張璐 廖輝 王旭 朱夔妞 楊紅霞 唐雪龍

主動脈夾層發(fā)生時主動脈壁真假兩腔分離，起病急驟，患者可在短期內(nèi)并發(fā)休克而死亡。當前，越來越多的技術(shù)用于改善和治療主動脈夾層，但手術(shù)仍是主流治療方式。雖然約70%的主動脈夾層患者可通過手術(shù)獲得近期存活機會，但仍有不少患者在獲救前已發(fā)生猝死，且死于手術(shù)后遠期主動脈遠端動脈瘤的形成與破裂的患者高達26%，因此主動脈夾層發(fā)病機制與治療一直是心血管領(lǐng)域備受關(guān)注的難點[1]。苯磺酸氨氯地平片常被用于治療高血壓、冠心病，對于主動脈夾層的治療亦具有調(diào)控作用，但其對于主動脈夾層患者主動脈壁的影響尚不明確。以往研究已證實，主動脈夾層的病理特點是動脈硬化、黏多糖聚集、平滑肌細胞增殖和纖維膠原重構(gòu)，涉及多個信號分子通路相互作用[2]。絲裂原活化蛋白激酶/ 胞外信號調(diào)節(jié)激酶（mitogen-activated protein kinase/extracellular ignal-regulatedkinas，MAPK/ERK）信號通路近年來在惡性腫瘤領(lǐng)域研究廣泛，被證實與細胞增殖、分化、凋亡、轉(zhuǎn)移息息相關(guān)[3]。本研究探討苯磺酸氨氯地平通過調(diào)控MAPK/ERK 信號通路對主動脈夾層大鼠主動脈壁的修復(fù)作用，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 選擇8～10 周齡無特定病原體級SD 大鼠50 只，體重220～240（231.4±8.6）g，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司[動物許可證號：SCXK（京）2012-0001]。飼養(yǎng)于濕度50%～60%，溫度24～28 ℃的環(huán)境中，自由飲水，專室分籠飼養(yǎng)，隔日更換墊料，自由攝食。本研究經(jīng)動物倫理委員會批準（批準文號：HSYJ2019001）。

1.2 主要器材、試劑 組化筆（批號：GT1001）購于美國Gene tech 公司；二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱（MCO-15AC 型） 購于日本SANYO 公司；潔凈工作臺（SW-CJ-1FD 型）購于蘇州蘇凈安泰公司；顯微鏡（Ti-SR 型）購于日本尼康公司；渦旋混合器（TYXH-Ⅱ型）購于東莞天悅電子；移液槍購于北京Dragon公司；無水乙醇（批號：20191211 購于天津奧淇洛譜商貿(mào)有限公司，規(guī)格：500 mL/瓶）；雙氧水[豫衛(wèi)消證字2019 第0027 號] 購于洛陽紫光健康科技開發(fā)有限公司，規(guī)格：100 mL/瓶）；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）（批號：20180712，規(guī)格：500 mL/瓶）購于美國Hyclone 公司；基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloprotein，MMP）-2、MMP-6、金屬蛋白酶組織抑制因子（tissue inhibitor of metalloproteinases，TIMP）1、TIMP2 購于上海晶抗生物；羥乙基乙二胺（amino ethyl ethanol amine，AEEA）購于南京邦諾生物科技有限公司；苯磺酸氨氯地平片（國藥準字：H20083828，5 mg/片）購于山東鳳凰制藥股份有限公司。

1.3 動物分組與造模 采用隨機數(shù)字表法將50 只大鼠分為模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組和對照組。除對照組外的4 組均行主動脈夾層造模，采用AEEA 150 mg·kg-1·d-1灌胃，每日9∶00～12∶00進行，連續(xù)14 d[4]。主動脈組織學(xué)切片內(nèi)膜顯著增厚，中膜變薄并可見斷裂為造模成功。低劑量組、中劑量組、高劑量組在造模成功后分別給予0.04、0.08、0.16 mg·kg-1·d-1苯磺酸氨氯地平溶液灌胃，每日14∶00～15∶00 進行，連續(xù)30 d。對照組SD 大鼠于每日相同時間給予5 mL 的0.9%氯化鈉溶液灌胃處理。

1.4 胸主動脈標本留取與鏡下觀察 按每100 g 大鼠體重給予0.3 mL 的水合氯醛腹腔注射，將5 組大鼠麻醉，常規(guī)消毒皮膚后沿胸骨正中線剪開大鼠胸腔，顯露胸腔內(nèi)器官，沿心臟上方主動脈根部進行游離，顯露主動脈、主動脈降部和弓部至雙側(cè)髂動脈分叉處，取出心臟及胸腹主動脈，放置于等滲鹽水中，于顯微鏡下分離結(jié)締組織，保證留取的主動脈血管完整。觀察5 組大鼠胸主動脈HE 染色結(jié)果。

1.5 相關(guān)蛋白檢測 5 組大鼠應(yīng)用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠提取總蛋白，采用Western blot 法實施電泳，每泳道40 μg，半干法轉(zhuǎn)膜，以5.0%脫脂牛奶封閉，加入一抗孵育2 h，洗滌3 次，加入二抗孵育2 h，洗滌3 次顯影，以β-actin 為內(nèi)參統(tǒng)計MAPK/ERK 信號通路相關(guān)蛋白包括：大鼠肉瘤（rat sarcoma，Ras）、快速加速纖維肉瘤（rapidly accelerated fibrosarcoma，Raf）、MAPK、ERK1/2、MMP-2、MMP-6、TIMP1、TIMP2 表達水平，比較各組上述蛋白水平。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，多組間比較以單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗；計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 5 組大鼠胸主動脈HE 染色結(jié)果 對照組胸主動脈內(nèi)膜、中膜、外層結(jié)構(gòu)正常；模型組血管壁撕裂，出現(xiàn)雙桶狀的主動脈；低劑量組、中劑量組、高劑量組可見不同程度血管壁撕裂，但主動脈血管壁撕裂程度依次降低。見圖1。

2.2 5 組大鼠Ras、Raf、MAPK、ERK1/2 蛋白表達水平比較 5 組大鼠Ras、Raf、MAPK、ERK1/2 蛋白表達水平比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）。低劑量組、中劑量組、高劑量組、模型組上述指標水平均高于對照組，低劑量組、中劑量組、模型組上述指標水平均高于高劑量組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見表1。5 組大鼠Ras、Raf、MAPK、ERK1/2蛋白電泳圖見圖2。

2.3 5 組大鼠MMP-2、MMP-6、TIMP1、TIMP2 蛋白表達水平比較 5 組大鼠MMP-2、MMP-6、TIMP1、TIMP2 蛋白表達水平比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）。低劑量組、中劑量組、高劑量組、模型組MMP-2、MMP-6 蛋白表達水平均高于對照組，TIMP1、TIMP2 蛋白表達水平均低于對照組，模型組、低劑量組、中劑量組MMP-2、MMP-6 蛋白水平均高于高劑量組，TIMP1、TIMP2 蛋白水平均低于高劑量組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見表2。5組大鼠MMP-2、MMP-6、TIMP1、TIMP2 蛋白電泳圖見圖3。

3 討論

主動脈夾層是指主動脈內(nèi)膜破裂形成破口，血液進入薄弱主動脈中膜，正常動脈壁分離誘發(fā)的血流動力學(xué)障礙類疾病，發(fā)病率約為1/10 萬～1/20 萬[5]。雖然主動脈夾層較為少見，但危險度較高，致殘致死風(fēng)險較大，因此認清主動脈夾層的發(fā)病機制，對防治主動脈夾層意義重大。成功建立主動脈夾層模型是進行主動脈夾層實驗研究的基礎(chǔ)。早期主動脈夾層模型采用犬等動物，但因動物體型較大、費用較高、操作難度大等原因應(yīng)用受限，現(xiàn)常選取小型動物進行試驗。血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)法造模已被證實成功有效，但涉及微量泵埋植，操作難度及費用增加[6]。本研究采用AEEA 灌胃處理造模，成功率較高，致死率較低，模型癥狀也較明顯。

本研究5 組大鼠行HE 染色發(fā)現(xiàn)，對照組見胸主動脈內(nèi)膜、中膜、外層結(jié)構(gòu)正常；而模型組可見血管壁撕裂，出現(xiàn)雙桶狀的主動脈；低劑量組、中劑量組、高劑量組見不同程度血管壁撕裂，但依次降低，說明經(jīng)不同劑量苯磺酸氨氯地平處理后血管壁異常得到改善，提示苯磺酸氨氯地平可修復(fù)主動脈夾層大鼠主動脈壁，且在一定濃度范圍內(nèi)劑量越高，修復(fù)效果越佳。苯磺酸氨氯地平是第三代鈣離子阻滯劑的代表藥物，可通過氨基側(cè)鏈與帶負電細胞膜結(jié)合，發(fā)揮長效鈣離子阻滯效應(yīng)，從而產(chǎn)生24 h 內(nèi)平穩(wěn)控制血壓效果。

圖1 5 組大鼠大鼠胸主動脈鏡下觀察所見（a：對照組；b：模型組；c：低劑量組；d：中劑量組；E：高劑量組，HE 染色，×400）

表1 5 組大鼠Ras、Raf、MAPK、ERK1/2 蛋白表達水平比較

圖2 5 組大鼠Ras、Raf、MAPK、ERK1/2 蛋白表達的電泳圖

血管平滑肌細胞是主動脈中膜主要構(gòu)成成分[7]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，血管平滑肌細胞的增殖與遷移、細胞外基質(zhì)穩(wěn)態(tài)失衡與主動脈夾層形成有關(guān)，而MAPK/ERK 信號通路可調(diào)控血管平滑肌細胞生物學(xué)行為、細胞外基質(zhì)穩(wěn)態(tài)[8]。Ras、Raf、MAPK、ERK1/2、MMP-2、MMP-6、TIMP1、TIMP2 為MAPK/ERK 信號通路上下游重要分子，其中Ras 是受體酪氨酸激酶介導(dǎo)信號通路一種關(guān)鍵分子，連接上下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，具有開關(guān)作用[9-10]；Raf 是Ras 下游分子，可激活Ras-Raf-MEK-ERK 通路[11]。在晚期糖基化終末產(chǎn)物試驗中發(fā)現(xiàn)，ERK1/2 參與人主動脈血管平滑肌細胞的增殖[12]。

本研究結(jié)果顯示，模型組Ras、Raf、MAPK、ERK1/2、MMP-2、MMP-6 蛋白水平均高于對照組，TIMP1、TIMP2 蛋白水平低于對照組，提示MAPK/ERK信號通路參與了主動脈夾層發(fā)病，可能與動脈壁異常病理變化有關(guān)。且低劑量組、中劑量組、高劑量組Ras、Raf、MAPK、ERK1/2、MMP-2、MMP-6 蛋白水平依次降低，TIMP1、TIMP2 蛋白水平依次升高，提示苯磺酸氨氯地平可調(diào)控MAPK/ERK 信號通路表達，且其調(diào)控作用具有劑量依賴性，這可能是其發(fā)揮動脈壁修復(fù)效果的作用機制之一，亦提示MAPK/ERK信號通路可能為主動脈夾層的治療提供一個新靶點，而TIMP1、TIMP2 激活劑可能為主動脈夾層的治療提供一個新思路。

表2 5 組大鼠MMP-2、MMP-6、TIMP1、TIMP2 蛋白表達水平比較

圖3 5 組大鼠MMP-2、MMP-6、TIMP1、TIMP2 蛋白表達的電泳圖

細胞外基質(zhì)可為血管壁細胞正確行使功能及血管壁完整性提供結(jié)構(gòu)框架，研究發(fā)現(xiàn)其不僅保證了血管壁彈性，亦可通過與血管壁細胞相互作用，為細胞傳遞調(diào)控信號如分化、增殖、遷移等，從而調(diào)控血管平滑肌細胞形態(tài)、血管壁對生長因子反映能力[13-14]。MMP 是分解細胞外基質(zhì)蛋白酶的總稱，其中MMP-2、MMP-6 為MMP 家族成員，主要作用除降解細胞外基質(zhì)外，還可作用于非基質(zhì)蛋白質(zhì)，參與信號傳導(dǎo)[15]。而TIMP1、TIMP2 為MMP 抑制因子，與MMP 具有相反生理功能[16-17]。動物學(xué)實驗表明，用球囊對血管內(nèi)膜剝脫后，MMP-2、MMP-6 表達水平可升高，呈現(xiàn)出一致性變化規(guī)律，本研究觀點存在與其相似之處[18]。球囊導(dǎo)管損傷血管內(nèi)皮家兔試驗證實，MMP-2、MMP-6 的表達時程與血管平滑肌遷移相一致，佐證了MMP-2、MMP-6 均參與血管損傷后的重建過程，提示應(yīng)用TIMP1、TIMP2 激活劑調(diào)控MMP-2、MMP-6 可能有利于防治主動脈夾層[19]。值得注意的是，低劑量組、中劑量組、高劑量組MAPK/ERK 信號通路相關(guān)指標雖得到明顯改善，但與對照組相比，各觀察指標差異仍具有統(tǒng)計學(xué)意義，說明單一依賴苯磺酸氨氯地平對動脈壁修復(fù)作用有限，可能需聯(lián)合其他干預(yù)方案，詳細配伍干預(yù)方法有待后續(xù)深入探討。

綜上所述，MAPK/ERK 信號通路參與AEEA 誘導(dǎo)主動脈夾層的形成過程，苯磺酸氨氯地平可通過調(diào)控MAPK/ERK 信號通路發(fā)揮主動脈壁修復(fù)作用，且其作用在一定范圍內(nèi)具有劑量依賴性，可能為主動脈夾層的治療提供一個新思路。