含量的影響 在萃取溫度32℃、萃取壓力31 MPa條件下，不同萃取時間對白芷的總黃酮含量的結(jié)果，見圖1。

圖1 萃取時間對總黃酮含量的影響Fig.1 Effect of extraction time on the total flavonoids content

2.1.2 萃取溫度對白芷總黃酮含量的影響 在萃取時間2.5 h、萃取壓力31 MPa的實驗條件，不同萃取溫度的總黃酮含量的結(jié)果，見圖2。

圖2 萃取溫度對總黃酮含量的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on the total flavonoid content

2.1.3 萃取壓力對白芷總黃酮含量的影響 在萃取時間2.5 h、萃取溫度32℃的實驗條件，不同萃取溫度的總黃酮含量的結(jié)果，見圖3。

圖3 萃取壓力對總黃酮含量的影響Fig.3 Effect of extraction pressure on the total flavonoids content

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計實驗結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面回歸模型的方差分析 利用Box-Behnken模型將上述所得數(shù)據(jù)進行多元線性回歸擬合，結(jié)果見表2?？傻没貧w方程模型：

表2 白芷總黃酮得率試驗設(shè)計與結(jié)果表Table 2 Test design and result of flavonoid yield of Angelica dahurica

其中各參數(shù)分別為：總黃酮得率（Y）萃取時間（A）、萃取溫度（B）、萃取壓力（C）。對所得的回歸模型進行方差分析，由表可見F=19.24，P＜0.001，說明所選取的三因素對總黃酮提取率的影響顯著。失擬項p（0.007 1）不顯著，決定系數(shù)R2=0.961 1，表明擬合度較好，試驗方法可靠。此外，對模型進行回歸方程系數(shù)顯著性檢驗可知：A、C、A2、C2的P＜0.01，說明因素A、因素C及二者的交互項和各自的二項式都具有顯著性影響。

2.2.2 響應(yīng)面圖結(jié)果與分析 如圖4所示，可以根據(jù)3D曲面的陡峭程度，判斷響應(yīng)值對各因素的敏感程度：越陡峭越敏感，越平緩則越遲鈍。由圖可見，C、A曲面陡峭，說明其對萃取率交互作用明顯。各因素對響應(yīng)值的影響的關(guān)系為C＞A＞B。

圖4 各因素交互響應(yīng)面結(jié)果圖Fig.4 Results of the interactive response surface of each factor

2.2.3 提取工藝優(yōu)化與檢驗 由模型分析，以A=2.5 h、B=32℃、C=31 MPa為優(yōu)化提取條件，將所測吸光度數(shù)值，帶入蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線：E=10.858 c+0.001 6，R2=0.999 9（E：吸光度，c：濃度g/mL），得總黃酮得率最大值（17.81%）。按軟件擬合所得的最佳提取條件進一步驗證試驗，結(jié)果中總黃酮得率為17.51%，與理論值之間的相對偏差小于1%，說明該實驗結(jié)果具有可驗證性，此次條件優(yōu)化具有實際意義，所得最佳工藝切行可靠。

表3 白芷總黃酮得率數(shù)學(xué)方差分析結(jié)果Table 3 Mathematical variance analysis results of flavonoid yield of Angelica dahurica

圖5 各因素交互響應(yīng)面等高線圖Fig.5 Contour map of interaction response surface of each factor

2.3 體外抗氧化實驗結(jié)果

總黃酮清除率見圖6，經(jīng)結(jié)果分析，在一定程度上，總黃酮的DPPH抗氧化程度隨著質(zhì)量濃度的增加而增加。白芷總黃酮的DPPH自由基的IC50值為0.063 mg/mL，最大清除率為72%；相比較于陽性對照VC的半數(shù)清除率濃度IC50為0.054 mg/mL，最大清除率為85%。由此可見，白芷總黃酮的抗氧化活性良好。

圖6 總黃酮DPPH自由基清除率結(jié)果Fig.6 DPPH free radical scavenging results of flavonoids

2.4 體外抑菌活性實驗結(jié)果及分析

由表4可見白芷總黃酮對于兩種菌型（大腸桿菌、金黃色葡萄球菌）均有一定的抑制作用。其中大腸桿菌的MIC值為0.5 mg/mL，金黃色葡萄球菌的MIC值為0.25 mg/mL，可以說明較少的總黃酮量就可以達到一定的抑菌效果，白芷總黃酮具有較好的體外抑菌活性。

表4 總黃酮體外抑菌活性結(jié)果對照表Table 4 Comparison of antibacterial activity results of flavonoids in vitro

3 結(jié)果與討論

由響應(yīng)面實驗結(jié)果及方差分析可知，超臨界CO2萃取白芷總黃酮的最適參數(shù)為萃取時間2.5 h、萃取溫度32℃、萃取壓力31 MPa。在此條件下提取的白芷總黃酮含量高達17.81%。溫度過高，超聲時間過長均會使得總黃酮得率下降。通過驗證試驗可知，該工藝總黃酮提取率為17.51%，與預(yù)測值相近，相對偏差小于1%。相關(guān)文獻數(shù)據(jù)表明，該方法與傳統(tǒng)的有機溶劑法對比提取率得到提高，且白芷總黃酮各類理化指標(biāo)均有所改善[14]，可見響應(yīng)面實驗?zāi)軌蜉^為準(zhǔn)確地分析出各因素間的交互作用，該方法用于提取白芷總黃酮合理可行。但單一的超臨界CO2萃取技術(shù)也存在一定的弊端，其設(shè)備造價昂貴、成本高的弊端已成為其普及的巨大阻礙[15]。

白芷總黃酮作為一種天然成分，對人體具有諸多益處，在人類健康方面擁有重要地位。通過DPPH自由基清除抗氧化實驗，證明了白芷總黃酮具有良好的抗氧化活性。同時，體外抑菌活性實驗結(jié)果也表明，總黃酮對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌有良好的抑菌活性。總黃酮的抗氧化和抑菌作用，在原有應(yīng)用的基礎(chǔ)上，可以拓展其在醫(yī)藥及醫(yī)美等其他領(lǐng)域的應(yīng)用，從而衍生出更具實際價值和意義的產(chǎn)品。