楊炎，夏俊，王慶，何穎琳，張勇，趙會宏，楊慧榮，4

1. 華南農業(yè)大學海洋學院/海洋生物資源保護與利用粵港聯(lián)合實驗室，廣東廣州510642

2. 新疆畜牧科學院獸醫(yī)研究所/新疆畜牧科學院動物臨床醫(yī)學研究中心，新疆烏魯木齊830000

3. 中山大學水生經濟動物研究所/廣東省水生經濟動物良種繁育重點實驗室，廣東廣州510275

4. 華南農業(yè)大學中山創(chuàng)新中心，廣東中山528400

肌肉生長抑制素（mstn，myostatin）又稱生長分化因子8（gdf-8），抑制肌肉細胞的增殖與分化，是骨骼肌的生長的負調控因子［1-4］。研究表明，mstn在魚類中的表達與在哺乳動物中主在骨骼肌中的表達不同，目前已經在魚類的多種組織中檢測到了mstn的表達［5-8］，這表明mstn在魚類中可能存在多種功能。

生肌過程是一個復雜的過程，在此過程中，mstn與包括和生肌決定因子-5（myf5，myogenic factor 5）、肌分化決定因子（myod，myogenic differentiation）、肌肉生成素（myog，myogenin）、成肌調節(jié)因子（mrf4，myogenic regulatory factor 4）在內的肌源性調節(jié)因子（mrfs，myogenic regulatore factors）在調節(jié)肌源性細胞的增殖和分化方面存在相互關系［4，9-10］，而依賴性激酶抑制因子（p21）與細胞增殖有關［11-12］。目前，人們認為Smads 是介導mstn信號的介質，Smads蛋白可以協(xié)助mstn對肌肉細胞的增殖與分化進行調控［13-15］。一方面，mstn通過調節(jié)p21的表達來調控細胞增殖［16-18］，另一方面，mstn可以通過調控mrfs的表達進而調控細胞的分化［19-21］。

在以往關于mstn的研究中，研究對象多集中于豬、牛、羊等哺乳動物，針對魚類的相關研究較少。斜帶石斑魚Epinephelus coioides，屬于硬骨魚綱Osteichthyes、鱸形目Perciformes、鮨科Serranidae、石斑魚亞科Epinephelinate。由于石斑魚肉質肥美鮮嫩、高蛋白、營養(yǎng)價值較高，是我國南方和東南亞國家和地區(qū)大力發(fā)展的經濟魚類。因此，本研究以斜帶石斑魚為研究對象。通過石斑魚的GS 細胞系和肌肉原代細胞對mstn的功能進行初步探究，揭示了Mstn 的亞細胞定位、Mstn 重組蛋白對mstn信號通路下游及相關基因的影響，初步推測Mstn 在斜帶石斑魚肌肉細胞增殖分化中的生理功能。

1 材料與方法

1.1 材料

斜帶石斑魚體質量（31.6±6.7）g，體長（12.8±1.0）cm，購自廣東省海洋漁業(yè)試驗中心；取樣時，首先用丁香酚將實驗魚麻醉，然后用φ=75%的乙醇擦拭魚體表，迅速將部分肌肉組織取下，一部分保存至含有Sample Protector for RNA/DNA（TAKARA，Japan）的1.5 mL 中；另一部分保存至含有φ=10%雙抗（青霉素、鏈霉素）的L15 培養(yǎng)液。取樣過程所用剪刀、鑷子、刀片等用φ=75%的乙醇擦拭后全部高壓滅菌，所有的實驗用具紫外滅菌30 min。取樣過程于超凈臺中進行，所有實驗動物操作均在華南農業(yè)大學實驗動物倫理委員會的相關指導下進行。Mstn 重組蛋白交由金斯瑞生物科技有限公司合成，其生物活性經肌肉原代細胞和Thermo Varioskan LUX 多功能酶標儀測試。

1.2 肌肉原代細胞的培養(yǎng)

將取樣的肌肉組織塊用含有φ=10%雙抗的L15培養(yǎng)液清洗3 次，然后剪成1 mm×1 mm×1 mm 左右的小塊放入培養(yǎng)瓶內。將培養(yǎng)瓶翻轉，放入28 ℃細胞培養(yǎng)箱7～8 h。向組織塊上滴加含有φ=4%雙抗以及φ=20%胎牛血清（FBS）（Gibco，USA）的L15培養(yǎng)液后正面放入細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細胞從組織塊爬出，補加培養(yǎng)液至5 mL。細胞爬滿培養(yǎng)瓶后，用胰酶（Gibco，USA）將細胞消化成細胞懸液，去掉組織塊后離心棄上清，用2.5 mL 原來的培養(yǎng)液將剩余細胞吹打均勻，轉至培養(yǎng)瓶中，補充含φ=1%雙抗和φ=20% FBS 的L15 培養(yǎng)液至5 mL。定期在顯微鏡下觀察細胞生長情況，待培養(yǎng)瓶中細胞鋪滿一層后用胰酶消化，用含φ=1%雙抗和φ=10%～20%血清的培養(yǎng)液進行半換液培養(yǎng)。

1.3 肌肉原代細胞的增殖

1.3.1 CCK-8 檢測細胞增殖在5 個96 孔板中（100 μL/孔）接種細胞懸液，每孔約2 000 個細胞，24 h后用1 000 nmol/L Mstn處理，對照組用相同體積的PBS 處理，空白組不做處理，每組8 個重復。每天同一時間取出96孔板，每孔加入10 μL CCK-8溶液，在細胞培養(yǎng)箱中孵育4 h。用酶標儀測定450 nm 處的吸光度，連續(xù)5 d，然后繪制細胞生長曲線。

1.3.2 流式細胞儀檢測細胞周期在6 孔板（1.6 mL/孔）接種細胞懸液，24 h后用1 000 nmol/L Mstn蛋白處理，對照組用相同體積的PBS處理，每組3 個重復。24 h 后用無EDTA 的胰酶消化細胞，800g離心5 min，去上清。用4 ℃的PBS清洗細胞2次，后加入250 μL PBS 重懸細胞，然后加入750 μL 4 ℃無水乙醇，4 ℃固定過夜。樣品離心去上清，用4℃PBS清洗1次，再次離心去上清。加入Rnase A 溶液20 μL，37 ℃水浴30 min。加入PI 染色液至體積分數(shù)為50 μL/mL，緩慢并充分混勻后4 ℃避光孵育30 min，染色完成后在24 h內完成流式檢測。

1.4 重組質粒的構建與細胞轉染

為了構建mstn的表達載體，分別用含有限制性酶切位點KpnI和Bamh I的引物擴增。目的基因被插入到pEGFP-C1 載體中。引物序列見表1。得到的重組質粒通過DNA 測序確認。Ezgene Endo-Free Plasmid Kit（BioMIGA，USA）用于獲得無內毒素質粒。Lipofectamine 2000（Invitrogen，USA）用于質粒轉染GS細胞。使用詳見相關試劑盒說明書。

1.5 實時熒光定量PCR技術

分別用10、100 和1 000 nmol/L 的Mstn 處理原代細胞。以PBS 處理作為對照，每組4 個重復。24 h 后用胰酶消化收集細胞，提取RNA 后利用ReverTra Ace?qPCR RT Kit（TOYOBO，Japan）反轉錄。以β-actin基因為內參，利用SYBR?Green Realtime PCR Master Mix（TOYOBO，Japan）進行實時熒光定量，測定p21、smad3、mrf4、myod和myog的表達情況。引物序列見表1。使用詳見相關試劑盒說明書。

表1 引物列表Table 1 List of primers

1.6 數(shù)據(jù)處理

利用Graphpad Prism 8.0 軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，以β-actin基因為內參，用2-△△Ct法進行分析。數(shù)據(jù)以平均值±標準差（means±SD）。當P＜0.05時，認為具有顯著性差異。

2 結 果

2.1 斜帶石斑魚Mstn亞細胞定位分析

為了檢測Mstn 在細胞中的定位，將pEGFPMSTN 質粒轉染至GS 細胞中，轉染pEGFP-C1 質粒至GS 細胞作為對照。利用熒光顯微鏡進行觀察，發(fā)現(xiàn)pEGFP-MSTN 過表達細胞的細胞質中都觀察到了呈點狀分布的綠色熒光（圖1）。這表明Mstn在GS細胞中呈細胞質分布，Mstn蛋白在細胞質中表達。

圖1 Mstn亞細胞定位Fig.1 Subcellular localization of Mstn

2.2 Mstn重組蛋白對肌肉原代細胞增殖的影響

為了檢測mstn對肌肉細胞增殖的影響，本研究用Mstn 重組蛋白分別刺激肌肉原代細胞1、2、3、4 和5 d，通過用酶標儀測定肌肉原代細胞每天的A值，再繪制細胞生長曲線。研究發(fā)現(xiàn)，用Mstn 重組蛋白處理的實驗組細胞生長明顯減緩，第1天時，對照組和實驗組細胞的活性差異就達到了顯著性水平，并且隨著處理時間的增加，細胞活性差異進一步擴大（圖2a）。同時，在用Mstn重組蛋白刺激肌肉原代細胞24 h后，收集6孔板中的細胞制作細胞懸液，固定后染色，用流式細胞儀對處理后的樣品進行檢測。結果表明，與對照組相比（圖2b），Mstn 重組蛋白處理后的細胞在S 期受阻，細胞周期受阻（圖2c）。

圖2 Mstn重組蛋白對肌肉原代細胞增殖的影響Fig.2 Effect of Mstn recombinant protein on proliferation of muscle primary cells

2.3 Mstn重組蛋白對mstn信號通路下游及相關基因的影響

為了檢測mstn對肌肉原代細胞分化的影響，本研究設計了斜帶石斑魚myod、myog、smad3、mrf4、p21等增殖分化相關的定量引物，在用不同濃度的Mstn 重組蛋白處理后，通過RT-qPCR 來測定這些基因的表達。結果如圖3所示，與對照組相比，p21mRNA 的表達隨著處理濃度的升高而上升，當處理濃度為100 和1 000 nmol/L 時存在顯著性差異；smad3mRNA 和mrf4mRNA 的表達均隨著處理濃度的升高而上升，但趨勢并不明顯，始終不存在顯著性差異；myodmRNA和myogmRNA的表達均隨著處理濃度的升高而下降，但myodmRNA 下降趨勢并不顯著，myogmRNA 則有著明顯的下降，在處理濃度為100 和1 000 nmol/L 時存在顯著性差異。

圖3 不同濃度Mstn重組蛋白處理對mstn信號通路下游及相關基因的影響Fig.3 Effects of different concentrations of Mstn recombinant protein treatment on downstream mstn signaling pathway and related genes

3 討 論

在肌肉細胞中，mstn被認為是抑制肌肉生長的強負調節(jié)因子［2，13，22-23］。研究證明，mstn的負調節(jié)作用主要是抑制細胞尤其是抑制肌肉細胞的增殖和分化［16，24-27］。

在本次研究中，亞細胞定位分析結果表明，綠色熒光在細胞質中呈點狀分布，表明Mstn 蛋白在細胞質中表達。在山羊中，亞細胞定位預測Mstn 定位于高爾基體、質膜和內質網(wǎng)膜［28］，證明Mstn定位于細胞質的結果是可靠的。

通過對mstn信號通路下游及相關基因進行RTqPCR 檢測，結果表明實驗組p21、smad3和mrf4的表達量均高于對照組，而實驗組myod和myog的表達量均低于對照組。經過統(tǒng)計學分析，其中p21的表達量在Mstn 處理濃度為中濃度和高濃度時與對照組相比具有顯著性差異，而smad3和mrf4雖然具有升高的趨勢，但與對照組相比不具有顯著性差異，表達量下降的myod和myog與對照組相比也不具有顯著性差異。許多研究表明，Mstn 結合跨膜受體結合來觸發(fā)信號傳導［13-14，19，29］。在受體下游，Smads被證明是mstn信號的典型介體［13-15，30-31］，因此認為mstn是通過經典的Smads 信號通路起作用。Smad3轉導TGF-β的信號，屬于受體激活的Smads。本研究中，用Mstn 刺激肌肉原代細胞之后，我們檢測到smad3mRNA 的表達升高，進一步證明mstn對smad3具有調節(jié)作用。Mrfs家族相關基因是肌源性調節(jié)因子，它們對肌肉細胞增殖與分化具有重要影響，在不同的發(fā)育時期按照一定的順序進行表達，對肌肉細胞的分化進行調節(jié)［32-33］。本研究中，在Mstn 刺激后，mrf4的表達有了一定程度的上升，myod和myog表達量有一定程度的下降。已有研究證明，mstn信號傳導誘導Smad3 磷酸化并增加Smad3 與Myod 的相互作用，同時，mstn通過作用于Smads 復合物導致mrfs 家族成員如myog和myod的表達量下降［19］；抑制小鼠中的mstn，發(fā)現(xiàn)mrf4表達下降［34］。因此，推測在用Mstn 刺激后，細胞內smad3表達量上升，信號轉導加強，作用于smad3下游影響細胞分化的mrfs家族，導致myod、myog表達量下降和mrf4表達量的上升，來促進肌肉原代細胞的分化。

另外，用Mstn 刺激后，細胞內的p21表達量上升。研究表明，p21是細胞增殖的抑制基因［35-37］。Mstn 可 以 抑 制 成 肌 細 胞 的 增 殖［9，38-41］。Mstn 通過上調p21的表達來抑制肌肉細胞的增殖［9］。本研究中用Mstn處理肌肉原代細胞后檢測，發(fā)現(xiàn)p21表達呈現(xiàn)上升趨勢的結果與已有研究相符。為了進一步驗證mstn對肌肉細胞增殖的影響，通過用Mstn 處理肌肉原代細胞，在酶標儀上檢測在不同處理時間的吸光度并繪制細胞生長曲線圖，并通過流式細胞儀檢測細胞周期。根據(jù)生長曲線可以看出，在用Mstn刺激后，細胞的增殖被抑制，這與此前研究中mstn抑制肌肉細胞增殖的結果相符［9，38-41］。而流式細胞儀檢測結果也證明，被Mstn重組蛋白處理過后，細胞停滯在S 期，G2 期細胞比例減少，細胞周期受阻。因此，推測本研究中Mstn 上調細胞中p21的表達，導致細胞周期受阻，進而導致細胞增殖受阻，證明Mstn 抑制肌肉原代細胞的增殖。

本研究以斜帶石斑魚的GS 細胞和肌肉原代細胞為研究對象，揭示了Mstn 的亞細胞定位、Mstn重組蛋白對mstn信號通路下游及相關基因及對肌肉細胞增殖的影響。證明了Mstn 在斜帶石斑魚GS細胞中呈點狀分布；Mstn 重組蛋白上調smad3、mrf4的表達，下調myod、myog的表達，來調節(jié)細胞的分化；同時Mstn 重組蛋白能上調p21的表達，抑制細胞的增殖。驗證了Mstn 在肌肉發(fā)育過程中的生物學功能，為后續(xù)深入開展Mstn 對魚類肌肉發(fā)育的影響研究奠定了理論基礎。