高 瑜，仵倩紅，胡 萍，王 立，郭 樂(lè)

(1.陜西省結(jié)核病防治院/陜西省第五人民醫(yī)院內(nèi)四科，西安710100； 2.陜西省結(jié)核病防治院/陜西省第五人民醫(yī)院影像中心，西安 710100； 3.陜西省結(jié)核病防治院/陜西省第五人民醫(yī)院內(nèi)五科，西安 710100)

隨著國(guó)家對(duì)肺結(jié)核的管控，肺結(jié)核發(fā)病率呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，但患者疾病負(fù)擔(dān)及總經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)表現(xiàn)為升高趨勢(shì)，仍需將肺結(jié)核的防治作為重點(diǎn)關(guān)注內(nèi)容[1]。目前，臨床對(duì)于肺結(jié)核的治療以服用抗結(jié)核藥為主，但隨著耐藥菌株的增多和擴(kuò)散，耐多藥結(jié)核病(multidrug resistant tuberculosis，MDR-TB)發(fā)生率也越來(lái)越高[2]。耐藥結(jié)核病的治療極為棘手，MDR-TB患者中僅48%的患者獲得治療成功，病死率和失訪率分別高達(dá)15%和28%。結(jié)核分枝桿菌為胞內(nèi)寄生菌，其感染率很高，發(fā)病率卻較低，除與感染的細(xì)菌量和毒力等相關(guān)外，還與患者機(jī)體免疫功能有關(guān)[3-4]。機(jī)體抗結(jié)核免疫主要為細(xì)胞免疫，而影響細(xì)胞免疫程度的主要為T淋巴細(xì)胞亞群。有研究結(jié)果顯示，肺結(jié)核患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群含量與健康人群存在顯著差異，且與預(yù)后相關(guān)[5]。因此，本研究探討了非耐藥和耐多藥肺結(jié)核患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群動(dòng)態(tài)變化及臨床意義，以期為肺結(jié)核治療提供資料。

1 資料與方法

1.1 資料來(lái)源

本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)[(2020)年臨審第(1)號(hào)]，納入2020年1月至2021年6月我院收治的97例肺結(jié)核患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)非耐藥肺結(jié)核患者，①X線檢查或胸部CT檢查考慮肺結(jié)核，且為初次治療；②痰找抗酸桿菌陽(yáng)性、痰結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性；③結(jié)核分枝桿菌藥物敏感試驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)耐藥。(2)耐多藥肺結(jié)核患者，①X線檢查或胸部CT檢查考慮肺結(jié)核；②痰結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性；③結(jié)核分枝桿菌藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果顯示，至少對(duì)利福平、異煙肼耐藥。排除標(biāo)準(zhǔn)：患有肺外結(jié)核者；合并免疫系統(tǒng)相關(guān)疾病者；長(zhǎng)期服用激素或者近1年內(nèi)曾用免疫抑制劑者；因患有其他疾病，不能耐受一線或二線抗結(jié)核藥治療者；人類免疫缺陷病毒陽(yáng)性者；合并腫瘤者；妊娠或哺乳期婦女。97例患者中，男性53例，女性44例；年齡20～68歲，平均(41.57±9.26)歲。

1.2 病原菌培養(yǎng)與藥物敏感試驗(yàn)

采集所有患者痰液，接種于M-H培養(yǎng)基中進(jìn)行病原菌培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：37 ℃環(huán)境中培養(yǎng)24 h，取單個(gè)菌落接種于羅氏固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)16～24 h。采用Kirby-Bauer紙片擴(kuò)散法(K-B法)進(jìn)行藥物敏感試驗(yàn)，在同一平板中選擇3～5個(gè)性狀相似的菌落，采用接種環(huán)進(jìn)行接種，于35 ℃環(huán)境中培養(yǎng)2～6 h，以0.9%氯化鈉溶液稀釋后接種于MHA平板上。孵育完成后，根據(jù)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所制定的標(biāo)準(zhǔn)[6]進(jìn)行結(jié)果判斷，采用游標(biāo)卡尺(精確度為1 mm)測(cè)量抑菌圈直徑，若發(fā)現(xiàn)抑菌圈內(nèi)有散在菌落生長(zhǎng)，提示可能為混合生長(zhǎng)，需重新分離純化鑒定，再次行藥物敏感試驗(yàn)。耐多藥判斷標(biāo)準(zhǔn)：符合《耐藥結(jié)核病化學(xué)治療指南(2015)》[7]中MDR-TB診斷標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)結(jié)核分枝桿菌藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果，將患者分為耐多藥組、非耐藥組。

1.3 治療方法

耐多藥組患者根據(jù)藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果，依據(jù)《中國(guó)耐多藥和利福平耐藥結(jié)核病治療專家共識(shí)》(2019年版)制定治療方案。非耐藥組患者采用異煙肼(1次0.3 g，1日1次)、利福平(體重<50 kg者1次0.45 g，1日1次；體重≥50 kg者1次0.6 g，1日1次)、吡嗪酰胺(1次0.5 g，1日3次)和鹽酸乙酰丁醇(1次0.75 g，1日1次)等常規(guī)抗結(jié)核藥治療。

1.4 外周血T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)

抽取所有受檢者新鮮EDTA抗凝血4 mL，分為2份，一份通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD3、CD4、CD8、CD4/CD8以及Tregs亞群水平；另一份檢測(cè)Thl、Th2和Thl7細(xì)胞亞群水平。耐多藥組和非耐藥組患者于接受抗結(jié)核治療療程結(jié)束后1 d抽取2份新鮮血液樣本，用于檢測(cè)外周血T淋巴細(xì)胞亞群水平。使用美國(guó)Beckman Coulter公司熒光校正微球校準(zhǔn)儀器光路與流路，根據(jù)試劑使用說(shuō)明書，按照所測(cè)的樣本數(shù)取相應(yīng)數(shù)目的流式細(xì)胞儀專用試管。CD3、CD4、CD8和Tregs亞群測(cè)定：向每支試管中分別加入熒光素標(biāo)記的抗體試劑各10 mL，再加入EDTA抗凝全血10 μL，混勻后于室溫(25 ℃)下避光孵育20 min，向每支試管中各加入溶血?jiǎng)?00 μL，混勻后于室溫下避光孵育10 min后上機(jī)。分別計(jì)算外周血T淋巴細(xì)胞CD3+、CD4+、CD8+和CD4+/CD8+水平，外周血Th1、Th2和Th17細(xì)胞亞群水平。

1.5 治療效果評(píng)定

參照文獻(xiàn)[8]，根據(jù)治療后病灶吸收情況評(píng)定治療效果：治療后病灶縮小≥50%為預(yù)后良好，治療后病灶縮小<50%為預(yù)后不良。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 結(jié)核分枝桿菌藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果顯示，耐多藥肺結(jié)核患者39例，非耐藥肺結(jié)核患者58例。耐多藥組患者中，男性23例，女性16例；年齡20～66歲，平均(44.20±8.25)歲。非耐藥組患者中，男性33例，女性25例；年齡20～68歲，平均(40.18±9.10)歲。兩組患者基線資料相似，有可比性。

2.2 外周血T淋巴細(xì)胞CD3+、CD4+、CD8+和CD4+/CD8+水平比較

治療前，耐多藥組患者外周血T淋巴細(xì)胞CD3+、CD4+和CD4+/CD8+水平顯著低于非耐藥組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；兩組患者CD8+水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與治療前比較，非耐藥組患者治療后外周血T淋巴細(xì)胞CD3+、CD4+和CD4+/CD8+水平均顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而耐多藥組患者治療后外周血T淋巴細(xì)胞CD3+、CD4+和CD4+/CD8+水平與治療前比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 兩組患者治療前后外周血T淋巴細(xì)胞CD3+、CD4+、CD8+和CD4+/CD8+水平比較

2.3 外周血Th1、Th2和Th17細(xì)胞亞群水平比較

治療前，耐多藥組患者外周血Th1、Th2水平顯著低于非耐藥組，外周血Th17水平顯著高于非耐藥組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與治療前比較，非耐藥組患者治療后外周血Th1、Th2水平顯著升高，外周血Th17水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而非耐藥組患者治療前后上述指標(biāo)水平比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 兩組患者治療前后外周血Th1、Th2和Th17細(xì)胞亞群水平比較

2.4 抗結(jié)核治療效果比較

非耐藥組患者抗結(jié)核治療預(yù)后良好率為77.59%(45/58)，顯著高于耐多藥組的35.90%(14/39)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=17.009，P<0.001)。

3 討論

結(jié)核病防治一直是臨床研究的重點(diǎn)，如今越來(lái)越多的抗結(jié)核藥在臨床發(fā)揮了較好的治療效果，控制了疾病進(jìn)展和泛濫[9]。但也伴隨著一些不合理用藥情況的出現(xiàn)，導(dǎo)致結(jié)核菌耐藥增加[10-11]。耐藥結(jié)核病是由于基因突變使藥物對(duì)結(jié)核分枝桿菌的效力降低導(dǎo)致的，耐藥基因間的相互關(guān)系尚不知曉，耐藥機(jī)制極其復(fù)雜仍處于不斷探索階段。耐藥性直接關(guān)系到患者的治療效果及預(yù)后，分析MDR-TB患者的病情對(duì)提高臨床治愈率具有至關(guān)重要的作用。

研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，人體在感染結(jié)核菌之后并不會(huì)馬上發(fā)病，而是在免疫功能降低或細(xì)胞介導(dǎo)病態(tài)反應(yīng)增高時(shí)才會(huì)發(fā)病[12]。因此，有學(xué)者認(rèn)為，結(jié)核病的發(fā)生發(fā)展不僅與致病菌感染有關(guān)，還與患者自身的免疫功能密切相關(guān)，其在細(xì)胞免疫功能降低的情況下更易發(fā)病[13]。T淋巴細(xì)胞在結(jié)核病患者的細(xì)胞免疫過(guò)程中起著重要作用。CD3+T細(xì)胞可以激活T淋巴細(xì)胞參與細(xì)胞免疫；CD4+T細(xì)胞可以激活效應(yīng)T細(xì)胞及其他免疫細(xì)胞聚集于感染部位發(fā)揮免疫保護(hù)作用；CD8+T細(xì)胞也共同作用CD4+T細(xì)胞所介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，可以溶解已經(jīng)吞噬的結(jié)核菌及受抗原影響產(chǎn)生的巨噬細(xì)胞，并分泌γ干擾素等細(xì)胞因子增加抗原呈遞，拮抗結(jié)核菌感染[14-15]。Th細(xì)胞能夠進(jìn)一步分化為不同的亞群，通過(guò)不同的轉(zhuǎn)錄因子，分泌細(xì)胞因子和趨化因子，通過(guò)復(fù)雜的作用機(jī)制協(xié)調(diào)不同的免疫效應(yīng)機(jī)制。Th1細(xì)胞在誘導(dǎo)結(jié)核分枝桿菌等細(xì)胞外致病菌的保護(hù)性免疫反應(yīng)方面起著關(guān)鍵作用，能刺激分泌白細(xì)胞介素(IL)2、IL-18和干擾素細(xì)胞因子，是器官特異性自身免疫的主要驅(qū)動(dòng)因素。Th2可以產(chǎn)生IL-4、IL-5等細(xì)胞因子介導(dǎo)細(xì)胞免疫及細(xì)胞毒T細(xì)胞的生長(zhǎng)和活化，抑制致病菌的感染作用。Th17是近年來(lái)越來(lái)越受到關(guān)注的細(xì)胞亞群，在結(jié)核分枝桿菌感染過(guò)程中，Th17有利于機(jī)體形成結(jié)核保護(hù)性免疫并加速二次免疫應(yīng)答，從而起到清除結(jié)核分枝桿菌的作用[16-17]。

本研究中，耐多藥組患者外周血T淋巴細(xì)胞CD3+、CD4+和CD4+/CD8+水平顯著低于非耐藥組，外周Th1、Th2水平顯著低于非耐藥組，Th17水平顯著高于非耐藥組，說(shuō)明肺結(jié)核患者存在明顯的免疫功能受損狀態(tài)，且耐多藥肺結(jié)核患者的免疫功能受損狀態(tài)更嚴(yán)重。接受抗結(jié)核治療3個(gè)月后，非耐藥組患者抗結(jié)核治療預(yù)后良好率顯著高于耐多藥組；復(fù)查外周血T淋巴細(xì)胞亞群水平發(fā)現(xiàn)，與治療前比較，非耐藥組患者治療后CD3+、CD4+和CD4+/CD8+水平及Th1、Th2水平均顯著升高，Th17水平顯著降低，而耐多藥組患者治療后CD3+、CD4+、CD4+/CD8+、Th1、Th2和Th17水平與治療前相似，與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致，均顯示耐多藥肺結(jié)核患者治療效果不佳。且本研究進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，結(jié)核分枝桿菌的耐藥性可以影響肺結(jié)核患者體內(nèi)的免疫狀態(tài)，因此認(rèn)為，在接受抗結(jié)核治療時(shí)，機(jī)體對(duì)于結(jié)核分枝桿菌的清除是在免疫應(yīng)答的作用下完成的，對(duì)于結(jié)核病患者尤其是耐多藥肺結(jié)核患者免疫狀態(tài)的探究有助于更好地認(rèn)識(shí)耐多藥肺結(jié)核治療效果不佳的原因。

綜上所述，肺結(jié)核患者體內(nèi)存在明顯的免疫功能受損，檢測(cè)外周血T淋巴細(xì)胞亞群動(dòng)態(tài)變化將有利于耐多藥肺結(jié)核患者的臨床治療，更好地改善其預(yù)后。