李浩楠，黃小敏，方一荷，肖雯馨，張子琴，楊 芳,2,3,*

（1.武漢工程大學(xué)環(huán)境生態(tài)與生物工程學(xué)院，湖北武漢 430205；2.武漢工程大學(xué)綠色化工過程教育部重點實驗室，湖北武漢 430205；3.磷資源開發(fā)利用教育部工程研究中心，湖北武漢 430073）

板栗（Castanea mollissimaB）屬殼斗科植物，是重要的農(nóng)作物之一，分布于世界各地。目前，我國是板栗的主要生產(chǎn)國，板栗年產(chǎn)量高達1.0×106t[1]。板栗仁作為可食用的部分，其中含有大量的蛋白質(zhì)、功能性多糖及礦物質(zhì)等[2]，深受廣大消費者喜愛。除此以外，板栗加工的副產(chǎn)物，如板栗樹及樹皮被用于工業(yè)生產(chǎn)單寧[1]，板栗葉在民間醫(yī)學(xué)中被用于治療百日咳和漆中毒[3-4]。然而，作為主要副產(chǎn)物的板栗殼和囊衣仍以燃燒和自然腐敗等方式處理。據(jù)資料顯示，板栗殼和囊衣中含有色素、多酚和多糖等化學(xué)成分[5]。多酚作為植物的次級代謝產(chǎn)物，分布于植物的外皮、葉及莖中，其抗氧化機理主要包括清除自由基，氫供體，猝滅單線態(tài)氧及螯合金屬離子[6-9]。王菲兒等[10]從板栗殼和囊衣分離并鑒定出了10 個多酚類化合物，分別為間苯二酚、2-羥基-3',4-二羥基苯乙酮、鄰苯二酚、原兒茶醛、沒食子酸甲酯、2,5-二羥基苯乙酮、B-羥丙基香草酮、原兒荼酸甲酯、對香豆酸和阿魏酸。Caccio 等[11]從板栗殼水提物中分離鑒定出了沒食子酸、原兒茶酸、綠原酸等多種多酚類化合物。Barreira 等[12]提取了板栗不同部位的多酚類物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)總酚含量最高的是板栗殼，其含量高于樹葉、皮、花、果實，并發(fā)現(xiàn)抗氧化活性與總酚含量線性相關(guān)。因此，板栗殼可以成為一種廉價和容易獲得的天然抗氧化劑來源。

近年來，多酚類物質(zhì)已經(jīng)成為研究熱點，大部分研究者聚焦于研究多酚提取工藝優(yōu)化、抗氧化活性（包括清除自由基，作為氫供體，猝滅單線態(tài)氧及螯合金屬離子等）以及抑菌活性等方面，原花青素類物質(zhì)的抗氧化活性是維生素C 的20 倍，是維生素E 的50 倍[13]。但陳夢雨等[14]通過研究葡萄籽中的原花青素，闡明它具有抗氧化、抗心肌缺血再灌注損傷、抗動脈粥樣硬化、保護血管內(nèi)皮細胞、抗癌、降血壓、降血脂、降血糖等藥理活性。研究表明，酚類化合物在化學(xué)溶劑中的抗氧化活性，抑菌活性與其經(jīng)過胃腸消化后表現(xiàn)出很大的差異。由于多酚的高代謝率和較低的生物利用度，能夠進入到血液循環(huán)和靶器官發(fā)揮生物活性的物質(zhì)可能是其代謝物。所以，溶劑提取表現(xiàn)出來的抗氧化性并不能代表其在體內(nèi)的作用。但關(guān)于板栗殼和囊衣原花青素類物質(zhì)在消化前后的組成變化鮮有研究。因此，本實驗以板栗殼和囊衣多酚提取物中的原花青素類為研究對象，采用廣泛靶向代謝組學(xué)結(jié)合超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)（ultra high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS），研究板栗殼和囊衣原花青素類物質(zhì)在體外消化過程中的代謝物種類和含量變化，為進一步開發(fā)利用板栗殼和囊衣生物資源提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

野生板栗 采自山東省祁蒙山；甲醇、乙腈、乙酸均色譜級 Sigma；無水乙醇（分析純）、胃蛋白酶（≥2500 units/mg）、胰蛋白酶（≥2500 units/mg）、膽汁提取物 國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

THZ-100 恒溫培養(yǎng)搖床 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；DK-S24 型電熱恒溫水浴鍋 上海精宏實驗設(shè)備有限公司；FW100 型高速萬能粉碎機 天津市泰斯特儀器有限公司；ML-204/02 型精密電子天平

梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；超高效Shim-pack UFLC SHIMADZU CBM30A 液相色譜（ultra performance liquid chromatography，UPLC）

島津公司；Applied Biosystems 6500 Q TRAP 串聯(lián)質(zhì)譜（tandem mass spectrometry，MS/MS） 賽默飛公司；GZX-9030 型數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；Alpha14LDplus 凍干機 德國Christ 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 板栗殼和板栗囊衣提取物的制備 采用蘇云霞等[15]研究優(yōu)化得到的最佳提取工藝提取板栗殼及囊衣中多酚，將板栗殼和囊衣分別從板栗果上剝離開，將板栗殼碎后過60 目篩，按照1:15 g/mL 的料液比，采用70%乙醇（V/V）在65 ℃條件下提取90 min后得板栗殼原花青素粗提取液，對其進行真空抽濾，并在40 ℃下真空濃縮，得到粗提液，再經(jīng)冷凍干燥得到紅棕色的板栗殼提取物（chestnut shell extract，CSE）。按照同樣的方法可以制備板栗囊衣提取物（chestnut pellicle extract，CPE），低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 體外模擬胃腸消化模型 取CSE 和CPE 溶于蒸餾水10 mL 中，加入胃消化液8 mL（3.2 mg/mL胃蛋白酶，7 mL/L HCl 以及2 g/L NaCl，pH2～3）；于恒溫搖床中250 r/min，37 ℃下孵育2 h，再加入1 mol/L NaOH 調(diào)節(jié)pH 為7，終止胃液消化反應(yīng)。向胃消化后的樣品中加入腸消化液8 mL（1.5 mg/mL胰液素，1.5 mg/mL 膽汁提取物，pH7～7.4）；于恒溫搖床中250 r/min，37 ℃下孵育2 h[16]。將腸消化后的樣品于冷凍離心機中，在8000 r/min，4 ℃條件下離心10 min，取上清液于-20 ℃下保存待分析[17]。把胃腸消化后的板栗殼代謝物記作DCSE（digested chestnut shell extract），胃腸消化后的囊衣代謝物粗提物記作DCPE（digested chestnut shell extract）。

1.2.3 代謝物定性定量分析

1.2.3.1 樣品前處理 參考蘇云霞等[15]的方法，并稍作修改，取CSE、CPE、DCSE、DCPE 分別進行真空冷凍干燥，在研磨儀中研磨1.5 min，各稱取100 mg上述樣品粉末，加入1.0 mL 的70%甲醇（V/V），放入4 ℃冰箱中過夜，其間輔以渦旋3次，輔助樣品溶解。在10000 r/min 下離心10 min，取上清液1 mL，過0.22 μm 濾膜，保存在-20 ℃，供UPLC-MS/MS分析。

1.2.3.2 高效液相色譜條件 采用超高效液相色譜進行檢測，色譜柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18（2.1 mm×100 mm， 1.8 μm）；柱溫：40 ℃；流速：0.4 mL/min；流動相：A 相為超純水（含0.04%的乙酸）、B 相為乙腈（含0.04%的乙酸）；進樣量：2 μL；洗脫梯度：0～11.0 min，流動相A 由95%變化為5%；11.0～12.0 min，5%（A）；12.0～12.1 min，流動相A 由5%變化為95%；12.1～15.0 min，95%（A）；流速：0.40 mL/min，具體洗脫程序如表1所示。

表1 色譜梯度洗脫程序Table 1 Chromatographic gradient elution procedure

1.2.3.3 質(zhì)譜條件 質(zhì)譜條件參考陳金泉[18]的方法，MS 條件：電噴霧電離（electrosprey ionization，ESI）離子源，正負離子掃描模式，電噴霧離子源溫度500 ℃；離子噴霧電壓5500 V；離子源氣體1，55 psi；離子源氣體2，60 psi；簾氣（curtain gas，CUR）25 psi。

1.2.3.4 代謝物定性定量原理 根據(jù)Zhu 等[19]的方法對代謝物進行定性和定量分析?；谧越〝?shù)據(jù)庫MWDB（metware database）和公共數(shù)據(jù)庫Mass Bank（http://www.massbank.jp/），KNAPSAcK（http://kanaya.naist.jp/KNApSAcK/），HMDB（http://www.hmdb.ca/） ， MoTo DB（ http://www. ab.wur.nl/moto/） 和METLIN（http://metlin.scripps.edu/index.php），對樣品的代謝物進行定性和定量分析。在鑒定過程中，去除了K、Na、NH4 和其他較大分子量物質(zhì)的碎片離子的重復(fù)信號。代謝物的定量基于三重四級桿質(zhì)譜的多反應(yīng)監(jiān)測模式（multiple reaction monitoring，MRM）。具體來說，首先是篩選前體離子（Q1）去除與其他分子量物質(zhì)相對應(yīng)的離子以消除干擾，前體離子沖破碰撞室并誘導(dǎo)電離形成大量碎片離子。再者，為了消除非目標(biāo)離子干擾，碎片離子通過三重四極桿過濾以選擇特征碎片離子（Q3），使定量結(jié)果更加準(zhǔn)確和可重復(fù)。使用Multia Quant（3.0.2），對色譜峰進行整合和校正，并根據(jù)色譜峰的峰面積計算相應(yīng)物質(zhì)的相對含量。為了進一步確定各代謝物的相對含量，根據(jù)代謝物保留時間和峰型對質(zhì)譜峰進行了校正。

1.3 數(shù)據(jù)處理

通過UPLC-MS/MS 分析得到的數(shù)據(jù)由R 軟件進行層次聚類分析（HCA）、主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘法判別分析（OPLS-DA）、使用變量權(quán)重值（Variable Importance for the projection，VIP）和P 值來篩選胃腸消化后代謝物差異。將比較組得到的顯著性差異代謝物進行 KEGG 代謝通路富集分析，每組樣品進行 3次生物學(xué)重復(fù)實驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 原花青素類化合物定性定量分析

研究表明，多酚在中性或稍堿性pH 下不穩(wěn)定，會發(fā)生化學(xué)轉(zhuǎn)化，如形成不穩(wěn)定的醌中間體和其他氧化化合物[20]。此外，多酚在堿性條件下往往通過疏水作用、氫鍵和共價鍵與蛋白質(zhì)結(jié)合。基于廣泛靶向代謝分析方法，利用UPLC-ESI-MS/MS 對CSE、CPE、DCSE 和DCPE 中化合物進行定性定量分析。以正負離子模式檢測代謝物，共鑒定出33 種原花青素類代謝物，包括14 種黃酮、19 種鞣質(zhì)。采用聚類熱圖對33 種原花青素代謝物進行分析，結(jié)果見圖1。

圖1 CSE、CPE、DCSE 和DCPE 不同原花青素組分的層次聚類分析熱圖Fig.1 Hierarchical cluster analysis heat map of different proanthocyanidins components of CSE, CPE, DCSE and DCPE

從圖1 中可以看出，CSE 和CPE 之間原花青素代謝物含量無顯著差異，而CSE vs DCSE 及CPE vs DCPE 比較組中，體外消化對原花青素代謝物含量影響較大。CSE 和CPE 原花青素類含量明顯高于DCSE和DCPE。CPE 和CSE 及其在體外胃腸消化過程中的代謝物中含量在前五位原花青素如表2所示。

由表2所示，其中CSE、 CPE、DCSE 和DCPE中含量最高的前五種原花青素類化合物中都含有表兒茶素、原花青素C2、原花青素A1。比較表兒茶素、原花青素C2 和原花青素A1 的含量變化，結(jié)果顯示體外消化后其含量顯著（P＜0.05）下降。據(jù)覃國新等[21]研究報道，表兒茶素在胃消化過程中含量并無明顯變化，在模擬小腸消化過程中含量顯著下降。原花青素C2、原花青素A1 為原花青素二聚體[22]，在模擬胃消化過程中，二聚體原花青素的分解為二分子原花青素單體，故導(dǎo)致原花青素二聚體類含量下降[23]。此外，據(jù)報道[24]，板栗殼中還含有沒食子酸。Filomena等[25]通過HPLC 測定了板栗不同部位的多酚類化合物，結(jié)果顯示CSE 和CPE 中均含有沒食子酸。Jung等[26]通過HPLC 測定了CSE 乙醇提取物中沒食子酸的含量，其含量為4.66 mg/g。而本文發(fā)現(xiàn)，板栗殼和囊衣中的沒食子酸與兒茶素結(jié)合，主要以沒食子兒茶素的形式大量存在。

表2 CPE 和CSE 體外胃腸消化過程中前五位原花青素類的相對含量Table 2 Relative contents of the top five proanthocyanidins in gastrointestinal digestion in vitro of CPE and CSE

2.2 代謝分析

2.2.1 主成分分析（PCA） 為了揭示CSE 和CPE之間的差異以及體外模擬消化對原花青素類成分的總體影響，對樣品組和質(zhì)量樣本（mix）進行了主成分分析。質(zhì)控樣本由樣本提取物混合制備而成，用于分析樣本在相同的處理方法下的重復(fù)性。在主成分分析得分圖（圖2）中，觀察到CPE vs DCPE、CSE vs DCSE 比較組之間被明顯分離，兩個主成分PC1 和PC2 的得分分別為82.19%和7.59%。結(jié)果表明，原花青素類物質(zhì)在模擬胃腸道消化過程中變化明顯。此外，研究發(fā)現(xiàn)圖2 中CPE-3 與其他兩個平行樣品差距較大，可能由于實驗測定時有一定的誤差，又由于主成分分析舍棄了次要部分，故而導(dǎo)致CPE-3 在圖中與其他兩個平行樣品有較大差距。結(jié)合圖1的熱圖分析以及圖3 的OPLS-DA 可以佐證以上猜想。

圖2 主成分分析Fig.2 Principal component analysis

2.2.2 正交偏最小二乘法分析（OPLS-DA） 根據(jù)OPLS-DA 模型分析代謝組數(shù)據(jù)，繪制各分組的得分圖，進一步展示各個分組之間的差異[27-28]，通過去除不需要的差異，來篩選差異成分。評價模型的預(yù)測參數(shù)有和Q2，其中分別表示所建模型對X 和Y 矩陣的解釋率，Q2表示模型的預(yù)測能力，這三個指標(biāo)越接近于1 時表示模型越穩(wěn)定可靠，Q2＞0.5 時可認為是有效的模型，Q2＞0.9 時為出色的模型。OPLD-DA 分析如圖3所示。

圖3 OPLD-DA 分析Fig.3 OPLD-DA analysis

2.2.3 原花青素差異代謝物篩選 基于OPLS-DA分析結(jié)果，從獲得的多變量分析OPLS-DA 模型的變量重要性投影（variable importance in project，VIP），可以初步篩選出比較組間差異代謝物。VIP 值表示對應(yīng)代謝物的組間差異在模型中各組樣本分類判別中的影響強度，VIP≥1 的代謝物則為差異顯著，見表3～表6。VIP 值越大，說明該差異代謝物對樣品組間的分類判別的影響強度和解釋能力越強[29]。CSE vs CPE 比較組存在的差異代謝物共有16 種（下調(diào)15 種，上調(diào)1 種），DCSE vs DCPE 比較組存在的差異代謝物共有12 種（下調(diào)12 種，上調(diào)0 種），CSE 和DCSE 比較組存在的差異代謝物共有16 種（下調(diào)16 種，上調(diào)0 種），CPE 和DCPE 之間存在的差異代謝物共有17 種（下調(diào)17 種，上調(diào)0 種）。CSE vs DCSE、CPE vs DCPE 比較組中顯著差異代謝物只有下調(diào)化合物，這表明在消化過程中，原花青素類化合物降解為其他化合物。在此基礎(chǔ)上，考慮到有些代謝物的含量較小，存在偶然誤差的可能性較大，故本文僅取含量排名前20 種的代謝物進行差異代謝物分析。

表3 CSE 和CPE 的顯著差異代謝物Table 3 Significantly different metabolites between CSE and CPE

表6 CPE 和DCPE 的顯著差異物Table 6 Significant difference between CPE and DCPE

從表4 和表5 可以看出，對于初始樣品和消化樣品（CSE 和DCSE、CPE 和DCPE），它表明代謝物中原花青素類的結(jié)構(gòu)在消化過程中顯著改變，如板栗殼和囊衣中的沒食子兒茶素-兒茶素-兒茶素的VIP值分別為5.82 和5.55，說明其在消化體系中，降低程度較高，分別達到了98.23%和97.86%。與OPLSDA 結(jié)果相互驗證。因此，在模擬體外消化過程中，原花青素類物質(zhì)含量普遍下降，轉(zhuǎn)化為其他種類的物質(zhì)。在CSE 和CPE 中檢測出的原花青素類物質(zhì)中，原花青素C1、表兒茶素、兒茶素等有較多學(xué)者研究，但四羥基黃烷酮-（4α-8-表兒茶素）*、2α,3α-環(huán)氧-5,7,3',4'-四羥基黃烷-（4β-8-表兒茶素）*、赤芍素等物質(zhì)少有學(xué)者研究，甚至未深入了解其結(jié)構(gòu)和功能特性。

表4 DCSE 和DCPE 的顯著差異物Table 4 Significant difference between DCSE and DCPE

表5 CSE 和DCSE 的顯著差異物Table 5 Significant difference between CSE and DCSE

2.2.4 原花青素差異代謝物富集分析 利用差異代謝物KEGG ID 對顯著差異的原花青素化合物進行通路富集分析[30]，代謝通路富集分析結(jié)果以氣泡圖的形式展示，見圖4。圖4A 中每一個縱坐標(biāo)代表一條代謝通路，共有5 個，即在KEGG 中查詢到了5 個代謝通路，分別為新陳代謝途徑、類黃酮生物合成、次級代謝產(chǎn)物的生物合成、苯丙烷類生物合成、AMPK 信號通路。圖4B 中，也有5 個代謝途徑，與圖4A 一致。在圖4A 中，苯丙烷類生物合成氣泡顏色較深，說明這些代謝途徑在模擬消化過程中，變化較大。在圖4B 中，氣泡顏色普遍較深，但苯丙烷類生物合成最深，說明它在模擬消化過程中，變化最大。

圖4 板栗殼和囊衣組間和消化前后顯著性差異原花青素類物質(zhì)的KEGG 富集圖Fig.4 KEGG enrichment of procyanidins between chestnut shell and capsule coating groups and before and after digestion

由表7 知，在模擬胃腸消化過程中，板栗殼和囊衣中原花青素類物質(zhì)的差異代謝物有表兒茶素（C09727）、表沒食子酸兒茶素（C12136）、沒食子兒茶素（C12127）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯*（C09731）。其中，表兒茶素是一種黃酮類化合物，屬于黃烷醇類化合物它不僅對心腦血管有防治作用[31]，而且在預(yù)防腫瘤和抗氧化性方面作用顯效[32]。

表7 CSE vs DCSE 以及CPE vs DCPE 差異組分參與的代謝途徑Table 7 Metabolic pathways involved in different components of CSE vs DCSE and CPE vs DCPE

本實驗通過KEGG 富集差異組分得到的5 條代謝通路，其中板栗殼和囊衣中的原花青素在模擬胃腸消化過程中，主要通過苯丙烷類生物合成的方式發(fā)生了降解，導(dǎo)致其含量降低。這些變化是導(dǎo)致原花青素類物質(zhì)生物利用率低的主要原因。對多酚的影響，然后總結(jié)腸消化環(huán)境影響了苯丙烷類生物合成，導(dǎo)致單體化合物含量降低。

3 結(jié)論

本實驗以板栗殼和囊衣提取物中的原花青素類為研究對象，采用基于UPLC-MS/MS 的廣泛靶向代謝組學(xué)技術(shù)，研究板栗殼和囊衣原花青素類物質(zhì)在體外消化過程中的代謝物種類和含量變化。在板栗殼和囊衣的組分分析中，我們發(fā)現(xiàn)了四羥基黃烷酮-（4α-8-表兒茶素）*、2α,3α-環(huán)氧-5,7,3',4'-四羥基黃烷-（4β-8-表兒茶素）*、赤芍素等幾類物質(zhì)少有學(xué)者研究，后續(xù)研究可對這些原花青素類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能特性做進一步研究。從含量上分析，CSE 和CPE中的原花青素類物質(zhì)在消化后均顯著降低。其中，沒食子兒茶素-兒茶素-兒茶素降低程度最高，在板栗殼和囊衣兩類樣品中分別達到了98.23、97.86%。CSE vs DCSE 分析結(jié)果顯示，板栗殼原花青素類物質(zhì)中表兒茶素、原花青素C2、原花青素A1、沒食子兒茶素、沒食子兒茶素-兒茶素-兒茶素等16 種原花青素類化合物均呈顯著下調(diào)，CPE vs DCPE 分析結(jié)果顯示，板栗囊衣原花青素類物質(zhì)中沒食子兒茶素-兒茶素-兒茶素、沒食子兒茶素、沒食子酸兒茶素沒食子酸酯、表沒食子兒茶素沒食子酸酯*等17 種原花青素類化合物均呈顯著下調(diào)。在未來研究中，可以考慮設(shè)計靶向釋放載體對原花青素類物質(zhì)進行包埋，以提高其生物利用率。