胡中華 , 姜建友 , 顧永華 , 李義生 , 唐小玲

(河南金丹乳酸科技股份有限公司 ， 河南 鄲城 477150)

在淀粉制糖發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸過(guò)程中，發(fā)酵繆固液分離的難易程度是衡量發(fā)酵產(chǎn)能的一項(xiàng)重要指標(biāo)，發(fā)酵固形物菌渣的處理和再利用是實(shí)現(xiàn)清潔生產(chǎn)的關(guān)鍵。L-乳酸能廣泛應(yīng)用于飼料、食品、化工、新材料等諸多產(chǎn)業(yè)領(lǐng)域，以L-乳酸為單體合成的聚乳酸(PLLA)可替代石油原料制成的塑料制品，被認(rèn)為是當(dāng)前最有前途的生物可降解高分子材料[1]。目前L-乳酸工業(yè)化發(fā)酵工藝已經(jīng)較為成熟，但進(jìn)一步提高純度和降低能耗仍是L-乳酸工業(yè)生產(chǎn)企業(yè)面臨的重要課題[2]。

通過(guò)在線近紅外光譜(NIR)非接觸式的方法來(lái)采集發(fā)酵罐中乳酸發(fā)酵液樣品和測(cè)量數(shù)據(jù)，實(shí)時(shí)對(duì)發(fā)酵過(guò)程中的葡萄糖含量、氨氮含量、OD值、鈣含量、乳酸含量、純度等進(jìn)行監(jiān)測(cè)、反饋及控制，替代傳統(tǒng)人工取樣和檢測(cè)化檢，可顯著提高效率和數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性，為發(fā)酵過(guò)程調(diào)控提供及時(shí)的、準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)支持[3]。乳酸發(fā)酵過(guò)程，大型發(fā)酵罐采用套接菌種、發(fā)酵過(guò)程補(bǔ)加高濃度淀粉糖水等方式，實(shí)現(xiàn)了400 t發(fā)酵罐成熟發(fā)酵醪發(fā)酵周期30 h，L-乳酸光學(xué)純度最高達(dá)到99.8%，發(fā)酵繆固液易分離提取，發(fā)酵液固形物干重4.92 g/(100 mL)。初步實(shí)現(xiàn)L-乳酸發(fā)酵短周期，高光純，高產(chǎn)能，為L(zhǎng)-乳酸生產(chǎn)企業(yè)提高產(chǎn)品質(zhì)量和效益提供借鑒。

1 材料和方法

1.1 菌種

凝結(jié)芽孢桿菌JD-DFT011，河南金丹乳酸菌種研究室分離和保藏。

1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：乳酸細(xì)菌不同糖濃度改良培養(yǎng)基MRS。發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米淀粉糖水(糖濃度220～230 g/L)，適量營(yíng)養(yǎng)鹽，自然pH值。

1.3 培養(yǎng)方法

種子培養(yǎng)：115 ℃高壓滅菌15 min，接入乳酸菌種，溫度(45±1)℃，100 r/min搖瓶振蕩培養(yǎng)12 h，再用搖瓶無(wú)菌條件下套接2次。發(fā)酵培養(yǎng)：裝入發(fā)酵罐容積60%的發(fā)酵培養(yǎng)基，0.1 MPa蒸汽滅菌20 min。接入適量菌種，溫度(50±1)℃，攪拌轉(zhuǎn)速75 r/min發(fā)酵培養(yǎng)。

1.4 分析方法

發(fā)酵殘總糖和殘還原糖 (費(fèi)林試劑熱滴定法)、發(fā)酵液中葡萄糖(生物傳感分析儀)、光學(xué)純度和發(fā)酵液中L-乳酸含量(高壓液相色譜法)、OD值(發(fā)酵液分光光度計(jì)600 nm波長(zhǎng)處的吸光值)、淀粉糖水干物質(zhì)(阿貝折光儀)、pH值(酸度計(jì))，干重(不含水時(shí)的質(zhì)量)。

2 結(jié)果與討論

2.1 近紅外光譜儀的監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)模型在L-乳酸發(fā)酵工業(yè)的應(yīng)用

近紅外模型的創(chuàng)建是實(shí)現(xiàn)在線近紅外分析的前提和基礎(chǔ)，近紅外模型的效果好壞直接決定在線近紅外分析儀能否準(zhǔn)確檢測(cè)。評(píng)價(jià)近紅外模型效果的兩個(gè)重要參數(shù)是RMSE(預(yù)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)偏差)和R2(決定系數(shù))。RMSE越小，表明近紅外模型的檢測(cè)準(zhǔn)確度越高，檢測(cè)誤差越小。R2越大，表明近紅外模型區(qū)分Y值高低大小的能力越強(qiáng)。同時(shí)R2也取決于Y值的變化范圍，若Y值變化范圍較小，R2可能相對(duì)應(yīng)的較小，但近紅外模型的預(yù)測(cè)性能依然很好。此外，模型的因子數(shù)(Factor)影響模型預(yù)測(cè)的穩(wěn)定性，即預(yù)測(cè)的重復(fù)性，因子數(shù)應(yīng)該在一定范圍內(nèi)(≤10)，因子數(shù)越大，模型的穩(wěn)定性越差。

以在線檢測(cè)采集的近紅外光譜為X(自變量)，以取樣測(cè)量樣品數(shù)量近紅外儀器分析的參考值為Y變量(因變量)見(jiàn)表1，采用PLS(偏最小二乘法)，選取950～1 650 nm近紅外區(qū)段，SG(1階求導(dǎo))+SNV光譜預(yù)處理，創(chuàng)建乳酸發(fā)酵液中菌體濃度(OD)、鈣含量、乳酸含量、葡萄糖、氨氮的近紅外模型曲線(見(jiàn)圖1)。

表1 發(fā)酵樣品數(shù)量值Y與在線近紅外光譜儀測(cè)量值的相關(guān)性

圖1 發(fā)酵液樣品原始光譜圖

由圖1可知，近紅外光譜儀監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)能替代實(shí)驗(yàn)室測(cè)量數(shù)據(jù)，只需要定期對(duì)近紅外光譜儀數(shù)值進(jìn)行校準(zhǔn)。近紅外光譜儀的全面推廣，不僅節(jié)省人力物耗，還能減少取樣頻次，對(duì)乳酸發(fā)酵調(diào)控便捷快速。

2.2 乳酸發(fā)酵過(guò)程套接菌種對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響

L-乳酸發(fā)酵過(guò)程中，接種方式主要有兩大類：①傳統(tǒng)方式采用種子工作站制備的菌種直接添加進(jìn)發(fā)酵罐成熟發(fā)酵。②發(fā)酵罐套接，既以單獨(dú)的發(fā)酵罐為菌種周轉(zhuǎn)罐，菌種在周轉(zhuǎn)罐生長(zhǎng)到一定時(shí)期，大接種量的轉(zhuǎn)接到另一發(fā)酵罐進(jìn)行乳酸成熟發(fā)酵。由于菌種站制備的菌種罐體積較小，菌種富集培養(yǎng)，一般轉(zhuǎn)接大型發(fā)酵罐時(shí)，正常400 t發(fā)酵罐按10%～15%接種量接種，菌種種齡在8～10 h。試驗(yàn)400 t發(fā)酵罐乳酸發(fā)酵正常轉(zhuǎn)接菌種，與發(fā)酵罐之間套接25%～30%接種量的發(fā)酵各項(xiàng)指標(biāo)對(duì)比，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 乳酸菌種套接工藝與非套接工藝各項(xiàng)指標(biāo)差異

由表2可知，套接采用較大的接種量可以縮短發(fā)酵周期，發(fā)酵罐周轉(zhuǎn)快，發(fā)酵產(chǎn)能顯著提升，相比較少接種量的轉(zhuǎn)接菌種，發(fā)酵罐菌種套接各項(xiàng)指標(biāo)運(yùn)行穩(wěn)定。同時(shí)較少的接種量相對(duì)會(huì)延長(zhǎng)發(fā)酵周期，并且增加發(fā)酵培養(yǎng)基染雜菌的幾率，從而會(huì)降低發(fā)酵料L-乳酸純度。

乳酸發(fā)酵過(guò)程中，發(fā)酵結(jié)束后的成熟料液(發(fā)酵醪)的分離難易，是影響產(chǎn)量的一項(xiàng)重要指標(biāo)。 生產(chǎn)過(guò)程中采用板框過(guò)濾的方式過(guò)濾發(fā)酵醪，比較兩種接種方式對(duì)發(fā)酵繆濾速、酸值及收率的影響，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 套接工藝與非套接工藝100批次發(fā)酵繆關(guān)鍵指標(biāo)均值

由表3可知，乳酸發(fā)酵過(guò)程采用套接菌種的方式，發(fā)酵醪的過(guò)濾速度、酸值和收率均有明顯提升。這主要原因是菌種經(jīng)過(guò)大罐進(jìn)一步馴養(yǎng)，菌種對(duì)大罐發(fā)酵的微生態(tài)環(huán)境更適應(yīng)，更能耐受高濃度底物發(fā)酵，因此，套結(jié)工藝更有利于乳酸工業(yè)化大生產(chǎn)[4]。

2.3 乳酸發(fā)酵過(guò)程套接菌種工藝優(yōu)化

淀粉質(zhì)原料發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸過(guò)程中，采用發(fā)酵罐菌種套接的方式接種，對(duì)發(fā)酵效果有著明顯的提升[5]。對(duì)比試驗(yàn)400 t發(fā)酵罐套接菌種量在25%～30%時(shí)的發(fā)酵效果，400 t發(fā)酵罐裝入發(fā)酵罐容積60%的發(fā)酵培養(yǎng)基，控制發(fā)酵初始糖液的干物質(zhì)210～220 g/L，在發(fā)酵穩(wěn)定期(約18 h)，從淀粉制糖工段自動(dòng)化補(bǔ)加濃度250～260 g/L淀粉糖水40 t，進(jìn)行L-乳酸發(fā)酵成熟，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 400 t發(fā)酵罐套接菌種工藝發(fā)酵結(jié)果

由表4可知，400 t發(fā)酵罐套接菌種量28%時(shí)，L-乳酸光學(xué)純度和收率達(dá)到最高，分別是99.8%和98.57%，發(fā)酵周期和發(fā)酵殘?zhí)蔷^低。繼續(xù)增大接種量，L-乳酸光學(xué)純度一定程度略降，同時(shí)發(fā)酵繆黏稠度略增加。實(shí)際生產(chǎn)中，選擇L-乳酸光學(xué)純度盡可能大，發(fā)酵繆更好過(guò)濾為發(fā)酵最佳指標(biāo)范圍，L-乳酸發(fā)酵套接菌種選擇28%接種量最佳。

3 結(jié)論

在淀粉制糖發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸工業(yè)化過(guò)程中，淀粉制糖工藝自動(dòng)化控制及發(fā)酵過(guò)程近紅外儀器在線全程監(jiān)測(cè)，對(duì)發(fā)酵溶液進(jìn)行原位測(cè)量，可極大地提升乳酸發(fā)酵生產(chǎn)工藝以及技術(shù)裝備水平。L-乳酸發(fā)酵采用發(fā)酵罐大接種量套接，發(fā)酵穩(wěn)定期補(bǔ)加高濃度淀粉糖液，即縮短發(fā)酵周期，又提高發(fā)酵酸值。發(fā)酵固形物主成分為菌渣，可廣泛應(yīng)用于飼料行業(yè)。乳酸工業(yè)化智能高效綠色生產(chǎn)是未來(lái)的大趨勢(shì)，可為聚L-乳酸的工業(yè)化生產(chǎn)夯實(shí)基礎(chǔ)。