鄧南星， 白 雪， 張志偉

(南華大學(xué)衡陽醫(yī)學(xué)院 1.人體形態(tài)實(shí)驗(yàn)中心，2.腫瘤研究所，湖南省衡陽市 421001)

腫瘤異質(zhì)性普遍存在細(xì)胞間，其通過與腫瘤微環(huán)境相互作用，促使腫瘤分化形成不同細(xì)胞亞型并發(fā)生轉(zhuǎn)移擴(kuò)散。因此，了解腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性對于腫瘤的診斷、明確腫瘤性質(zhì)以及針對性治療均有重要影響。傳統(tǒng)測序技術(shù)通過對腫瘤細(xì)胞進(jìn)行批量測序得到群體細(xì)胞的相關(guān)信息,反映的是細(xì)胞群的總體特征，不能特異性地了解腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性。單細(xì)胞測序技術(shù)通過單個細(xì)胞檢測腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性、鑒定稀有細(xì)胞、劃分細(xì)胞亞群、追蹤細(xì)胞譜系、定位突變基因、發(fā)現(xiàn)新的腫瘤生物標(biāo)記物等。本文將從測序技術(shù)的進(jìn)展、單細(xì)胞測序技術(shù)的方法及其在腫瘤中的應(yīng)用等3方面進(jìn)行綜述，并對其發(fā)展前景進(jìn)行展望。

1 測序技術(shù)的進(jìn)展

自20世紀(jì)70年代第一代測序技術(shù)(雙脫氧鏈終止法)問世以來，目前測序技術(shù)已經(jīng)發(fā)展到第四代(原位測序法)。原位測序法可用來驗(yàn)證已知的腫瘤分子生物標(biāo)記物從而實(shí)現(xiàn)組織異質(zhì)性的可視化，但原位測序法通常是通過對細(xì)胞群進(jìn)行測序從而得到該細(xì)胞群的相關(guān)平均差異信息。

從分子角度來看，細(xì)胞是人體生命活動的基本單位，是組織構(gòu)成成分。了解單個細(xì)胞的異質(zhì)性，可以更好地了解疾病發(fā)生發(fā)展規(guī)律。單細(xì)胞測序技術(shù)是在單個細(xì)胞水平，對全基因組、轉(zhuǎn)錄組和表觀遺傳學(xué)的測序，其廣泛應(yīng)用于癌癥、胚胎發(fā)育、輔助生殖、細(xì)胞分化、免疫機(jī)制、微生物等方向的研究，其在細(xì)胞亞型分類、鑒定稀有細(xì)胞、繪制細(xì)胞譜系等方面具有重要作用。

2 單細(xì)胞測序技術(shù)的步驟

2.1 單細(xì)胞分離

單細(xì)胞測序的第一步是將單個目標(biāo)細(xì)胞或細(xì)胞核從組織中分離出來。即通過機(jī)械破壞或化學(xué)酶解組織制成含有目標(biāo)細(xì)胞的細(xì)胞懸液，并保持細(xì)胞活力，然后在細(xì)胞懸液中將單個目的細(xì)胞分離出來，送到下游的分析中。單細(xì)胞分離要求最大程度上維持細(xì)胞的自然表達(dá)譜。目前廣泛應(yīng)用的單細(xì)胞分離方法有持(連)續(xù)稀釋法、顯微操作篩選法、激光捕獲顯微切割法、熒光激活流式細(xì)胞篩選法、微流控技術(shù)分離法[1]、Cell Search分離法[2]、MagSweeper分離法、CellCelector分離法以及Nanofilters分離法等九種(表1)[3]。

表1 不同單細(xì)胞分離方法的主要優(yōu)缺點(diǎn)及適用細(xì)胞的比較

2.2 單細(xì)胞核酸的擴(kuò)增

一般單細(xì)胞中RNA和DNA的含量極低(不足10 pg)，均不足以進(jìn)行單細(xì)胞測序。因此進(jìn)行單細(xì)胞測序前需要對目標(biāo)單細(xì)胞中的超微量遺傳物質(zhì)核酸進(jìn)行前期擴(kuò)增,從而大幅提高核酸含量以便滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)分析。依據(jù)核酸擴(kuò)增內(nèi)容不同主要分為單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增(whole-genome amplification,WGA)與單細(xì)胞全轉(zhuǎn)錄組擴(kuò)增(whole-transcriptome amplification,WTA),相較于WGA步驟,WTA主要多了逆轉(zhuǎn)錄過程[3]。

目前常見的WGA依據(jù)原理不同可分為以PCR反應(yīng)為基礎(chǔ)的熱循環(huán)擴(kuò)增法以及不以PCR為基礎(chǔ)的等溫反應(yīng)擴(kuò)增法。前者主要有相關(guān)引物延伸預(yù)擴(kuò)增PCR法、標(biāo)簽隨機(jī)引物PCR、簡并寡核苷酸引物PCR[4]等，后者主要有基于多次退火環(huán)狀循環(huán)的擴(kuò)增技術(shù)、多重替換擴(kuò)增技術(shù)等。WTA法是先將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后，后續(xù)步驟同WGA法[3]。

2.3 單細(xì)胞測序

單細(xì)胞測序近年來發(fā)展迅速,伴隨著單細(xì)胞分離技術(shù)、核酸擴(kuò)增方法及高通量測序技術(shù)的不斷進(jìn)步與完善，三者融合交叉逐步發(fā)展出多種單細(xì)胞測序方法。如單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序[3]、基于TN5轉(zhuǎn)座酶染色質(zhì)水平單細(xì)胞測序法[5]、單細(xì)胞全基因組文庫組合索引測序[6]、單細(xì)胞染色質(zhì)免疫共沉淀測序[7]等。單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序法細(xì)胞的RNA依次通過逆轉(zhuǎn)錄、核酸擴(kuò)增和高通量測序后對獲得的相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行后續(xù)生物信息學(xué)分析[3]。

目前單細(xì)胞測序技術(shù)繼續(xù)向著高質(zhì)量、高通量和低成本以及多性能的方向發(fā)展，逐漸在腫瘤診斷和臨床治療等研究領(lǐng)域發(fā)揮著越來越重要的作用。

3 單細(xì)胞測序技術(shù)在腫瘤中的應(yīng)用

腫瘤在致瘤因素作用下由正常細(xì)胞惡化增殖演化成為癌細(xì)胞，并在演變過程中不斷積累突變、逐漸分化出不同的遺傳譜系和亞群，從而形成了腫瘤內(nèi)的異質(zhì)性[8]。腫瘤存在的瘤內(nèi)異質(zhì)性與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)，也影響著患者的臨床診斷和治療，但傳統(tǒng)的測序方法對于研究腫瘤內(nèi)的異質(zhì)性存在諸多困難。

單細(xì)胞測序技術(shù)廣泛應(yīng)用于腫瘤研究中：如依托單細(xì)胞測序數(shù)據(jù)可以量化變異拷貝數(shù)從而揭示基因組多樣性；揭示腫瘤細(xì)胞的分子表型，構(gòu)建腫瘤進(jìn)化圖譜，繪制腫瘤系統(tǒng)發(fā)育樹等[9]，從而推斷出不同類型腫瘤細(xì)胞的進(jìn)化過程；可識別潛在的驅(qū)動基因，發(fā)現(xiàn)罕見的亞克隆群體，為制定分子靶向治療方案，預(yù)防化療耐藥和腫瘤復(fù)發(fā)具有重要意義[10]。單細(xì)胞測序技術(shù)推動基因組學(xué)研究，為研究腫瘤進(jìn)化結(jié)構(gòu)提供高分辨率視圖，使得在單細(xì)胞水平研究腫瘤發(fā)展的分子機(jī)制成為可能。

3.1 消化系統(tǒng)腫瘤

Wu等[11]對來自食管鱗狀細(xì)胞癌和食管腺癌患者的368個單細(xì)胞進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)這兩種類型的食管癌各自具有顯著的瘤內(nèi)異質(zhì)性和獨(dú)特的內(nèi)在特性。這種內(nèi)在特性主要體現(xiàn)在各自的微環(huán)境和不同的生物標(biāo)記物方面。并且兩種食管癌中其相關(guān)腫瘤信號通路WNT和NOTCH也有明顯不同。

Dai等[12]通過對1名結(jié)直腸癌患者的相關(guān)癌組織進(jìn)行單細(xì)胞RNA逆轉(zhuǎn)錄組測序研究后發(fā)現(xiàn)該患者癌組織標(biāo)本中的2 824個細(xì)胞可細(xì)分為5種不同的細(xì)胞類別，這5種細(xì)胞類型的數(shù)量差異并具有不同的功能。Wu等[13]通過對2例腺瘤性息肉的大腸癌患者進(jìn)行單細(xì)胞全外顯子組測序，闡述了大腸癌的分期變化過程和腫瘤內(nèi)異質(zhì)性。Roerink等[14]第一次在遺傳、表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄和功能水平上對來自結(jié)腸癌的多個單細(xì)胞來源的克隆進(jìn)行了系統(tǒng)的分析，全面描述了單個癌細(xì)胞中的體細(xì)胞突變。研究發(fā)現(xiàn)，癌細(xì)胞亞型是根據(jù)不同增殖與遷移能力的細(xì)胞亞群來區(qū)分，具有獨(dú)特增殖特征的導(dǎo)管細(xì)胞亞群與腫瘤浸潤性T細(xì)胞的失活狀態(tài)密切相關(guān)[15]。Zhang等[16]通過對56 440個胃癌及正常胃黏膜單細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄分析，構(gòu)建了胃黏膜單細(xì)胞圖譜，確定了可以通過HES6標(biāo)記的杯狀細(xì)胞識別早期腸化生。Andor等[17]通過對來自9個胃癌細(xì)胞系中數(shù)千個細(xì)胞的基因組和轉(zhuǎn)錄組的拷貝數(shù)變異進(jìn)行分析，揭示了胃癌的體外進(jìn)化規(guī)律，并在每個細(xì)胞系中均發(fā)現(xiàn)存在2～12個亞克隆，從而證實(shí)了胃癌細(xì)胞系中具有顯著的腫瘤內(nèi)異質(zhì)性。

Hou等[18]通過對肝細(xì)胞癌組織樣本的25個腫瘤單細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞三重組體測序，證實(shí)了單個肝癌細(xì)胞在基因組、DNA甲基組和轉(zhuǎn)錄組水平的異質(zhì)性。Duan等[19]構(gòu)建了不同形態(tài)學(xué)表型的HBV相關(guān)肝癌模型，通過對3例HBV相關(guān)肝癌患者的96個腫瘤細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞基因組測序，揭示了腫瘤異質(zhì)性與組織形態(tài)學(xué)之間的聯(lián)系。大部分的腫瘤是單克隆起源，而在這項(xiàng)研究中他們證明了一種多克隆腫瘤，即融合多結(jié)節(jié)形態(tài)的腫瘤。

3.2 肺癌

根據(jù)組織病理學(xué)分類，肺癌可分為非小細(xì)胞肺癌(鱗癌、腺癌和大細(xì)胞癌)和小細(xì)胞肺癌。小細(xì)胞肺癌發(fā)生轉(zhuǎn)移較早，其惡性程度最高。因接受治療的小細(xì)胞肺癌患者可以收集的腫瘤組織細(xì)胞較少，從而阻礙了對其基因組的相關(guān)研究。SU等[20]通過對48例小細(xì)胞肺癌患者的單個循環(huán)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞全基因組測序，推測出小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展過程并繪制了基因突變圖譜，并證實(shí)大多數(shù)突變都可以在CTC細(xì)胞中檢測到，同時發(fā)現(xiàn)存在明顯的DNA異質(zhì)性，而這種異質(zhì)性可能是由于等位基因缺失造成的。Sharma等[21]通過對5例非小細(xì)胞肺癌患者利用單細(xì)胞RNA測序結(jié)合多區(qū)批量測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)了一些新的亞克隆簇，這些亞克隆簇增殖速率差異存在顯著性，肺癌的異質(zhì)性在腫瘤間和腫瘤內(nèi)是不同的。

3.3 乳腺癌

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤，通常依據(jù)蛋白質(zhì)標(biāo)志物(雌激素受體ER、孕激素受體PR和人表皮生長因子受體HER2)的不同，將乳腺癌分為luminal A、luminal B、HGR2-enriched和三陰性乳腺癌等類型[22]。一直以來，乳腺癌的腫瘤異質(zhì)性是影響臨床診斷和治療效果的關(guān)鍵因素，因此全面了解乳腺癌的表型和分子多樣性對改善分子靶向治療、準(zhǔn)確判斷預(yù)后和提高患者生存質(zhì)量至關(guān)重要。Savas等[23]通過對乳腺癌患者分離的6 311個T細(xì)胞進(jìn)行了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在乳腺癌腫瘤組織中存在大量浸潤性淋巴細(xì)胞且這些淋巴細(xì)胞存在明顯的異質(zhì)性。Karaayvaz等[24]通過對6例原發(fā)性三陰性乳腺癌(TNBC)患者的1 500多個腫瘤細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序分析后發(fā)現(xiàn)TNBC的功能異質(zhì)性與癌基因組進(jìn)化存在密切關(guān)系。Wagner等[25]通過對乳腺癌癌組織處的外周血液、癌組織附近的淋巴結(jié)組織及相關(guān)正常組織進(jìn)行相關(guān)單細(xì)胞測序研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ER+/-乳腺癌患者相關(guān)組織中與PD-L1腫瘤相關(guān)的巨噬細(xì)胞和衰竭的T細(xì)胞大量表達(dá)。

3.4 宮頸癌

Yang等[26]通過對宮頸癌患者放療前后腫瘤組織的25個宮頸細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞全基因組測序并對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)放療前后腫瘤細(xì)胞的表型差異有顯著性。放療前的腫瘤細(xì)胞中至少包含2個亞群，即主要細(xì)胞亞群Ⅰ和次要細(xì)胞亞群Ⅱ。而經(jīng)過放療后，主要細(xì)胞亞群Ⅰ中的大部分細(xì)胞發(fā)生死亡，次要細(xì)胞亞群Ⅱ損傷較少而轉(zhuǎn)換為主要細(xì)胞亞群，同時NFKB1基因可以增強(qiáng)放射治療的敏感性[27]。

4 總結(jié)與展望

單細(xì)胞測序技術(shù)目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于發(fā)育生物學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤的各個研究領(lǐng)域，極大促進(jìn)了單細(xì)胞基因組學(xué)、表觀基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展。隨著單細(xì)胞測序技術(shù)的進(jìn)步與發(fā)展，人們檢測到的細(xì)胞參數(shù)、細(xì)胞類型和分子越來越多，特別在腫瘤研究領(lǐng)域，單細(xì)胞測序技術(shù)能有效地劃分細(xì)胞群體、鑒別稀有細(xì)胞，準(zhǔn)確描述腫瘤的進(jìn)化過程，同時為癌癥患者早期篩查和制定個性化臨床治療方案提供了理論依據(jù)。

單細(xì)胞測序技術(shù)及應(yīng)用存在一些不足，如目前單細(xì)胞測序技術(shù)在核苷酸擴(kuò)增步驟容易產(chǎn)生擴(kuò)增偏差，出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增；僅適用于懸浮細(xì)胞液不能有效分析細(xì)胞或組織的相關(guān)空間信息等。近年來單細(xì)胞測序技術(shù)一直在向著高效低成本、高通量和高質(zhì)量方向發(fā)展，隨著相關(guān)技術(shù)不斷改進(jìn)，可以預(yù)見未來單細(xì)胞測序技術(shù)會變得更加精細(xì)、更加廣泛適用于科研實(shí)驗(yàn)和臨床診斷工作中。